多肽PA21及含多肽PA21的教槽料
技术领域
本发明涉及多肽技术和饲料领域,尤其涉及多肽PA21及含多肽PA21的教槽料。
背景技术
长期以来,仔猪肠道问题是影响我国养猪业发展和养殖效益的关键问题。肠道不仅是营养物质消化吸收的重要器官,同时也是动物体最大的免疫器官。国内养猪业面临的哺乳和断奶仔猪发病率和死亡率高的问题,很大程度上都是仔猪肠道功能受损导致的。大剂量使用抗生素作为预防和治疗仔猪肠道问题的主要手段,虽然能够取得比较理想的效果,但是抗生素长期大量的使用引起的畜产品药物残留和有害菌耐药不断增强已成为威胁人类安全的重大隐患。此外,抗生素虽然能够通过抑制有害菌增殖改善肠道健康,但是并没有从根本上改善仔猪肠道功能。仔猪肠上皮细胞是肠道功能的主要执行者,其占仔猪小肠粘膜细胞的90%以上,由位于隐窝的干细胞分裂增殖产生,然后沿隐窝-绒毛轴向绒毛顶端迁移,最终凋亡排入肠腔,从而完成整个生命周期。肠上皮细胞向绒毛顶端迁移的过程也是其分化成熟完成生理功能的过程,上皮细胞更新是否正常直接影响肠道功能。然而,断奶应激和疾病等因素能够干扰仔猪肠道上皮细胞的正常更新,从而影响肠道功能和健康。仔猪肠道上皮细胞的增殖、分化和迁移等更新过程严重依赖于其所处环境的氧化还原势。研究表明改善肠上皮细胞的氧化还原能力能够显著促进其增殖和分化的顺利进行。因此,在抑制肠道有害细菌增殖的同时改善肠上皮细胞的抗氧化能力才能更好地改善仔猪肠道健康。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的具有抗氧化和抗菌双重作用的多肽PA21。
本发明的另一目的在于提供一种含多肽PA21的教槽料。
多肽PA21,所述的多肽PA21为人工设计合成的活性多肽,具有抗氧化和抗菌双重功能,包含17个氨基酸残基,分子量为2096.55 Da,等电点为9.39,其氨基酸序列为Lys LeuPro Gln Met Trp Lys Gln Ile Ala Cys Arg Leu Tyr Asn Thr Cys。
所述的含多肽PA21的教槽料由以下重量份数的原料组成:膨化玉米22-30份,玉米15-25份,碎米5-10份,乳清粉8-12份,豆油1-3份,膨化大豆8-15份,43%豆粕10-15 份,鱼粉2-5份,血浆蛋白粉2-5份,石粉0.3-0.7份,磷酸氢钙0.7-1.2份,赖氨酸0.05-0.3份,苏氨酸0.05-0.3份,多肽PA21 0.04-0.3份,50%氯化胆碱0.04-0.08份,氧化锌0.15-0.3份,丙酸钙0.04-0.06份,乙氧基喹啉0.03-0.06份,复合维生素0.4-0.7份,复合矿物质0.2-0.6份。
其中,43%豆粕是指豆粕中蛋白质的质量百分比含量为43%。
所述的含多肽PA21的教槽料优选由以下重量份数的原料组成:膨化玉米27份,玉米20.7份,碎米8份,乳清粉10份,豆油2份,膨化大豆10份,43%豆粕12份,鱼粉4份,血浆蛋白粉3份,石粉0.5份,磷酸氢钙1份,赖氨酸0.15份,苏氨酸0.1份,多肽PA210.1份,50%氯化胆碱0.05份,氧化锌0.3份,丙酸钙0.05份,乙氧基喹啉0.05份,复合维生素0.5份,复合矿物质0.5份。
其中,所述的复合维生素由以下重量份数的原料组成:维生素A 3-6份,维生素D28-35份,维生素E 14-18份,维生素K 0.4-0.8份,维生素B1 0.5-1份,维生素B2 1.5-2份,维生素B6 0.6-1.5份,维生素B12 0.8-1.6份,烟酸10-20份,D-泛酸钙3-8份,生物素0.3-0.7份,沸石粉补足至1000份。
所述的复合矿物质由以下重量份数的原料组成:五水硫酸铜80-120份,硫酸亚铁50-80份,一水硫酸锌15-30份,硫酸锰,20-45份,亚硒酸钠(含硒 1%)2-5份,碘酸钙(含碘1%) 8-12份,沸石粉补足至1000份。
所述的多肽PA21以膨化玉米为载体,纯多肽PA21的重量百分比含量为10%。
所述的含多肽PA21的教槽料应用于14日龄~断奶后14天的仔猪。
本发明具有如下优点:
1、本发明中的多肽PA21具有抗氧化和抗菌的双重作用,同时具有分子量小、人工合成方便且成本低和细胞毒性低等优点。
2、所述的教槽料能够显著改善仔猪肠道健康和肠道形态结构,从而改善仔猪的生长性能。
附图说明
图1是本发明中多肽PA21的细胞毒性实验图;
图2是本发明中含多肽PA21的教槽料对断奶仔猪腹泻率的影响图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述,而非以任何形式对本发明进行限制。
实施例1:多肽PA21的制备
多肽PA21的化学合成方法:根据发明内容中所述氨基酸序列,用全自动多肽合成仪(ABI433)合成PA21全序列,并通过HPLC反相柱层析脱盐纯化;
纯化的多肽PA21分子量采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定,等电点使用等电聚焦电泳测定,氨基酸序列采用自动氨基酸序列测定仪进行解析。
多肽PA21含有17个氨基酸残基,分子量为2096.55 Da,等电点为9.39,其氨基酸序列为Lys Leu Pro Gln Met Trp Lys Gln Ile Ala Cys Arg Leu Tyr Asn Thr Cys。
实施例2:多肽PA21的抑菌实验
通过测定多肽PA21最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)来反映其抗菌效果,最小抑菌浓度为检测不到细菌生长的最低样品浓度。采用二倍稀释法,具体方法如下:受试细菌(如表一)接种于LB固体培养基上,然后于37℃培养箱中倒置培养。待菌落长出后,用一次性接种环挑取各受试细菌单菌落至LB液体培养基中,37℃培养箱中震荡培养至对数生长期。紫外分光光度计上检测菌液OD600,根据1 OD600 = 1×109 CFU/mL将受试菌菌液用液体LB培养基稀释至2×105 CFU/mL。然后在无菌96孔板各孔中加入100μLLB液体培养基,然后在A1孔中加入100μL稀释到多肽PA21样品(多肽样品加入前用0.22μm微孔滤膜过滤除菌),混匀后取100μL加入A2孔,A2孔混匀后再取100μL加入A3孔,依次倍比稀释,最后从A12 孔吸出100μL弃去,至此多肽PA21二倍浓度梯度样制成。向预先加入多肽PA21的各孔中加入已稀释好的菌液100μL混匀,于37℃缓慢震荡培养16h,然后测定600nm处吸光值。结果计算:取检测不到细菌生长的孔和与之相邻的有细菌生长的孔中多肽PA21浓度之和的平均值作为多肽PA21最小抑菌浓度。测试结果如表1所示。从表中可以看出多肽PA21对大肠杆菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌均有非常强的杀伤作用。
表1 多肽PA21对各菌的最小抑菌浓度表
受试菌种 |
PA21 MIC(ug/mL) |
大肠杆菌 |
17.52 |
沙门氏菌 |
9.83 |
枯草芽孢杆菌 |
9.83 |
注:1)PA21 MIC:多肽PA21的最小抑菌浓度
2)所述结果为5次独立重复实验结果的平均值。
实施例3:多肽PA21体外抗氧化作用
通过检测多肽PA21的自由基清除能力和还原能力来反映其抗氧化能力。通过ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)法体外检测多肽PA21的自由基清除能力,此法的原理是ABTS在一定的氧化剂(高硫酸钾等)作用下生产绿色的ABTS+,而抗氧化剂会抵制ABTS+的产生,通过分光光度计检测吸光度的变化即可计算出样品的自由基清除能力。本试验使用购自碧云天总抗氧化能力检测试剂盒(S0119)进行检测。还原能力则通过检测还原Fe3+的能力反应,具体的检测过程如下:通过将多肽PA21溶液与2.5mL0.2M磷酸盐缓冲液(PBS, pH=6.6)及2.5mL 1% K3Fe(CN)6混合均匀后,50℃孵育20分钟,然后加入2.5mL 10% 三氯乙酸混匀后,于离心机中3000转/分钟离心10分钟,取上清2.5mL加入2.5mL蒸馏水及0.5 mL 0.1% FeCl3溶液,然后通过分光光度计于700nm检测吸光值即可反应多肽PA21的还原能力。本试验使用抗氧化剂丁基羟基茴香醚(BHA)作为阳性对照。从表2可以看出,多肽PA21具有很强的自由基清除能力和还原能力。
表2 多肽PA21的抗氧化值表
项目 |
BHA |
PA21 |
自由基清除能力(%) |
74.6 |
78.1 |
还原能力(吸光值) |
0.24 |
0.18 |
注:1)BHA:丁基羟基茴香醚(阳性对照)
2)所述结果为5次独立重复实验结果的平均值。
实施例4:多肽PA21的细胞毒性实验
将猪小肠上皮细胞IPEC-1培养于含有5%太牛血清、200 U/mL双抗(青霉素和链霉素各100 U/mL),5 ug/L 表皮生长因子(EGF)的HAM’S/F12培养基中培养至对数期,用磷酸盐缓冲液(HyClone)清洗三遍后,加入0.25%的胰蛋白酶消化至单个细胞,加入HAM’S/F12培养基后400 g离心4分钟,弃上清后用新鲜的HAM’S/F12培养基悬浮细胞,调整至细胞密度为1×106个/mL,然后往96孔细胞培养板每孔中加入200 uL,待细胞贴壁后加入不同浓度多肽PA21,置于二氧化碳培养箱(37℃、5% CO2)培养24小时后,每孔中加入20 uL CCK-8(碧云天)CCK-8溶液,继续培养2小时,然后用酶标仪检测450 nm波长的吸光值。检测结果如图1(其中PA21-200为200 ug/mL多肽PA21;PA21-100为100 ug/mL多肽PA21; PBS:磷酸盐缓冲液为对照组,所述实验结果为5次独立实验结果的平均值)所示,从图中可以看出,虽然多肽PA21细胞毒作用随着其添加浓度而增加,但是PA21的细胞毒作用很小。即使在200 ug/mL的浓度下,多肽PA21对猪小肠上皮细胞IPEC-1也存在很低(小于10%)的细胞毒副作用。
实施例5:一种含多肽PA21的教槽料,主要由以下重量份数的原料组成:
膨化玉米30份,玉米15.2份,碎米10份,乳清粉8份,豆油1份,膨化大豆15份,43%豆粕10份,鱼粉5份,血浆蛋白粉2份,石粉0.7份,磷酸氢钙1.2份,赖氨酸0.3份,苏氨酸0.3份,多肽PA210.04份,50%氯化胆碱0.04份,氧化锌0.15份,丙酸钙0.04份,乙氧基喹啉0.03份,复合维生素0.7份,复合矿物质0.3份。
所述复合维生素组成为维生素A 3份,维生素D 28份,维生素E 14份,维生素K 0.4份,维生素B1 0.5份,维生素B2 1.5份,维生素B6 0.6份,维生素B12 0.8份,烟酸10份,D-泛酸钙3份,生物素0.3份,沸石粉937.9份。
所述复合矿物质组成为五水硫酸铜120份,硫酸亚铁80份,一水硫酸锌30份,硫酸锰45份,亚硒酸钠(含硒 1%)5份,碘酸钙(含碘1%)12份,沸石粉708份。
所述的多肽PA21以膨化玉米为载体,纯多肽PA21的重量百分比含量为10%。
实施例6:一种含多肽PA21的教槽料,主要由以下重量份数的原料组成:
膨化玉米22份,玉米25份,碎米5份,乳清粉12份,豆油3份,膨化大豆8份,43%豆粕15份,鱼粉2份,血浆蛋白粉5份,石粉0.3份,磷酸氢钙0.7份,赖氨酸0.1份,苏氨酸0.1份,多肽PA210.3份,50%氯化胆碱0.08份,氧化锌0.3份,丙酸钙0.06份,乙氧基喹啉0.06份,复合维生素0.4份,复合矿物质0.6份。
所述复合维生素组成为维生素A 6份,维生素D 35份,维生素E 18份,维生素K 0.8份,维生素B1 1份,维生素B2 2份,维生素B6 1.5份,维生素B12 1.6份,烟酸20份,D-泛酸钙8份,生物素0.7份,沸石粉905.4份。
所述复合矿物质组成为五水硫酸铜80份,硫酸亚铁50份,一水硫酸锌15份,硫酸锰20份,亚硒酸钠(含硒 1%)2份,碘酸钙(含碘1%)8份,沸石粉825份。
所述的多肽PA21以膨化玉米为载体,纯多肽PA21的重量百分比含量为10%。
实施例7:含多肽PA21的教槽料对仔猪生长性能、肠道健康和抗氧化能力的影响
选取24日龄断奶仔猪240头,采用单因子试验设计,按体重和性别随机分到3个处理组:对照组,PA21-50组(饲喂含多肽50mg/kg多肽PA21),PA21-100组。对照组饲喂常规市场销售教槽料,PA21-50组饲喂含50mg/kg(有效成分)多肽PA21的教槽料(表3),PA21-100组饲喂含100mg/kg(有效成分)多肽PA21的教槽料(表3)。每组8个重复,每个重复10头猪,试验期14天。含多肽PA21的教槽料对断奶仔猪生产性能、腹泻率、肠道形态结构和抗氧化能力的影响见图2及表4-6。从表4的试验结果可以看出含多肽PA21的教槽料可显著提高断奶仔猪日增重和采食量、降低料重比。从图2的试验结果可以看出含多肽PA21的教槽料能够显著降低断奶仔猪腹泻率。从表5的试验结果可以看出含多肽PA21的教槽料能够显著提高断奶仔猪空肠和回肠绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度的比值。从表6可以看出含多肽PA21的教槽料可以显著提高仔猪十二指肠、空肠和回肠的总抗氧化能力,降低十二指肠、空肠和回肠氧化损伤(丙二醛是反应组织氧化损伤程度的指标,总抗氧化能力和丙二醛的检测使用购自南京建成生物工程研究所的试剂盒(A015和A003-1)根据试剂盒所述步骤完成)。
表3含多肽PA21的教槽料组成表
原料 |
PA21-50组 |
PA21-100组 |
膨化玉米 |
27份 |
27份 |
玉米 |
20.75份 |
20.7份 |
碎米 |
8份 |
8份 |
乳清粉 |
10份 |
10份 |
豆油 |
2份 |
2份 |
膨化大豆 |
10份 |
10份 |
43%豆粕 |
12份 |
12份 |
鱼粉 |
4份 |
4份 |
血浆蛋白粉 |
3份 |
3份 |
石粉 |
0.5份 |
0.5份 |
磷酸氢钙 |
1份 |
1份 |
赖氨酸 |
0.15份 |
0.15份 |
苏氨酸 |
0.1份 |
0.1份 |
多肽PA21 |
0.05份 |
0.1份 |
50%氯化胆碱 |
0.05份 |
0.05份 |
氧化锌 |
0.3份 |
0.3份 |
丙酸钙 |
0.05份 |
0.05份 |
乙氧基喹啉 |
0.05份 |
0.05份 |
复合维生素 |
0.5份 |
0.5份 |
复合矿物质 |
0.5份 |
0.5份 |
所述的多肽PA21以膨化玉米为载体,纯多肽PA21的重量百分比含量为10%。
表4 含多肽PA21的教槽料对断奶仔猪生长性能的影响
项目 |
对照组 |
PA21-50组 |
PA21-100组 |
日增重(g/d) |
283.3 |
310.9 |
328.5 |
日采食量(g/d) |
359.8 |
370.0 |
377.8 |
料重比 |
1.27 |
1.19 |
1.15 |
表5 含多肽PA21的教槽料对断奶仔猪肠道形态结构的影响
项目 |
对照组 |
PA21-50组 |
PA21-100组 |
空肠 |
|
|
|
绒毛高度(μm) |
376.4 |
427.3 |
453.8 |
隐窝深度(μm) |
301.1 |
294.7 |
275.0 |
绒毛高度/隐窝深度 |
1.25 |
1.45 |
1.65 |
回肠 |
|
|
|
绒毛高度(μm) |
241.2 |
268.9 |
294.7 |
隐窝深度(μm) |
178.7 |
193.4 |
196.4 |
绒毛高度/隐窝深度 |
1.35 |
1.39 |
2.5 |
表6 含多肽PA21的教槽料对断奶仔猪肠道抗氧化能力的影响
项目 |
对照组 |
PA21-50组 |
PA21-100组 |
总抗氧化能力 |
|
|
|
十二指肠(U/g蛋白) |
431.59 |
483.27 |
546.38 |
空肠(U/g蛋白) |
342.06 |
374.32 |
487.57 |
回肠(U/g蛋白) |
305.63 |
359.07 |
486.51 |
丙二醛 |
|
|
|
十二指肠(nmol/g蛋白) |
87.67 |
73.76 |
69.88 |
空肠(nmol/g蛋白) |
86.42 |
75.90 |
65.73 |
回肠(nmol/g蛋白) |
87.24 |
76.75 |
67.69 |
<110> 漳州傲农牧业科技有限公司
<120> 多肽PA21及含多肽PA21的教槽料
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> Protein
<213> 人工序列
<400> 1
Lys Leu Pro Gln Met Trp Lys Gln Ile Ala Cys Arg Leu Tyr Asn 15
Thr Cys 17