CN105660637B - 防治当归早薹的药物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治当归早薹的药物，本发明通过反转录双链DNA扩增片段长度多态性分析技术研究早薹当归和正常当归在基因转录水平的差异，研究结果表明早薹当归中促进多胺类植物生长调节剂合成的基因表达活性显著升高，多胺类植物生长调节剂可能促进当归早薹的发生。本发明利用当归多胺类植物生长调节剂合成抑制剂(α‑二氟甲基鸟氨酸)防治当归早薹。实验结果表明：采用α‑二氟甲基鸟氨酸，可以有效的防治当归早薹，两次施药，高剂量的α‑二氟甲基鸟氨酸抑制当归早薹50％以上。α‑二氟甲基鸟氨酸可制备成绿色环保、高效、低毒的防治当归早薹的农药，可提高当归产量和品质，具有重要的环境保护意义和经济价值，值得推广和应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物及其参与形成的复方药物，具体涉及防治当归早薹的药物及其应用。
背景技术
当归早薹影响当归的产量和品质，当归早薹与其它同类植物发生早薹的生理基础是一致的，即低温通过春化阶段、长日照、激素以及自主途径促进发育，进而抽薹开花，目前防治当归早薹还没有切实可行的方法。进一步深入研究当归早薹发展进程与环境条件的关系，研究其内部营养物质和激素的生理生化变化规律，阐明当归早薹发生的分子调控机制，是解决当归早薹问题切实可行的方法。
cDNA-AFLP是从AFLP衍生而来的RNA指纹识别技术，现已发展成较为成熟的转录组研究技术，运用该技术可从转录水平鉴定mRNA差异，从而阐明基因调控在RNA水平的表现，可对生物体转录组进行全面、系统的分析。当转录产物高度表达时，扩增条带的强度高低甚至能直接反应出基因表达量的差别，并且获得的转录衍生片段(tnarscript-derivedfragments,TDFs)一般也集中在蛋白的编码区或者附近，可最大限度的提供基因编码区的信息。cDNA-AFLP自身的优点使其成为最有效的分离差异表达基因的方法之一。利用cDNA-AFLP可以方便的将不同的生理发育阶段或不同组织的差异表达基因分离出来。
本专利通过以上技术研究早薹当归和正常当归在基因表达水平的差异，揭示当归早薹的分子机制，对研究结果的进一步分析发现当归早薹性状和多胺类植物生长调节剂的合成相关，因此本专利选择相关的抑制剂抑制多胺类植物生长调节剂的合成以达到防治当归早薹的目的。
发明内容
发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，通过当归早薹的分子机制的实验研究发现多胺类植物生长调节剂对当归早薹的发生具有重要作用，通过抑制多胺类植物生长调节剂合成可达到防治当归早薹的目的，在此基础上本发明提供一种当归多胺类植物生长调节剂合成的抑制剂。
技术方案：
为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为，一种防治当归早薹的药物，它为当归多胺类植物生长调节剂合成的抑制剂。
作为优选方案，以上所述的防治当归早薹的药物，它为S-腺苷甲硫氨酸合成酶的抑制剂。
作为优选方案，以上所述的防治当归早薹的药物，所述的抑制剂为α-二氟甲基鸟氨酸。α-二氟甲基鸟氨酸在制备防治当归早薹农药制剂中的应用。
一种防治当归早薹的农药制剂，它由α-二氟甲基鸟氨酸和助剂制成乳油、悬浮剂、粉剂、粒剂、水剂农业制剂。
cDNA-AFLP是研究样本之间基因表达差异的有效方法，本发明采用cDNA-AFLP技术研究早薹当归在基因表达水平和正常当归的差异，通过大量实验研究当归早薹的分子机制，构建当归早薹的分子调控网络，并在此基础提出抑制针对影响当归多胺类植物生长调节剂合成的早薹防治途径。
抑制当归早薹药物筛选：
1.RNA的提取与鉴定
采集早薹当归和正常当归的样品立刻在液氮中冷冻，后置于-80℃冷冻保存。采用Trizol(Invitrogen公司产品)分离当归样品总RNA，用DEPC水溶解，然后用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
2.反转录双链cDNA的合成
以所提取总RNA中的mRNA为模板，按照Promega Universal Riboclone cDNASynthesis System试剂盒(C4360)提供的方法合成双链cDNA，最后溶于DEPC水中。
3.cDNA-AFLP方法的建立
(1)酶切反应
合成的双链cDNA用EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ(上海生工生物工程技术服务有限公司)双酶切，37℃过夜，65℃2h。
(2)连接反应
酶切产物在连接酶的催化下和接头4℃过夜。EcoR I接头：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’，5’-AATTGGTAGCAGTC-3’；MseI接头：5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’，5’-TACTCAGGACTCAT-3’。反应体系：酶切产物5μL，Buffer1μL，MseⅠ接头(50μΜ)0.5μL，Ecor Ⅰ接头(5μM)0.5μL，加ddH2O至总体积10μL。
(3)连接产物预扩增
EcoR Ⅰ预扩增引物E00：5’-GACTGCGTACCAATTC-3’；Mse Ⅰ预扩增引物M00：5’-GATGAGTCCTGAGT-3’。预扩增条件：94℃变性3min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min(26个循环)；72℃延伸5min。
(4)预扩增产物选择性扩增
选择性扩增设立模板浓度梯度、酶离子浓度梯度、dNTP浓度梯度。扩增结果电泳检测，优化选择性扩增反应体系。EcoR Ⅰ选择性扩增引物：5’-GACTGCGTACCAATTCNN-3’(N代表ATCG中任意一种)；Mse Ⅰ选择性扩增引物5’-GATGAGTCCTGAGTNN-3’(N代表ATCG中任意一种)。选择性扩增条件：94℃变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s(每次循环下降0.7℃)，72℃延伸1min(13个循环)；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min(24个循环)；72℃延伸5min。
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
按照优化的反应条件进行选择项扩增，选择性扩增引物，选择性扩增产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳结果硝酸银染色。
5.差异表达片段的分离和再扩增
(1)差异表达片段的分离
染色后的聚丙烯酰胺凝胶比较早薹和正常当归基因表达差异，割取表达活性差异明显、分子量较大的片段。50μL ddH2O溶解，95℃加热15min，4℃过夜，-20℃冷冻保存。
(2)差异表达片段的PCR扩增
2μL差异表达片段溶解液作为反应模板再次通过PCR反应对差异表达基因进行富集。扩增引物和选择性扩增引物一致。反应条件94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min(30个循环)；72℃延伸5min。扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。将电泳条带从琼脂糖凝胶上割取，Takara割胶纯化试剂盒对割取的凝胶进行分离纯化。
6.割胶纯化产物的克隆和测序
(1)连接反应
(2)感受态细胞的制备
(3)连接产物的转化
热激法将连接产物转化入E.coli DH 5α感受态细胞。
(4)重组质粒的筛选与鉴定
①重组质粒的筛选
取200μL已转化的感受态细胞悬液涂布于含有75μg/mLAMP的LB平板，待液体被完全吸收后，37℃倒置培养16-18h，挑取克隆。
②重组质粒的提取
③重组质粒的PCR鉴定
用PCR方法鉴定所提质粒是否含有外源目的片段。
7.测序
送上海生物工程技术服务公司用通用引物测序，序列在NCBI上进行同源性分析。
8.测序结果：研究结果表明和多胺类植物生长调节剂合成相关的关键酶S-腺苷甲硫氨酸合成酶在早薹当归中表达显著升高，表明植物多胺类生长调节剂可能促进当归早薹的发生。因此，本发明选用多胺类生长调节剂合成的抑制剂来防治当归早薹，并取得较好的防治效果。
有益效果：本发明和现有技术相比具有以下优点：
本发明通过cDNA-AFLP技术研究早薹当归和正常当归在基因表达和激素合成水平的差异，研究当归早薹的分子机制，通过对结果的进一步分析，筛选出和当归早薹性状相关的多胺类植物生长调节剂，并优选出抑制多胺类植物生长调节剂的合成以达到防治当归早薹的方案。该方案具有靶点明确的优势。实验结果表明：采用S-腺苷甲硫氨酸合成酶抑制剂α-二氟甲基鸟氨酸，可以有效的防治当归早薹，α-二氟甲基鸟氨酸可制备成绿色环保、高效、低毒的防治当归早薹的农药，可提高当归产量和品质，具有重要的环境保护意义和经济价值，值得推广和应用。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1当归早薹的大田防治试验
1、防治方案
防治药物：选用S-腺苷甲硫氨酸合成酶抑制剂α-二氟甲基鸟氨酸，α-二氟甲基鸟氨酸与防徒长药物顶天立地联合使用。
α-二氟甲基鸟氨酸剂量：3个剂量组(高：120g/亩；中：60g/亩；低：30g/亩)，每组占地0.2亩(当归苗约1000株)。α-二氟甲基鸟氨酸与防徒长药物顶天立地(水溶性腐殖酸5％，氮磷钾含量20％，微量元素含量6％)联合用药(α-二氟甲基鸟氨酸中剂量：60g/亩；顶天立地剂量，参照说明书半剂量使用)
施药方法：
(1)α-二氟甲基鸟氨酸，当归移栽后早花前(5月上旬)，施药1次。
(2)α-二氟甲基鸟氨酸，当归移栽后早花前(5月上旬)，15天后再次施药，共2次。
(3)α-二氟甲基鸟氨酸与防徒长药物顶天立地联合用药，当归移栽后早花前(5月上旬)，15天后再次施药，共2次。
2、试验结果
施药一次，高、中、低剂量的α-二氟甲基鸟氨酸对当归早薹的抑制率分别为24.7％、7.4％、10.3％。
施药两次，高、中、低剂量的α-二氟甲基鸟氨酸对当归早薹的抑制率分别为51.9％、31.0％、23.4％。
α-二氟甲基鸟氨酸与防徒长药物顶天立地联合用药施药两次对当归早薹的抑制率为41.3％
以上实验结果表明，α-二氟甲基鸟氨酸显示出了非常好的防治当归早薹的效果，本发明通过大量实验优选得到的S-腺苷甲硫氨酸合成酶抑制剂α-二氟甲基鸟氨酸，可以用于制备绿色环保、高效、低毒的防治当归早薹的农药，可提高当归产量和品质，具有重要的环境保护意义和经济价值，值得推广和应用。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京中医药大学
<120> 防治当归早薹的药物及其应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctcgtagact gcgtacc 17
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aattggtagc agtc 14
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gacgatgagt cctgag 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
TACTCAGGACTCAT
tactcaggac tcat 14
Claims (2)
1.α-二氟甲基鸟氨酸在制备防治当归早薹农药制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的α-二氟甲基鸟氨酸在制备防治当归早薹农药制剂中的应用，其特征在于，它由α-二氟甲基鸟氨酸和助剂制成乳油、悬浮剂、粉剂、粒剂、水剂农业制剂或者含有α-二氟甲基鸟氨酸的复方农药制剂。
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