CN105660694B - 一种细菌性果斑病种子杀菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物种传病害的杀菌及控制领域，具体涉及到西瓜细菌性果斑病的杀菌及防治。本方法公开了一种新型的复合杀菌剂，包括主要起杀菌作用的二氧化氯(ClO2)，主要起促进萌发作用的次氯酸钠(NaClO)，和主要起稳定剂作用的碘酸钾(KIO3)三种成分组成。采用本发明的杀菌剂对已检测出带细菌性果斑病菌的西瓜种子及人工模拟带细菌性果斑病菌的西瓜种子进行处理后，不仅促进了种子的萌发率和发芽势，而且杀菌效果显著，显著优于已报道的现有果斑病杀菌药剂及杀菌方法。本发明的杀菌方法可以简单、快速、彻底地杀死西瓜种子携带的果斑病菌，操作简单，无毒无污染，具有巨大的实际应用价值。

Description

一种细菌性果斑病种子杀菌剂及其应用

技术领域

本发明属于植物种传病害的杀菌及控制领域，具体涉及细菌性果斑病感染的西瓜及甜瓜的杀菌与防治。

技术背景

西甜瓜是我国重要的经济作物，根据中华人民共和国农业部2012年统计，我国西甜瓜种植面积超200万hm²，总产量为6818万吨，而联合国粮农组织数据库(FAOSTAT)统计数据2012年我国西甜瓜种植面积占世界西瓜总面积的59％以上，产量占68.1％。中国作为西甜瓜种植生产的世界第一大国，西甜瓜的病害问题十分严重。根据中国农科院植保所近年的统计，西瓜上主要的细菌性病害有细菌性果斑病、角斑病、缘枯病、叶枯病等，特别是细菌性果斑病，作为一种典型的种传病害，蔓延迅速，严重威胁了西瓜甜瓜的生产及制种业发展。

西瓜细菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon，BFB)是由燕麦噬酸菌西瓜亚种(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli，Aac)引起的一种致死型细菌病害，主要造成西瓜、甜瓜、南瓜等葫芦科作物的毁灭性后果。自1989年起BFB在美国首次报道以后，在美国曾有2次大规模性爆发，造成了几千公顷的西瓜大面积的损坏。我国于上世纪90年代初见诸报道，初始该病仅在西甜瓜主要制种区新疆和甘肃省有报道，但从2003年后BFB在我国迅速蔓延，并在广西、海南、内蒙古、北京、山东、吉林、福建等多省份都有发生。BFB的爆发不仅造成了大面积西瓜和甜瓜减产甚至绝收，而且发生了多起种子企业和农户的纠纷案件，给西甜瓜产业带来了不利影响。2000年7月中国农业科学院植物保护研究所和北京市农林科学院调查了内蒙古巴彦淖尔市哈密瓜田，果斑病发病面积1.13万hm2，病株率超90％，损失高达二千多万元人民币。2002年11月至2003年1月，海南三亚、陵水、英州和文昌等地因该病损失嫁接苗1000万株。近10年来，多家大型跨国种业公司一直在我国设有西甜瓜的繁种和育种基地，由于果斑病的发生和危害，致使很多国际公司陆续撤出中国，直接影响新疆、甘肃等制种基地的健康和可持续发展。因此，有效稳定的果斑病控制手段，对我国西甜瓜制种和产地的健康发展有着重要的实际意义。

由于西瓜细菌性果斑病在我国发病面积逐年升高，我国在2006年和2007年将西瓜细菌性果斑病分别定为全国农业植物检疫性病害和进境植物检疫性病害，对西瓜种子的检疫和消毒有了明确规定。政府严禁销售携带有BFB的种子，对于企业销售的原种需开具相关植物检疫合格证明。而在实际生产中发生果斑病的情况下，由种子销售企业对BFB造成的经济损失进行全权赔偿。尽管国家出台了严格的法律规定，2007年后仍然发生了多起由BFB引起的重大赔偿案件。2009年10月海南省2个嫁接苗场因该病损失近500万株苗。2010年1月，山东省昌乐县尧沟、临朐等地发现果斑病的嫁接苗达500万株，都让企业造成了百万级的经济损失。西瓜细菌性果斑病是一种典型的种传病害，主要通过种子进行病原的携带和传播。造成赔偿案的原因都是企业未进行种子的检疫和消毒或对种子的杀菌和消毒不彻底。由于BFB种子传播的特性，国内外对其主要的控制策略是对致病源头-种子进行彻底消灭，即对生产的原种进行彻底消毒。

传统对果斑病杀菌的方法主要包括两大类，第一大类是物理方法，主要包括高温和辐照处理，高温处理通过大型烘干设备3-5天85℃处理杀死细菌，其作用原理主要是热传导，由于热传导效率问题，种子堆的中间层种子很难被彻底杀菌，提高温度虽能增强杀菌效果，但温度过高又会造成种子发芽率下降，所以高温处理法并没有大范围使用；辐照法也可用于杀菌，但辐照对种子发芽率也有很大的不利作用，要达到完全杀菌辐照的剂量很大，种子的发芽率只有六十多，远低于国标90％；另一大类是化学方法，包括农药、化学试剂和自制试剂。张静(2012)用市面销售的63种农药试剂对含有BFB的种子处理后发现，并没有一种对于BFB的特效试剂，仅有恩诺沙星可完全杀灭细菌，但对种子的发芽率也造成了很大的不利影响。由于市面销售的农药都不是对BFB专门设计开发的，其杀菌效果有限也在预料之中。纯化学试剂的研究由来已久，Hopkins等(1997)发现用1％Ca(C1O)2和1％HCl浸泡处理带病种子15min可降低种子的发病率，但未提及是否可彻底杀死病原菌。Hopkins等(2003)发现用1.6mg/ml过氧乙酸和1％HCl处理30min可完全杀死细菌，但需要在清水完全冲洗并在40℃下完全烘干，才能保证对种子的发芽率和活力没有显著影响。赵延昌等(2003)也发现用3％HCl处理15min可完全杀死细菌。别之龙等(2012)证明0.4％HCHO浸种1h可以完全杀灭果斑病菌并且不影响种子的后续嫁接和生产。尽管以上方法在原实验报道中均安全有效，但均在后人的文献中遭到质疑和否定，实验结论多有矛盾。由于不同西瓜品种种壳硬度和种子耐受度不同，在实际使用过程中，HCl、HCHO和过氧乙酸等强烈杀菌化合物并不能长时间浸泡从而彻底杀菌。带菌种子浸泡时间过短，浸泡后反复的冲洗等做法导致果斑病的杀菌效果不理想。浸泡时间的不足也可能是造成不同文章结果不统一的重要原因之一。张学军等人(2011)首次报道了自制新型的果斑病消毒试剂西亚1号，文章报道称与传统3％HCl、Tsunami 100和过氧乙酸等酸性物质相比,其对种子表面影响较小并且防治效果最好，西亚一号是很有实用价值的种子消毒剂。鉴于西亚一号未公布其配方和专利申请号，我们对西亚一号的实际应用效果完全未知。董春玲等(2015)也开发了一种自制试剂，但是由于其配方含有有毒且易爆的化学物噻唑，所以其自制试剂并不能支持大量种子消毒处理。

发明内容

本发明克服现有方法中的上述缺陷，考虑影响种子的发芽率或不能彻底杀灭病菌的问题，提出了一种杀灭种子中细菌性果斑病菌的杀菌剂和杀菌方法。本发明的杀菌方法简单稳定，能彻底杀灭西瓜种子中的细菌性果斑病菌，使其在现有的果斑病检测体系中检测不出来，成为可贮藏或销售的健康种子，并保证处理过的种子在栽培中果斑病的发病率低于国标的限制范围。

本发明提出了一种杀菌剂，所述杀菌剂包括：(10-30)ug/L二氧化氯ClO2，占总杀菌剂质量百分比为(0.01％-0.1％)的次氯酸钠NaClO，和占总杀菌剂质量百分比为(0.01％-0.1％)的碘酸钾KIO3

所述杀菌剂最适浓度为：(以每升体积的杀菌剂计)10ug/L二氧化氯(ClO2)，浓度百分比分别为0.01％次氯酸钠(NaClO)和浓度百分比为0.01％的碘酸钾(KIO3)。

本发明的杀菌剂由二氧化氯(ClO2)主效主要起杀菌作用，次氯酸钠(NaClO)主要起促进萌发作用，碘酸钾(KIO3)主要起稳定剂作用三个成分复配而成，复配后为白色液体，长期低温避光保存可正常使用，低温保存一星期以内皆可有效使用。

本发明还提出了一种种子的杀菌方法，所述方法包括：

将新鲜种子用本发明的杀菌剂浸泡5-6h后取出，干燥后即为安全健康种子；其中，每500g种子用1000ml杀菌剂，或超过1000ml的杀菌剂)。

所述种子的杀菌方法用于专门杀灭种子中的细菌性果斑病菌。

所述方法还可以省略浸泡后用水洗的步骤。

所述种子主要为葫芦科作物的种子；包括西瓜种子、甜瓜种子、葫芦种子、南瓜种子；使用最适浓度进行实验的所述种子为西瓜种子。

所述干燥的方法包括直接风干、晒干或者用机器烘干。

本发明还提出了将所述杀菌剂用于种子杀菌及种子果斑病的防治上，对大田生产的种子及商品种子采用本方法处理后，可完全杀死果斑病菌，并对种子的萌发率起到促进作用，为实际生产葫芦科种子的防治起到重要的作用。

本发明进一步提出了将所述的杀菌剂用于杀灭种子细菌性果斑病菌的应用。

其中，所述种子为葫芦科作物的种子。

其中，所述种子为西瓜种子、甜瓜种子、葫芦种子或南瓜种子。

本发明所述杀菌剂的成份中：二氧化氯ClO2是国际公认的安全、无毒可食用级杀菌剂，本发明是首次将其应用于葫芦科作物的果斑病的杀菌上。鉴于二氧化氯的不稳定性，我们查阅了大量文献并结合了相关实验研究，最终确定了碘酸钾作为其稳定剂，其中，加入碘酸钾使杀菌剂的稳定时间延长至2周以上，并进一步保证了二氧化氯的安全稳定性。最后，我们对比了种子的萌发率发现，微量的次氯酸钠即可显著增加种子的萌发率，最终选择了次氯酸钠作为我们种子主要的促萌发成分。

本发明通过大量的理论指导和实验结果相结合，通过参考杀菌效果的好坏和种子萌发率的高低提出了一种简单有效的杀菌剂及杀菌方法，所述杀菌剂在不影响种子萌发率的条件下能彻底杀灭细菌性果斑病菌。与现有的果斑病菌杀菌方法相比，本方面的有益之处在于：使用本发明的杀菌剂浸泡后，(1)促进了种子的萌发势，使种子的萌发更加快速整齐；(2)杀菌效果更彻底，相比常用的化学试剂和农药，其杀菌和防治综合效果最佳，用不同的杀菌剂对同一批带有果斑病的带菌种子处理后，本发明的杀菌剂杀菌后，发病植株最少，接近零；(3)相比其它化学试剂和农药，几种组成成分对实验操作人员无安全隐患，实验试剂无环境污染；(4)由于试剂对种子无害，所以浸泡后无需反复冲洗，实验步骤更加简化高效。

附图说明

图1为不同药剂处理对带菌种子发芽率及发芽势的影响；其中，1-8分别为：1、CK1健康种子；2、CK2带菌种子；3、加瑞农；4、自制试剂；5、加收米；6.新植霉素；7、4％盐酸；8、4％甲醛。

图2为不同药剂处理对带菌种子根长在24h和48h的影响；其中，1-8分别为：1、CK1健康种子；2、CK2带菌种子；3、加瑞农；4、自制试剂；5、加收米；6、新植霉素；7、4％盐酸；8、4％甲醛。

图3为不同药剂处理对带菌种子脱氢酶的影响；其中，1-10分别为：1、CK2带菌种子；2、自制试剂；3、1％甲醛；4、4％甲醛；5、1％盐酸；6、4％盐酸；7、加收米；8、加瑞农；9、呻秦霉素；10、90％新植霉素。

图4为不同药剂处理对带菌种子防治效果的影响；其中，1-8分别为：1、CK1健康种子；2、CK2带菌种子；3、加瑞农；4、自制试剂；5、加收米；6、新植霉素；7、4％盐酸；8、4％甲醛。

具体实施方式

材料与方法

本发明参考了近年来文献中较为常见的农药和化学试剂作为对比，并参考文献中的使用剂量和浸泡时间。对比的农药包括加瑞农、加收米、申嗪霉素、和新植霉素4种，化学试剂包括4％HCl和4％HCHO两种。种子经不同药剂浸泡后，除本发明的杀菌剂(自制药剂)未进行反复冲洗外，其余药剂都进行了反复冲洗，然后对所有处理组进行统一晾干。具体实验药剂的来源及处理时间、处理浓度见表1：

表1不同药剂产品来源及处理时间与浓度

本发明新型杀菌剂的配置：

配置1L的新型复合杀菌剂，含10ug/L二氧化氯(ClO2)，0.01％次氯酸钠(NaClO)和0.01％碘酸钾(KIO3)。本发明杀菌剂配置后为白色液体。

实施例1：不同药剂处理对带菌种子发芽率及发芽势的影响

(1)不同药剂的处理过程：

a)4％甲醛、4％盐酸的处理过程为：先将带菌种子CK2在化学试剂中浸泡20min后，反复冲洗(冲洗3-5分钟)，再在无菌水中浸泡5h40min。

b)自制试剂和现有农药的处理过程为：将带菌种子CK2在本发明的杀菌剂(自制药剂)、现有农药及无菌水(空白对照组)中浸泡6h后，简单冲洗(冲洗30秒-1分钟)后统一晾干；

c)无菌水(空白对照组)的处理过程为：将健康种子CK1和带菌种子CK2分别在无菌水中浸泡6h后，简单冲洗(冲洗30秒-1分钟)后统一晾干；

上述a)、b)、c)三组中每组处理100粒种子，平行测定三次。

(2)记录和拍照

将晾干后的种子整齐排列置于规格为90mm*90mm培养皿的滤纸上，加入适量纯水后浸湿滤纸，加盖，放入28℃恒温培养箱中培养72小时。。

实施结果

步骤(3)中，每隔12h补水一次，每隔24h统计拍照一次，根据每天的出芽个数统计每天出芽率，以2天出芽率均值统计发芽势，以第三天总共出芽个数占总数比确定发芽率，用游标卡尺测量记录5天种子根长，进行统计性分析并标注显著性差异，如图1-2、表2所示。

表2不同药剂处理对带菌种子发芽率及发芽势的影响

图1所示为不同药剂处理两天后种子的萌发情况，其中第4幅图为本发明的杀菌剂(自制试剂)处理的结果。在72小时恒温箱培养后，除第5幅图的药剂加收米(一种农药)外，经本发明的杀菌剂处理后的种子发芽个数最多，萌发出的根长最长，具有显著的促萌发作用；虽然加收米在种子促萌发方面优于本发明的杀菌剂，但结合后面的杀菌效果实验对比可知，加收米处理后的种子仍大量带菌，发病率很高。

图2显示不同药剂处理24小时和48小时后，种子的萌发情况，第4幅图为本发明的杀菌剂(自制试剂)处理的结果。图中表明本发明的杀菌剂处理的种子萌发最快，即，本发明的杀菌剂有显著的促进种子萌发的效果。

上述图1、图2与表2结果一致，除加收米外，本发明的杀菌剂(自制试剂)对种子的发芽率和发芽势有最佳的促进作用，可以显著加快种子的萌发，使种子整齐、快速；虽然加收米在促萌发效果方面优于本发明的杀菌剂，但是结合后面杀菌效果实验对比可知，本发明的杀菌剂杀菌效果远优于加收米，处理后的实验室种植无发病苗，因此，本发明的杀菌剂可作为非常优秀的果斑病杀菌剂。

实施例2：不同药剂处理对种子活力的影响(脱氢酶)

种子活力的测定方法主要通过TTC法：氧化态的无色的氯化三苯基四氮唑(TTC)，经过染色接受了有活力种子呼吸过程脱氢酶所产生的氢，而变成还原态的红色三苯基甲月替(TTF)。因此，染色后其红色越深，说明种子脱氢酶的活性越高，则种子活力越强。

(1)不同药剂的处理：

参照实施例1的方法对健康种子CK1和带菌种子CK2进行不同药剂处理，获得不同药剂处理后的种子。其中，1％甲醛、1％盐酸的处理过程与4％甲醛、4％盐酸的处理过程相同。

(2)种子脱氢酶处理过程：

取不同药剂处理后的种子各30粒，剥去种皮和种壳，露出白色的种胚，倒入试管中。加入1％TTC(无色的氯化三苯基四氮唑)溶液10ml完全浸没，在36℃黑暗的恒温箱中染色3小时。

实施结果

步骤(2)中，3h后统计拍照，比较不同处理后种子染色的深浅情况。

如图3所示，图3中的第2行全为本发明的杀菌剂(自制试剂)处理的种子，与其他药剂相比，本发明的杀菌剂处理的种子染色最深(原图为深红色)，明显强于其他药剂处理的种子，充分说明了本发明的杀菌剂处理后种子的活性最高，有很强的种子活力。该结果与图1和图2结果相一致，本发明的杀菌剂对种子的活力有很大的促进作用。

实施例3：不同药剂处理对种子成苗率及防治效果的影响

(1)不同药剂的处理：

参照实施例1的方法对健康种子CK1和带菌种子CK2进行不同药剂处理，获得不同药剂处理后的种子。

(2)温室种植检测种子发病率的防治效果：

每个处理取30粒种子，每4粒种子种在同一小花盆的四角上，每个处理种6个小盆。种子种植后正常培养2周，待出苗后2周调查子叶发病率，重复3次，计算防治效果。

实施结果：

统计不同处理后种子的出苗率和发病株数，计算种子处理后发病率的防治效果，结果如图4、表3所示。

种子处理后发病率的防治效果(％)＝[1－(处理子叶发病率/空白对照子叶发病率)]×100％

表3不同药剂处理对带菌种子防治效果的影响

图4中所示，第4幅图为本发明的杀菌剂的处理结果(同期进行了大田和实验室种植)。相比于其他药剂，本发明的杀菌剂处理后，在实验室状态下成苗率最高，发病率为零，大田同期种植的健康苗也最多，发病率最低(图中有叶片有轻微发病，图转换后不太清晰，特此说明)。而其他药剂处理后，成苗率低于本发明的杀菌剂，发病率也高于本发明的杀菌剂，叶片发病严重。综上，本发明的杀菌剂(自制试剂)对细菌性果斑病的防治能力比现有药剂有显著提高。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (8)

1.一种杀菌剂，其特征在于，所述杀菌剂包括：(10-30)ug/L二氧化氯ClO2，占总杀菌剂质量百分比为0.01％-0.1％的次氯酸钠NaClO，和占总杀菌剂质量百分比为0.01％-0.1％的碘酸钾KIO3；其中，所述杀菌剂杀灭的菌为种子中的细菌性果斑病菌。

2.如权利要求1所述的杀菌剂，其特征在于，所述杀菌剂包括：10ug/L二氧化氯ClO2，浓度百分比分别为0.01％次氯酸钠NaClO和0.01％碘酸钾KIO3。

3.一种种子的杀菌方法，其特征在于，所述方法包括：将所述种子用如权利要求1所述的杀菌剂浸泡5-6h后取出，干燥后即为安全健康种子。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，每500g种子用至少1000ml杀菌剂浸泡。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述杀菌是指杀灭种子中的细菌性果斑病菌。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述干燥包括直接风干或者用机器烘干。

7.将权利要求1所述的杀菌剂用于杀灭种子细菌性果斑病菌的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述种子为葫芦科作物的种子，包括西瓜种子、甜瓜种子、葫芦种子或南瓜种子。