CN105658050A - 用于制备具有可分选精子的动物的遗传技术 - Google Patents

Abstract

具有经标记以指示X和/或Y染色体的精子的家畜。产生仅一个性别的后代的雄性家畜。具有标志物的精子。

Description

用于制备具有可分选精子的动物的遗传技术

对相关申请的交叉引用

本申请要求2013年5月31日提交的美国临时申请号61/829,672和2013年8月27日提交的美国临时申请号61/870,586的优先权，其各自通过提述并入本文。

政府支持声明

本文所述工作的方面由USDA-美国国立粮食和农业研究所(NationalInstituteofFoodandAgriculture)的生物技术风险评估项目竞争性基金号2012-33522-19766支持。美国政府可以拥有这些发明的某些权利。

技术领域

本技术领域涉及遗传修饰的动物，特别是具有经遗传修饰用于通过性别分选的精子的动物。

发明背景

如果能够对精子预分选，来从那些具有X染色体配子的精子挑选出具有Y染色体配子的精子，动物育种和饲养活动将得到改进。接着可以从具有预先确定性别的精子创造动物。

发明概述

提供了具有可容易分选的精子的建立者动物(Founderanimals)。所述精子适合用于有效的离体分选过程。实施方案包括使用标志物标记的精子。所述标记物提供可视化和/或用于结合的标签。提供阳性和阴性选择两者。使用所述精子的离体分选过程包括，例如，基于可视化，基于标志物的分选，阴性选择，例如，使用毒素或基于运动性的试验的技术。以下专利申请通过提述在此并入本文用于所有目的：在冲突的情况下，以本说明书为准：US2010/0146655,US2010/0105140,US2011/0059160,和US2011/0197290。

附图简述

图1说明了利用遗传工具来创建具有经遗传修饰的精子的动物。

图2A说明了具有精子外部和/或内部的经修饰的位点的哺乳动物精子。

图2B说明了用于分选精子的实施方案，其使用具有结合精子表面上的标志物的配体的固相。

图3描述了创建具有标记来指示性别的精子的动物。

图4描述了修饰脊椎动物Y染色体的实验结果。

图5是实施例6和7的实验结果的剪辑组合(montage)，示出了CRIPR/Cas9介导的HDR用于将来自疣猪的p65S531P突变基因渗入到常规的猪中。组a)S531P错义突变；组b)对转染的Landrace成纤维细胞的SURVEYOR试验；组c和d)示出了对第3天和第10天取样的细胞的RELP分析。组a中顶部和底部的序列行为向导RNA(gRNA)(具有SEQIDNO:1的P65_G1S和具有SEQIDNO:2的P65_G2A)。第二行为野生型(Wt)P65序列，SEQIDNO:3。第三行为实验中使用的HDR模板，SEQIDNO:4。示出了左TALEN(SEQIDNO:5)和右TALEN(SEQIDNO:6)。

图6是实验结果的剪辑组合，示出了在猪APC中TALENs和CRISPR/Cas9介导的HDR的比较。组a)描述了APC14.2TALENs和相对于野生型APC序列的gRNA序列APC14.2Gla。下方，示出了HDR寡聚物，其递送4bp插入(下划线文本)产生新的Hindlll位点。组b)示出了展示RFLP和SURVEYOR试验结果的图。组a的顶行是APC14.2TALENs序列，SEQIDNO:7。第二行是野生型APCS序列，SEQIDNO:8。第三行示出了gRNA序列Gla，SEQIDNO:9。底部序列是HDR模板，SEQIDNO:10。

图7示出了使用TALENs和质粒同源模板，基因靶向脊椎动物Y染色体两个位点(AMELY和SRY)。使用同源臂外的基因座特异性引物和同源模板内的转基因特异性引物筛选集落个体。所述同源模板的基因座和方向在它们对应的孔上指示而阳性对照指示为(+)。

图8表格示出了使用TALENs和质粒同源基因盒的克隆中Y靶向的分析结果。

图9是泛素EGFP对Y染色体中的3个位点的短同源靶向。针对SRY的3’接合的引物也给出了有和无TALENs的非特异性条带模式。

图10柱状图示出了使用TALENs和对AMELY和SRY位点特异性的短同源模板处理的细胞中EGFP标志物的表达。

图11是对表达EGFP标志物的克隆的接合分析。

图12提供了cisX载体的总体图。猪SP10，ACE或CK15启动子放置在cisX基因盒的上游。这一cisX基因盒由侧接EGFP转基因的Smokl5和3’UTRs组成。整个启动子-转基因盒侧接SleepingBeautyIRDRs以促进通过提供转座酶SB100X的来源，所述转基因的酶促插入。

图13顶部，小鼠测试中EGFP转录物的qPCR，针对Itga6标准化。在下方示出建立者品系和分析的小鼠是F0或Fl。提供所述转基因的F0传输给出所述转基因的总拷贝数的估值。

图14使用针对绿色荧光蛋白的抗体对表达GFP的小鼠中睾丸组织的荧光标记由SP10启动子下的顺式限制调节。

图15使用针对绿色荧光蛋白的抗体对表达GFP的雄性小鼠中精子的荧光标记由SP10启动子下的顺式限制调节。

发明详述

提供了具有经标记的精子的动物，以指示所述精子中性染色体的性别。高效的离体分选过程可以用于分离所述标记的精子。可以使用标志物用于对精子分选，使用所述标志物的成像，或所述标志物可以提供用于结合的位点。可以使用阳性和/或阴性选择。使用所述精子的离体分选过程包括，例如，基于可视化的技术，基于标志物的分选，阴性选择例如使用毒素。也可以使用基于运动性的试验，例如，其中不善游泳的精子从野生型的游泳精子分离。实施方案包括，例如，标志物和精子组分的融合蛋白。可以修饰蛋白和基因来制造本文详述的融合蛋白。包括详细描述对性染色体修饰的数据。

精子解剖学和形成

哺乳动物精子细胞具有头部，中段和尾部。头部含有核，其具有密集盘绕的染色质纤维，被前方的顶体包围，其含有用于穿透雌性卵细胞的酶。所述中段具有中央纤维状核心，具有许多线粒体周围包裹着它，用于ATP生产用于通过雌性子宫颈，子宫和输卵管的旅程。所述尾部或“鞭毛”执行冲击运动(lashingmovements)，其推动精母细胞。

精子发生指代通过它在曲细精管(seminiferoustubule)中从位于基底膜的精原细胞或精母细胞形成精子的过程。精子发生具有两个不同的阶段：精母细胞发生，其为一系列分裂，期间精原细胞形成精细胞。第二阶段为精子发生：这一阶段精细胞经历变态(metamorphosis)形成精子。整个过程需要数周，例如，公牛中约60天而公羊中为约49天。

精母细胞发生具有四个阶段：阶段1(通常约15天持续时间)为精原细胞的有丝分裂。休眠的精原细胞保持在靠近基底膜的生殖上皮中，以在后来重复过程。活化的精原细胞将经历4次有丝分裂最终形成16个初级精母细胞。阶段2(约15天持续时间)为初级精母细胞的有丝分裂，在这一期间染色体的数量减半(减数分裂-I)。阶段3(通常几个小时)为次级精母细胞分裂为精细胞(减数分裂VII)。当从每个初级精母细胞形成4个精细胞或从每个活化的精原细胞形成64个精细胞时，阶段4发生。精母细胞发生随后跟着一个阶段其中精细胞变得完全成熟以形成精子。

用于修饰的基因

在精子上或精子中有多种生物分子的表达。通常，哺乳动物精子蛋白为保守得很好使得一种哺乳动物的精子上的蛋白在其它物种中具有对应物。一旦一种蛋白在具体物种中已经鉴定，技术人员惯常的跨物种定位蛋白的对应物。一个种类是精子纤维鞘蛋白。Chriva-Internati等，CancerImmunity,2008,(8):8-13，综述了这一类。精子的鞭毛具有：(a)连接段；(b)中段，其包括线粒体；(c)主段，和(d)短末段。主要的细胞骨架结构为轴丝(axoneme)，外密纤维，和纤维鞘(FS)。FS位于质膜下，并围绕轴丝和外密纤维。FS似乎作为糖酵解酶和信号传导分子的支架。已经鉴定了几种定位于FS中的蛋白，包括，例如，Spl7,CABYR,AKAP3,AKAP4,TAKAP-80,Rhopilin,Ropporin,GSTM5和fibrousheathin。

谷胱甘肽S转移酶(GSTs)定位于精子表面，见Hemachand等，cellScience,2002,115(10):2053-2065。GSTs为一个酶的家族，其催化一些谷胱甘肽(GSH)依赖的反应并已经被主要描述为胞质或微粒解毒酶，其也能够作为细胞内结合蛋白发挥功能。

Nabby-Hansen在论文“Functionalandimmunologicalanalysisofthehumanspermproteome”，DanMedJ,2012,59(3):B4414中综述了精子蛋白。使用标记技术鉴定了约200种精子表面蛋白。可以分离这些蛋白并用于鉴定它们对应的基因。事实上，其中一些实际上被分离并微测序(microsequenced)，而微序列中的两个用于制造引物用于克隆两种精子表面蛋白，命名为SAMP14和SAMP32。另一种精子表面蛋白是PH-20(定位于来自几种哺乳动物物种的精子的整个表面)。CD52是SAGA-1蛋白上的表位，其也是结合精子的单克隆抗体S19的抗原；已经将SAGA-1定位于人精子中的所有表面域。鉴定为血清淀粉样P-组分(SAP)的蛋白是一种丰富的钙结合表面蛋白，具有MW为26.5kDa。80K-H是另一种精子表面蛋白；它是一种多功能的Ca²⁺-传感器，具有多种功能包括PKC途径。此外，钙结合调理素SAP和三种钙结合HSP70分子伴侣HYOU1，HSPA5和HSPA2为精子质膜的已知成分。

Naaby-Hansen和Herr,J.Reprod.Immunol.,2010,84(l):32-40使用质谱分析和Edman降解来阐明从使用生物素和放射碘标记的精子表面分离的精子蛋白的身份。他们报道鉴定了来自四种不同热休克蛋白(HSP)家族的七个成员，包括HYOU1(ORP150),HSPC1(HSP86),HSPA5(Bip),HSPD1(HSP60)，以及两种睾丸特异性的HSP70分子伴侣，HSPA2和HSPA1L的几种同等型。针对睾丸特异性FISPA2分子伴侣产生的抗血清与三种65kDaHSPA2同等型和三种高分子量表面蛋白(78-79kDa,84kDa和90-93kDa)反应。这些蛋白，连同七种65kDaHSP70形式，与人抗精子IgG抗体反应并在人中阻断体外受精。这些表面生物素化的人类精子抗原中的三种使用兔抗血清免疫沉淀，所述兔抗血清针对沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)HSP70中的线性表位产生。这些结果表明多种HSP分子伴侣可用于人类精子的表面标记。

Fabrega等，ReproductiveBiologyandEndocrinology,2011,9(96):1-13指出了精子表面蛋白包括受精素(fertilin)，一种由两个称为α-受精素(ADAM-1)和β-受精素(ADAM-2)(在豚鼠中为PH-30α和PH-30β)的完整膜糖蛋白组成的异源二聚体复合物，而几种其它的ADAMs已经报道参与精子-卵子识别和膜融合中。ADAM代表“A解聚素和金属蛋白酶(ADisintegrinAndMetalloprotease)”，一个具有确定特征的家族，包括pro-结构域，金属蛋白酶，解聚素和富含半胱氨酸的结构域，EGF样重复，跨膜结构域和羧基末端胞质尾。Fabrega等在公猪模型中研究了ADAM。

Larson和Miller,BiolReprod.,1997,57:442-453。来自多种哺乳动物物种的精子在它们的表面上表达β1,4半乳糖基转移酶(GalTase)。该作者在来自六个物种的精子上进行了GalTase酶试验，而所有六个在它们的表面上都表达GalTase。物种之间GalTase的量不同。豚鼠，小鼠和大鼠精子具有比牛，猪和兔精子更高水平的GalTase。

Dorus等，Mol.Biol.Evol.,2010,27(6):1235-1246调查了精子蛋白并报道了精子膜上或精子中其它地方的各种蛋白。鉴定了定位于细胞膜或整个精子的精子蛋白和基因，并将它们彼此区分。许多精子中或精子上的蛋白是已知的。Dous提供了对许多蛋白，定位，以及表达所述蛋白的基因的冗长描述和列表。

在一个家畜物种中的基因在其它家畜物种以及人和小鼠中一致地具有直系同源物。人和小鼠基因一致地在家畜中具有直系同源物，特别是在牛，猪，绵羊，山羊，鸡和兔中。这些物种和鱼之间的基因直系同源物通常是一致的，依赖于所述基因的功能。生物学家熟悉这些用于寻找基因直系同源物的方法，因此基因在本文中可以就一个物种来描述而不列出直系同源物。因此，描述基因的失活，标记或表位附加(epitopetagging)的实施方案包括对其它物种中具有相同或不同名称的直系同源物的失活，标记或表位加标签。存在综合的基因数据库以及那些专门为鉴定基因直系同源物的数据库。

技术人员可以使用这些领域中已知的技术制备融合蛋白。实施方案包括用于转染细胞从而工程化所述细胞以在体内制备融合蛋白的载体，以及其方法，其中所述细胞在体外，离体或体内转染，且其中所述细胞为组织移植物的成员或与此不同。以下美国专利申请在此通过提述并入本文用于所有目的，包括制造融合蛋白的目的，其中在冲突的情况下以本说明书为准：5227293,5358857,5885808,5948639,5994104,6512103,6562347,6905688,7175988,7704943,US2002/0004037,US2005/0053579,US2005/0203022,US2005/0250936,US2009/0324538。

分选

图2A描述了经遗传修饰的精子的实施方案：在其表面上经修饰的精子；在内部经修饰的精子；在内部和表面上都经修饰的精子。内部修饰对于基于可视化技术的分选过程以及其它例如基于存活或其它变化(例如改变的运动性)的选择过程是有用的，。可以选择标志物使得它们被配体结合，或特异性结合。图2B描述了表达标志物的精子，其结合包括结合所述标志物的配体的珠子。将所述精子暴露于所述珠子，标记的精子通过所述配体结合珠子，而所述珠子从未结合的精子中分离，例如通过磁性，离心，或重力。或者包括，例如，将所述配体固定化到柱中的珠子，所述柱接受样品，将包被有所述配体的试纸放置到样品中，和使用所述配体包被烧杯或容器壁。另一种选择是使多个配体结合可溶性材料并使所述可溶性材料与标记的精子交联以创建物理-相分离，或沉淀。

其它的分选方法依赖于可视化，其为产生图像的广义术语。所述可视化可以在可视光，荧光的波长中，或依赖于放射不透性。可以使用例如流式细胞术的工具。标志物可以在精子细胞上或内部用于可视化。

其它的分选方法依赖于静电电荷。通过电荷分离细胞的流式细胞装置是已知的。所述标志物可以是静电活化的以产生表面电荷用于将具有所述标注物的细胞从不表达所述标志物的细胞分选。

另一个分选的实施方案依赖于通过毒素因子与标志物的结合杀死精子细胞。所述毒素因子导致细胞死亡或标记所述细胞用于毒药或其它生物方式破坏，例如天然杀伤细胞。毒素因子的例子为毒药和凋亡因子。例如，可以制造肠毒素的融合物：具有多种作用模式的肠毒素。例如，白喉毒素导致宿主细胞膜中形成洞，或孔。另一种形成孔的外毒素是由嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)产生的气单胞菌溶素。第二种肠毒素是超抗原毒素。超抗原毒素通过刺激T细胞作用。超抗原毒素的例子包括来自于金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)。方案可以包括体外制备免疫细胞，其应答具有配体-毒素融合分子的杀伤细胞。补体介导的裂解系统，例如，可以用于使表达所述标志物的精子失能，例如，见(Hauschild等，2011)其中双等位无义细胞(nullcell)可以通过FACS富集GGTA1依赖的表面表位的缺失。第三种肠毒素是A-B毒素。A-B毒素由两种或多种一起作用的毒素亚基组成。典型地，所述A亚基结合宿主细胞壁并形成通向膜的通道。所述通道允许B亚基进入所述细胞。A-B毒素的一个例子是由霍乱弧菌(Vibriocholerae)产生的肠毒素。结合所述毒素因子的配体与携带标志物的精子混合。所述标志物结合配体使得所述毒素因子接近所述细胞。

其它实施方案提供表达于精子细胞内部的毒素因子。作为结果细胞死亡。因此具有表达毒素因子的Y染色体的配子将死亡，留下具有X染色体的精子。这一实施方案详细描述于2013年8月27日提交的美国流水号61/870.558和2013年5月31日提交的美国流水号61/829,656，和2014年4月28日提交的共同审理的美国流水号14/263,408中，其各自在此通过提述并入本文用于所有目的。

另一个实施方案涉及毒药解毒剂的表达。将所述精子放置到含有毒药的溶液中。没有解毒剂的精子被破坏。

可以使用阳性/阴性选择。因此所述标志物可以用于鉴定待使用的精子，或那些不希望使用的精子。在一些情况下，可能优选具有标志物的性别，而在其它时候，可能优选不具有所述标志物的性别。如果在不同的性染色体上使用两种不同的标志物，那么一种标志物可以阳性选择而另一种标志物阴性选择。性染色体可以表达一种，或多于一种标志物。

选择性结合部分

选择性结合标志物的结合部分可以是配体，或化学基团，其通过更为普遍的相互作用结合，例如静电作用，离子作用，或疏水亲和。配体是表现出与其靶标特异性结合的化学部分。配体相互作用包括酶-底物，受体至配体，以及抗体-抗原结合事件。

可以容易的对于蛋白生成抗体。在精子表面表达的标志物非常可能被抗体结合，所述抗体可以容易的通过实验产生。使用对于其靶标具有结合亲和力的抗体部分的方法是公知的。术语抗原，在这一语境中，指代被响应所述抗原的宿主免疫系统识别的位点。在产生抗体的领域等中抗原选择是已知的。术语抗体片段指代抗体的一部分，其保留了所述抗体的抗原结合功能。所述片段可以按照字面上从较大抗体的一部分制成，或者可以从头合成。抗体片段包括，例如，单链可变片段(scFv)。scFv是一种免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白，其由接头肽连接，例如，约10至约50个氨基酸。所述接头可以将所述VH的N末端和所述VL的C末端相连，或反之亦然。术语scFv包括二价scFv，双抗体，三抗体，四抗体以及抗体片段的其它组合。具有抗原结合部分的抗体称为互补位(paratope)。术语肽配体指代不是互补位的一部分的肽。

可以制成适体来以高亲和力特异性结合标志物。DNA和RNA适体可以用于提供非共价结合。因为它们由核苷酸组成，适体是有前景的生物分子靶向部分，因为筛选方法学已经非常成熟，它们能够容易地化学合成，以及由于它们在体内的快速清除造成有限的副作用毒性和/或免疫原性(Keefe,Pai等，2010)。适体是结合特异性靶标分子的寡核苷酸或肽。适体通常创建来结合感兴趣的靶标，通过从大量随机的序列池中选择它们。适体可以分类为DNA适体，RNA适体，或肽适体。核酸适体为核酸种类，其通过反复几轮体外筛选或通过指数富集配体系统进化(SELEX)方法(Archemix,Cambridge,MA,USA)工程化(Sampson,2003)来特异性结合靶标例如小分子，蛋白，核酸，细胞，组织和生物体。肽适体通常具有短的可变肽结构域，附接到蛋白支架的两端。肽适体是蛋白，其经设计来干扰细胞内的其它蛋白相互作用。它们由附接到蛋白支架两端的可变肽环组成。这一双重结构约束大大增加了所述肽适体的结合亲和力从而与抗体的结合亲和力可比。所述可变环的长度通常由约十个至约二十个氨基酸组成，而所述支架是具有良好可溶性并折叠的蛋白。例如细菌蛋白Thioredoxin-A是一种支架蛋白，其中所述可变环插入到还原活性位点中，在野生型蛋白中为-Cys-Gly-Pro-Cys-环，两个半胱氨酸的侧链能够形成二硫键。用于制造适体的一些技术详细描述于Lu等，Chem.Rev.,2009,109(5):1948-1998,并也描述于US7,892,734,US7,811,809,US2010/0129820,US2009/0149656,US2006/0127929,和US2007/0111222。

可以生成肽序列来特异性结合标志物。存在几种方法用于结合蛋白或多肽的亲和力选择，例如噬菌体展示，酵母表面展示，niRNA展示或肽在珠上(peptide-on-bead)展示。见：BoderET,WittrupKD.SmithGP,PetrenkoVA.PhageDisplay.Chem.Rev.,1997,97-2:391-410；Yeastsurfacedisplayforscreeningcombinatorialpolypeptidelibraries.Nat.Biotechnol.,1997,15-6:553-557；XuL,AhaP,GuK,KuimelisRG,KurzM,LamT,LimAC,LiuH,LohsePA,SunL,WengS,WagnerRW,LipovsekD.Directedevolutionofhigh-affinityantibodymimicsusingniRNAdisplay.Chem,Biol,2002,9-8:933-942；LamKS,LeblM,KrchnakV.The"One-Bead-One-Compound"CombinatorialLibraryMethod.Chem.Rev.,1997,97-2:411-448；ZacherAN,3rd,StockCA,GoldenJW,2nd,SmithGP.Anewfilamentousphagecloningvector:fd-tet.Gene,1980,9-1-2:127-140。

在所有这些情况中，对于蛋白能够在精子中表达且能够产生结合它的特异性结合分子有很高的成功期望，只要所述蛋白在精子表面是可接近的。

对动物的遗传修饰

经遗传修饰的动物的实施方案，所述动物包括包含染色体的细胞，所述染色体包含在配子发生中选择性活化的启动子控制下的外源基因。可以通过对细胞或胚胎的遗传修饰创建动物。可以修饰一种或两种性染色体，即X或Y染色体。由所述外源基因表达的标志物在表达元件的控制下，所述表达原件对于精子发生的阶段是选择性的。所述表达原件为，例如，启动子，microRNA。

发育成精子的细胞共享细胞质深入到精子发生周期。当姐妹细胞之间的细胞质桥逐渐消失时，细胞质共享结束。在这一共享结束前表达基因的遗传修饰将不是有效的，因为一些共享细胞质的细胞具有X染色体而一些具有Y染色体。本文列出的一组实施方案使用遗传表达元件(启动子和/或microRNA)来控制表达。另一组实施方案将所述标志物放置在细胞质桥消失后表达的蛋白上，例如，如本文所列出的特定尾部蛋白。

图1和3描述了制造动物的遗传修饰的过程。修饰细胞来制造胚胎，例如，使用克隆技术或直接处理胚胎来修饰细胞。所述细胞使用在配体发生表达元件控制下的因子修饰。所述因子可以是X，Y或常染色体上的外源基因，或其可以是调节/破坏基因的元件。随着配子发生进行，所述因子被活化。所述因子可以具有多种效果，例如：杀伤或在具有X染色体的配子中表达标志物，杀伤或在具有Y染色体的配子中表达标志物，其中所述标志物如本文中所述，例如，可视化，阳性选择，阴性选择，共选择，存活，配体，抗原。

可以制得单等位基因或双等位基因染色体修饰的动物，使用在适当的位置留下标志物的方法，允许其孕育出动物，或通过不在动物中放置标志物的方法。例如，本发明人已经使用了同源依赖重组(HDR)来对动物的染色体做出改变，或向其插入外源性基因。在本文的其它地方讨论了例如TALENs和重组融合蛋白，以及常规方法的工具。一些支持本文公开的遗传修饰的实验数据总结如下。本发明人先前已经证明了当从修饰细胞的多基因群体克隆时超常的克隆效率，并倡导这种方法来避免通过分离的集落的体细胞核转移(SCNT)时克隆效率的变化(Carlson等，2011)。另外，然而，靶向核酸内切酶，例如，TALEN介导的基因组修饰，以及通过重组酶融合分子的修饰，提供双等位基因改变在一代中完成。例如，可以通过SCNT制成对于敲除基因纯合的动物而不需要繁殖来产生纯合子。家畜例如猪和牛的妊娠期以及成熟达到繁殖年龄是研究和生产的重大障碍。例如，通过克隆和繁殖从杂合突变细胞(两种性别)生成纯合敲除对于猪和牛将分别需要16和30个月。有些人使用遗传修饰的连续周期和SCNT减少了这一负担(Kuroiwa等，2004)，然而，这同时在技术上具有挑战性且成本过高。在SCNT之前常规地生成双等位基因KO细胞的能力在大型动物遗传工程化中是显著的进步。在永生化细胞系中，使用其它方法例如ZFN和稀释克隆已经完成了双等位基因敲除(Liu等，2010)。最近另一个小组证明了使用商业化ZFN试剂的猪GGTA1的双等位基因敲除(Hauschild等，2011)，其中可以通过对GGTA1-依赖的表面表位缺失的FACS富集双等位无义细胞。虽然这些研究证明了某些有用的概念，它们没有说明动物或家畜可以被修饰，因为简单的克隆稀释对于分离的原代成纤维细胞通常不可用(成纤维细胞在低密度不良生长)且对于大多数基因，对无义细胞的生物学富集不可用。

本发明人先前已经示出了当与密度大于150细胞/cm²的非转基因成纤维细胞一同铺板并使用转座子共选择技术进行药物选择时，转基因原代成纤维细胞可以有效地扩增并作为集落分离(Carlson等，2011，美国公开号2011/0197290)。进一步示出了(见2012年2月24日提交的美国流水号13/404,662)对使用六种TALEN对处理的细胞分离了嘌呤霉素抗性的集落并通过SURVEYOR试验或对跨越靶标位点的PCR产物直接测序评价了它们的基因型。一般来说，插入删除(indel)阳性克隆的比例与基于第3天修饰水平的预测相似。对于6种TALEN对中的5种，鉴定了双等位基因KO克隆，发生于高达35％的插入删除阳性细胞中。值得注意的是，对于大多数TALEN对，双等位基因KO克隆的频率超出了如果每条染色体的切割作为独立的事件处理时的预测。

TALEN诱导的同源重组消除了对于连接的选择标志物的需要。TALENs可用于通过同源依赖修复(HDR)将特定的等位基因精确地转移到家畜基因组中。在一项试验性的研究中，特定的11bp删除(BelgianBlue等位基因)(Grobet等，1997；Kambadur等，1997)引入到了牛GDF8基因座中(见，2012年2月24日提交的美国流水号13/404,662)。当单独转染时，btGDF8.1TALEN对在靶标基因座处切割高达16％的染色体。与含有所述11bp删除的超螺旋同源DNA修复模板共转染导致在第3天高达5％的基因转化频率(HDR)而无需选择期望的事件。在1.4％的筛选的分离集落中鉴定了基因转化。这些结果证明TALENs可以用于有效的诱导HDR无需连接的选择标志物的帮助。实施例1提供了实验数据，证明了可以通过使用，例如TALENs遗传改变Y染色体或其它染色体。TALENs在本文的其它地方详细讨论。

实施例1，见图4，描述了针对Y染色体处的靶标的TALENs。三种TALENs对显示了活性。相应地，可以制成在Y染色体上具有插入删除的细胞，以及从所述细胞制备的动物。实施例2提供了用于TALEN介导的基因组修饰的方法，以在一代中完成双等位基因敲除。猪和牛的妊娠期长度以及成熟达到繁殖年龄是显著的；例如，对于猪和牛，通过克隆和繁殖从杂合突变细胞(两种性别)产生纯合敲除将分别要求16和30个月。在永生化细胞系中，使用ZFN和稀释克隆已经完成了双等位基因敲除(Liu等，2010)。最近另一个小组证明了使用商业化ZFN试剂的猪GGTA1的双等位基因敲除(Hauschild等，2011)，其中可以通过GGTA1-依赖的表面表位缺失的FACS富集双等位基因无义细胞。虽然这些其它的研究是有用的，但它们使用了简单的克隆稀释。这类过程不可用于大多数原代成纤维细胞分离物，且对于多数基因用于无义细胞的生物学富集不可用。然而，在实施例2中，使用了原代细胞，基于允许单个集落的扩增来筛选双等位基因敲除的方法。实施例3揭示了修饰细胞的替换方法，所述细胞对于制造克隆动物有用。实施例4揭示了其它制造用于克隆的细胞的方法，特别的，涉及单链寡核苷酸作为HDR模板的方法。实施例5使用单链寡核苷酸方法，以没有标志物的有效方法将基因从一个物种移动到另一个物种。

实施例6-8描述了基因的Cas9/CRISPR核酸酶编辑。实施例7和8是Cas9/CRISPR的结果，示出了在预期位点处高效产生的双链断裂。这种断裂提供了通过HDR模板修复过程的基因编辑的机会。CRISPR/Cas9介导的HDR在第3天低于6％且在第10天低于检测(图5)。对CRISPR/Cas9诱导的第二个基因座，ssAPC14.2处的靶向分析效率高得多，但仍没有达到TALENs在这一位点诱导的HDR的水平，约30％对60％(图6)。Cas9/CRISPR是一种有效的工具，如这些实验所示。

实施例9和10描述了使用质粒盒(图7和8)或使用线性短同源模板(图9-11)对Y染色体的靶向。两种技术都使用了TALENs来在预期的靶向位点建立双链断裂，而同源模板将感兴趣的基因定向到靶标位置。效率为1和24％之间，两种方法都是有效的。

实施例11，见图12-15描述了一系列载体，其创建为携带假定的顺式-限制的转基因，所述转基因在猪ACE，CK-15或SP10启动子的指导下，全部都由申请人的团队基于小鼠的比较数据最先克隆。与qPCR的结果一致，仅在来自SP10建立者的精子中检测到了信号。本发明的实施方案包括配子中一种或多种顺式-限制的转基因或在启动子，例如组织特异性启动子的指导下参与配子发生。

本发明的实施方案包括制造经遗传修饰的动物的方法，所述方法包括使胚胎或细胞暴露于编码靶向性核酸酶(例如，大范围核酸酶，锌指，TALENs)的载体或mRNA，其中所述靶向性核酸酶特异性结合所述胚胎或细胞中的靶染色体位点，以创建对细胞染色体的改变，在替代母体(surrogatemother)中克隆细胞，或将胚胎植入替代母体中，所述替代母体孕育没有报告基因并仅在所述靶向的染色体位点处遗传修饰的动物。所述靶向的位点可以是本文所列出的一个，例如，本文所述的多种基因。靶向性核酸酶系统包括结合关联(cognate)DNA的基序，其通过蛋白-DNA结合或通过核酸-DNA结合。本文所报道的效率是显著的。本发明人已经在其它地方公开了进一步的技术，其进一步增加这些效率。

配子发生和配子发生表达元件

配子发生指代这样的生物学过程，通过它生殖细胞系前体细胞经历细胞分裂和分化以形成成熟的单倍体配子。动物通过减数分裂在生殖腺中形成配子。原生殖细胞(PGCs)在发育期间形成配原细胞。雌性配原细胞经历卵子发生，其具有卵母细胞发生，卵细胞发生，和成熟以形成卵子(有时称为卵子发生)的子过程。雄性配原细胞经历精子发生。所述配原细胞是雄性初级精子细胞(二倍体)的前体，其经历减数分裂以产生精原细胞(二倍体)，其产生初级精母细胞(二倍体)。初级精母细胞经历减数分裂以形成次级精母细胞(单倍体)，其形成精细胞(单倍体)，发育形成成熟的精子(单倍体)，也称为精子细胞。睾丸的曲细精管是所述过程的起始点，其中与内小管管壁相邻的干细胞以向心方向分裂，起始于所述壁并进行到最里面的部分以产生精细胞。精细胞的成熟发生于附睾中。在小鼠或大鼠中的研究已经证明了第一个动物的曲细精管可以接受来自供体动物的组织和/或精原细胞使得捐献的细胞成熟为功能性的精子。受体曲细精管可以有效地接纳供体细胞的精子发生过程。

配子发生启动子是对配子发生过程选择性的启动子。一些配子发生启动子在配子发生的减数分裂阶段之前作用，而其它的在配子发生过程中的多个时间点特异性活化。特别感兴趣的是在精子发生中仅在细胞质共享已经停止后活化的启动子。实施方案包括放置到细胞或胚胎中的外源基因，其在配子发生的选择性启动子的控制下，或在一个或多个选自下组的配子发生子过程期间选择性活化的启动子的控制下：卵母细胞发生，卵细胞发生，卵子成熟，精子发生，成熟成为精原细胞，成熟成为初级精母细胞，成熟成为次级精母细胞，成熟成为精细胞，以及成熟成为精子细胞。一些启动子在配子发生期间普遍地活化，而其它启动子的活化开始于特定的子过程，但可能在配子发生的整个其它阶段继续。实施方案进一步包括放置到细胞或胚胎中的外源基因，其在配子发生过程的选择性组织特异性启动子的控制下：例如，在选自下组的组织中选择性活化的组织特异性启动子：睾丸，曲细精管，以及附睾。前和后减数分裂配子发生启动子是细胞周期蛋白A1启动子，其不仅在粗线期精母细胞中也在早期的精子发生中活化(Muller-Tidow等，IntJMolMed.,2003Mar,11(3):311-315；SuccessiveincreasesinhumancyclinAlpromoteractivityduringspermatogenesisintransgenicmice)。SP-10启动子(-408/+28或-266/+28；称为SP-10启动子)仅指导精细胞特异性转录。实际上，在转基因小鼠中，尽管转基因整合临近泛-活化CMV增强子，但所述-408/+28启动子维持了精细胞特异性并导致了转基因的无异位表达(PReddi等，Spermatid-specificpromoteroftheSP-10genefunctionsasaninsulatorinsomaticcells；DevelopmentalBiology(2003)262(1):173-182)。由视黄酸基因8(Stra8)启动子(称为Stra8启动子)刺激的400-bp区域在减数分裂和后减数分裂的生殖细胞中选择性活化，并在未分化的生殖细胞中不活化(Antonangeli等，Expressionprofileofa400-bpStra8promoterregionduringspermatogenesis；MicroscopyResearchandTechnique(2009)72(11):816-822)。

发明人开发了可用于农业、研究工具，或生物医学目的的大致各种家畜细胞和/或动物中的多种基因的精确、高频的编辑。这些家畜基因编辑方法包括TALEN和CRISPR/Cas9刺激的同源性指导修复(HDR)，其使用例如质粒、rAAV和寡核苷酸模板进行。发明者开发出这些方法来达到如此高的效率以致遗传改变可以不需要报告物和/或不需要选择标志物而完成。此外，所述方法可以用于建立者世代(foundergeneration)，来产生仅在预期位点具有预期变化的经遗传修饰的动物。例如，用于靶向性核酸酶的方法和数据提供于2014年1月14日提交的美国流水号14/154,906中，其通过提述并入本文。见表1：具有HDR等位基因的集落的恢复频率。

同源性指导的修复(HDR)

同源性指导的修复(HDR)是细胞中修复ssDNA和双链DNA(dsDNA)损伤的一种机制。当存在有与损伤位点具有显著同源性的序列的HDR模板时，细胞可以使用这一修复机制。特异性结合，如该术语在生物领域中通常使用的，指代分子以与非目标组织相比相对较高的亲和力结合目标，并且通常涉及多个非共价相互作用，如静电相互作用、范德华相互作用、氢键键合等等。特异性杂交是一种具有互补序列的核酸之间的特异性结合的形式。蛋白也可以特异性结合DNA，例如，在TALEN或CRISPR/Cas9系统中或通过Gal4基序。等位基因的基因渗入(introgression)指代将外源性等位基因通过模板引导方法复制到内源性等位基因上的过程。在一些情况下，内源性等位基因实际上可以被切出并由外源性核酸等位基因代替，但现在的理论是这一过程是复制机制。由于等位基因是基因对，它们之间具有显著的同源性。所述等位基因可以是编码蛋白的基因，或其可以具有其它功能，如编码生物活性RNA链，或提供位点以接受调节蛋白或RNA。

HDR模板是包含基因渗入的等位基因的核酸。所述模板可以是dsDNA或单链DNA(ssDNA)。ssDNA模板优选的是从约20到约5000个残基，虽然也可以使用其它长度。技术人员将立即理解，明确陈述的范围内的所有范围和数值都是涵盖的；例如，从500到1500个残基，从20到100个残基，等等。所述模板可以进一步包含侧翼序列，其提供与要取代的内源性等位基因或DNA邻近的DNA的同源性。模板还可以包括结合靶向性核酸酶系统的序列，并因此是系统的DNA结合成员的关联结合位点。术语关联指代通常相互作用的两种生物分子，例如受体及其配体。在HDR过程的语境中，生物分子中的一个可以设计为与预期，例如关联的DNA位点或蛋白位点结合的序列。

位点特异性核酸酶系统

基因组编辑工具如转录激活物样效应器核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)已经影响了生物技术、基因治疗，以及许多物种中的功能基因组研究领域。最近，RNA引导的内切核酸酶(RGEN)通过互补RNA分子引导到其目标位点。Cas9/CRISPR系统是REGEN。tracrRNA是另一种此类工具。这些是靶向性核酸酶系统的例子：这些系统具有将所述核酸酶定位到目标位点的DNA结合成员。接着，核酸酶切割位点。TALEN和ZFN具有融合到DNA结合成员的核酸酶。Cas9/CRISPR是在目标DNA上找到彼此的关联物。DNA结合成员具有染色体DNA中的关联序列。DNA结合成员通常根据意图的关联序列设计，以获得在意图位点处或附近获得核水解作用。某些实施方案可不受限地应用于所有此类系统；包括最小化核酸酶再切割的实施方案，在意图残基处精确产生SNP的实施方案，以及在DNA结合位点处基因渗入的等位基因的放置。

TALEN

术语TALEN用于本文是广泛的，包括不需要另一个TALEN辅助而能切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN还用于指代工程化改造成共同起作用以在相同位点处切割DNA的TALEN对的一个或两个成员。共同起工作的TALEN可以称为左-TALEN和右-TALEN，其参考DNA或TALEN对的手性。

TAL的密码(cipher)已有报道(PCT公开文本WO2011/072246)，其中每个DNA结合重复负责识别目标DNA序列中的一个碱基对。可以装配残基以靶向DNA序列。简言之，确定用于TALEN结合的目标位点，并创建包含核酸酶和一系列识别目标位点的RVD的融合蛋白。在结合后，核酸酶切割DNA，使得细胞修复机器能够运行以在切割末端处产生遗传修饰。术语TALEN表示包含转录激活物样(TAL)效应器结合域和核酸酶域的蛋白，并包括本身功能性的单体TALEN以及其它要求与另一个单体TALEN二聚化的TALEN。当两个单体TALEN相同时二聚化可以产生同二聚体TALEN，或者当单体TALEN不同时可以产生异二聚体TALEN。已显示了TALEN在永生化的人类细胞中通过两种主要的真核DNA修复途径(非同源末端连接(NHEJ)和同源性指导的修复)来诱导基因修饰。TALEN通常成对使用，但单体TALENs是已知的。用于TALEN处理(以及其它遗传工具)的细胞包括培养细胞、永生化细胞、原代细胞、原代体细胞、合子、生殖细胞、原生殖细胞、胚泡，或干细胞。在一些实施方案中，TAL效应器可以用于将其它蛋白结构域(例如，非核酸酶蛋白结构域)靶向特异性的核苷酸序列。例如，可以将TAL效应器与蛋白结构域相连，所述蛋白结构域来自，没有限制，DAN20相互作用酶(例如，甲基化酶，拓扑异构酶，整合酶，转座酶，或连接酶)，转录活化子或抑制子，或与其它蛋白相互作用或修饰其它蛋白例如组蛋白的蛋白。这种TAL效应器融合的应用包括，例如，创建或修饰表观遗传调节元件，制造DNA中的位点特异性插入，删除，或修复，控制基因表达，以及修饰染色质结构。

术语核酸酶包括外切核酸酶和内切核酸酶。术语内切核酸酶指代能够催化DNA或RNA分子(优选DNA分子)内的核酸之间的键的水解(切割)的任意野生型或变体酶。内切核酸酶的非限制性例子包括II类限制性内切核酸酶，如FokI,HhaI,HindIII,NotI,BbvCl,EcoRI,BglII,和AlwI。当具有通常长度约12-45个碱基对(bp)，更优选14-45bp的多核苷酸识别位点时，内切核酸酶还包含切点罕见内切核酸酶(rare-cuttingendonucleases)。切点罕见内切核酸酶在限定基因座处诱导DNA双链断裂(DSB)。切点罕见内切核酸酶可以是例如归巢内切核酸酶，即由工程化锌指域与限制性酶(如FokI)或化学内切核酸酶的催化域融合得到的嵌合锌指核酸酶(ZFN)。在化学内切核酸酶中，化学或肽切割剂与核酸聚合物或另一个识别特定目标序列的DNA缀合，从而将切割活性靶向到特定的序列。化学内切核酸酶也包括合成的核酸酶，如邻二氮杂菲、DNA切割分子，以及已知结合特定DNA序列的三链体形成寡核苷酸(triplex-formingoligonucleotides，TFO)的缀合物。根据本发明，这些化学内切核酸酶包含于术语“内切核酸酶”中。这些内切核酸酶的例子包括I-SeeI,I-ChuLI-CreI,I-CsmI,Pi-SeeLPI-TtiLPI-MtuI,I-CeuI,I-SeeIL1-SeeIII,HO,Pi-CivI,PI-CtrLPI-AaeI,PI-BsuI,PI-DhaI,PI-DraLPI-MavLPI-MehI,PI-MfuLPI-MflI,PI-MgaLPI-MgoI,PI-MinLPI-MkaLPI-MleI,PI-MmaI,PI-30MshLPI-MsmI,PI-MthI,PI-MtuI,PI-MxeI,PI-NpuI,PI-PfuLPI-RmaI,Pl-SpbI,PI-SspLPI-FaeLPI-MjaI,PI-PhoLPI-TagLPI-ThyI,PI-TkoI,PI-TspI,I-Msol。

由TALEN或其它工具制成的遗传修饰可以是，例如，选自下表：插入，删除，外源性核酸片段的插入，以及取代。术语插入广泛地使用，以表示字面上的插入到染色体中或使用外源性序列作为模板用于修复。一般来说，鉴定靶标DNA位点并创建将特异性结合所述位点的TALEN对。向细胞或胚胎递送所述TALEN，例如，作为蛋白，mRNA，或通过编码所述TALEN的载体。所述TALEN切割DNA以制造双链断裂，其接着被修复，通常导致插入删除的创建，或整合伴随的外源性核酸中含有的序列或多态性，其被插入染色体中或作为模板用于具有修饰的序列的断裂修复。这一模板驱使的修复对于改变染色体，以及提供对细胞染色体的高效改变是一个有用的过程。

术语外源性核酸表示加到细胞或胚胎的核酸，不论所述核酸与细胞中的天然核酸序列相同或不同。术语核酸片段是广泛的，包括染色体、表达盒、基因、DNA、RNA、mRNA，或其片段。细胞或胚胎可以是例如选自下组：家畜、偶蹄动物、牛、猪、绵羊，山羊，鸡，兔，和鱼。术语家畜表示驯养的动物，其作为用于食物或生物材料的商品饲养。术语偶蹄动物表示偶蹄目(Artiodactyla)的有蹄哺乳动物，其包括每只脚具有偶数数量的脚趾，通常为两个或有时为四个的牛、鹿、骆驼、河马、绵羊和山羊。

一些实施方案涉及产生经遗传修饰的家畜和/或偶蹄动物的组合物或方法，其包含将TALEN对导入家畜和/或偶蹄动物的细胞或胚胎中，从而在TALEN对特异性结合的位点处对细胞或胚胎DNA做出遗传修饰，以及从所述细胞产生家畜动物和/或偶蹄动物。直接注射可以用于细胞或胚胎，例如注射到合子、胚泡，或胚胎中。或者，可以使用用于蛋白、RNA、mRNA、DNA，或载体导入的多种已知技术之任一种，将TALEN和/或其它因子导入细胞中。可以从胚胎或细胞根据已知方法(例如将胚胎移植到妊娠期的宿主中)，或各种克隆方法产生经遗传修饰的动物。短语“在TALEN特异性结合的位点处对细胞DNA的遗传修饰”等表示当TALEN特异性结合其靶位点时，在TALEN上的核酸酶切割的位点处做出遗传修饰。核酸酶并不在TALEN对结合的地方精确切割，而是在两个结合位点之间的确定位点处切割。

一些实施方案涉及用于克隆动物的组合物或细胞的处理。细胞可以是家畜和/或偶蹄动物细胞、培养的细胞、原代细胞、原代体细胞、合子、生殖细胞、原生殖细胞或干细胞。例如，一个实施方案是创建遗传修饰的组合物或方法，其包含将培养物中的复数个原代细胞暴露于TALEN蛋白或编码一种或多种TALEN的核酸。TALEN可以作为蛋白质或核酸片段(例如由mRNA或载体中的DNA序列编码)导入。

锌指核酸酶

锌指核酸酶(ZFNs)是人工限制酶，其通过将锌指DNA结合域和DNA切割结构域融合产生。锌指结构域可以经工程化来靶向期望的DNA序列而这使得锌指核酸酶能够靶向复杂的基因组中的独特序列。通过利用内源性DNA修复机制，这些试剂可以用于改变高等生物的基因组。ZFN可以用于使基因失活的方法中。

锌指DNA结合域具有约30个氨基酸并折叠为稳定的结构。每个指主要结合DNA底物中的三联体。关键位置的氨基酸残基有助于大多数与DNA位点的序列特异性相互作用。可以改变这些氨基酸而维持剩下的氨基酸保留必要的结构。通过串联连接几个结构域完成与较长DNA序列的结合。其它的功能性像是非特异性Fokl切割结构域(N)，转录活化结构域(A)，转录抑制结构域(R)以及甲基化酶(M)可以融合到ZFP以分别形成ZFN，锌指转录活化子(ZFA)，锌指转录抑制子(ZFR)，以及锌指甲基化酶(ZFM)。使用锌指和锌指核酸酶用于制造遗传修饰的动物的材料和方法公开于，例如US8,106,255，US2012/0192298，US2011/0023159,和US2011/0281306。

载体和核酸

可以将多种核酸导入细胞中，用于敲除的目的，用于基因的活化，获得基因的表达，或用于其它目的。如本文所使用的，术语核酸包括DNA、RNA，以及核酸类似物，以及双链或单链(例如正义或反义单链)的核酸。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分，或磷酸主链处修饰以改进例如核酸的稳定性，杂交，或溶解性。可以修饰脱氧核糖磷酸主链来产生吗啉代核酸，其中每一个碱基部分与六元吗啉环或肽核酸相连，其中脱氧磷酸主链被假肽主链代替，而保留四种碱基。

目标核酸序列可以可操作地连接到调控区，如启动子。调控区可以是猪调控区，或者可以来自其它物种。如本文所使用的，可操作地连接指代将调控区相对于核酸序列以允许或促进目标核酸转录的方式定位。

任意类型的启动子可以可操作地连接到目标核酸序列。在制造具有标志物的精子的情况下，优选配子发生启动子或其它表达元件，但更普遍表达的标志物可以是有效的。启动子的类型包括但不限于组织特异性启动子，组成性启动子，可诱导启动子，以及对特定刺激物响应或者不响应的启动子。在其它实施方案中，可以使用促进核酸表达而没有显著的组织或时空特异性的启动子(例如，组成型启动子)。例如，可以使用β-肌动蛋白启动子(如鸡β-肌动蛋白基因启动子、泛素启动子、miniCAG启动子，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，或3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子)及病毒启动子(如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子、SV40启动子，或巨细胞病毒(CMV)启动子)。在一些实施方案中，将鸡β肌动蛋白基因启动子和CMV增强子的融合物作为启动子使用。见例如Xu等，(2001)Hum.GeneTher.12:563；和Kiwaki等，(1996)Hum.GeneTher.7:821。

可以用于核酸构建体的另外的调控区包括但不限于多聚腺苷酸化序列，翻译控制序列(例如内部核糖体进入区段，IRES)，增强子，诱导型元件，或内含子。这些调控区可能不是必要的，尽管它们可以通过影响转录、mRNA的稳定性，翻译效率等等来增加表达。在想要时核酸构建体中可以包含此类调控区以获得核酸在细胞中的最优表达。然而，有时可以在没有此类另外的元件的情况下获得足够的表达。

可以使用编码信号肽或选择标志物的核酸构建体。可以使用信号肽，使得编码的多肽定向到特定的细胞位置(例如细胞表面)。可选择标志物的非限制性例子包括嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)，二氢叶酸还原酶(DHFR)，潮霉素-B-磷酸转移酶，胸苷激酶(TK)，以及黄嘌呤(xanthin,xanthine)-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)。此类标志物对于在培养物中选择稳定的转化体是有用的。其它的选择标志物包括荧光多肽，如绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。

在一些实施方案中，编码选择标志物的序列在侧翼可以有重组酶(如例如Cre或Flp)的识别序列。例如，可选择标志物在侧翼可以有loxP识别位点(由Cre重组酶识别的34-bp识别位点)或者FRT识别位点，使得选择标志物可以从构建体切除。见Orban等,Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)89:6861(关于Cre/lox技术的综述)及BrandandDymecki,Dev.Cell(2004)6:7。含有由选择标志物基因中断的Cre-或Flp-可激活转基因的转座子也可以用于获得带有转基因的条件性表达的转基因动物。例如，驱动标志物/转基因表达的启动子可以是遍在的或者组织特异性的，其可以导致标志物在F0动物(例如猪)中的遍在或组织特异性表达。转基因的组织特异性激活可以通过例如将遍在表达标志物中断的转基因的猪与以组织特异性的方式表达Cre或Flp的猪杂交，或通过以组织特异性的方式表达标志物中断的转基因的猪与普遍表达Cre或Flp重组酶的猪杂交来完成。转基因的受控表达或标志物的受控切除允许转基因的表达。

在一些实施方案中，外源核酸编码多肽。编码多肽的核酸序列可以包括编码“标签”的标签序列，所述标签设计为促进编码多肽的后续操作(例如，促进定位或检测)。可以将标签序列插入编码多肽的核酸序列中，使得编码的标签定位于多肽的羧基或氨基末端。编码的标签的非限制性例子包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)和FLAG^TM标签(Kodak,NewHaven,CT)。

核酸构建体可以使用SssICpG甲基化酶(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA)甲基化。一般来说，核酸构建体可以与缓冲液中的S-腺苷甲硫氨酸和SssICpG-甲基化酶在37℃一起孵育。可以通过将构建体与1个单位HinP1I内切核酸酶在37℃孵育1小时和通过琼脂糖凝胶电泳测定确认超甲基化。

可以使用多种技术，将核酸构建体导入任意类型的胚胎、胎儿，或成年偶蹄动物/家畜动物细胞(包括例如生殖细胞，如卵母细胞或卵细胞，祖细胞、成体或胚胎干细胞，原生殖细胞，肾细胞，如PK-15细胞，胰岛细胞，β细胞、肝细胞，或成纤维细胞，如皮肤成纤维细胞)中。技术的非限制性例子包括使用转座子系统、能感染细胞的重组病毒，或脂质体或能够将核酸递送到细胞的其它非病毒方法，如电穿孔，显微注射，或磷酸钙沉淀。

在转座子系统中，核酸构建体的转录单元(即可操作地连接到目标核酸序列的调控区)侧翼有转座子的反向重复。已开发了几种转座子系统(包括，例如SleepingBeauty(见美国专利号6,613,752和美国公开文本号2005/0003542)；FrogPrince(Miskey等，(2003)NucleicAcidsRes.31:6873)；Tol2(Kawakami(2007)GenomeBiology8(Suppl.l):S7；Minos(Pavlopoulos等，(2007)GenomeBiology8(Suppl.l):S2)；Hsmar1(Miskey等，(2007))MolCellBiol.27:4589)；以及Passport)来将核酸导入细胞(包括小鼠、人和猪细胞)中。SleepingBeauty转座子尤其有用。转座酶可以作为蛋白递送，与目标核酸在相同的核酸构建体上编码，可以在分开的核酸构建体上引入，或作为mRNA(例如，体外转录并加帽的mRNA)提供。

核酸可以整合到载体中。载体是广义的术语，其包括设计为从携带者(carrier)移动到目标DNA中的任意特定DNA区段。载体可以称为表达载体，或载体系统，其为引起DNA插入基因组或其它靶定DNA序列(如附加体、质粒，或甚至病毒/噬菌体DNA区段)中需要的一组组分。在动物中用于基因递送的载体系统(如病毒载体(例如逆转录病毒、腺相关病毒以及整合噬菌体病毒)，以及非病毒载体(例如转座子))具有两个基本组分：1)由DNA(或RNA，其逆转录成cDNA)组成的载体，以及2)转座酶、重组酶，或其它整合酶，其识别载体和DNA目标序列两者，并将载体插入目标DNA序列中。载体最常含有一个或多个表达盒，其包含一个或多个表达控制序列，其中表达控制序列是控制并调节另一个DNA序列或mRNA分别转录和/或翻译的DNA序列。

许多不同类型的载体是已知的。例如，质粒和病毒载体(如逆转录病毒载体)是已知的。哺乳动物表达质粒通常具有复制起点，适合的启动子和可选的增强子，以及还有任意必要的核糖体结合位点，多聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，以及5’侧翼非转录序列。载体的例子包括：质粒(其也可以是其他种类载体的携带者)，腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒(例如经修饰的HIV-1、SIV或FIV)，逆转录病毒(例如ASV、ALV或MoMLV)，以及转座子(例如SleepingBeauty、P-元件、Tol-2、FrogPrince、piggyBac)。

如本文所使用的，术语核酸指代RNA和DNA两者，包括例如cDNA、基因组DNA、合成(例如化学合成)DNA，以及天然存在的和经化学修饰的核酸，例如合成的碱基或替代主链。核酸分子可以是双链或单链的(例如有义或反义单链)。术语转基因在本文中广泛使用，指代其遗传材料已经使用遗传工程技术改变的经遗传修饰的生物体或遗传工程化生物体。因此，有敲除的偶蹄动物是转基因的，无论外源性基因或核酸是否在该动物或其后代中表达与否。

经遗传修饰的动物

可以使用TALENs和其它遗传工程化工具来修饰动物，包括重组酶融合蛋白，或已知的多种载体。通过这些工具制成的遗传修饰可以包括对基因的破坏。术语对基因的破坏指代阻止功能性基因产物的形成。仅当基因产物实现它的正常(野生型)功能时，其为功能性的。对基因的破坏阻止由所述基因编码的功能性因子的表达，并包括对向基因编码的序列和/或对于所述基因在动物中的表达必要的启动子和/或操纵子中一个或多个碱基的插入，删除，或取代。可以通过，例如从动物的基因组中去除至少一部分所述基因，改变所述基因以防止由该基因编码的功能性因子的表达，干扰RNA，或通过外源性基因的显性阴性因子的表达来破坏所述破坏的基因。遗传修饰动物的材料和方法进一步详细描述于2012年2月24日提交的美国流水号13/404,662，2012年5月9日提交的13/467,588和2009年11月10日提交的12/622,886，其各自通过提述并入本文用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明书为准。术语反式作用指代不同的分子作用于目标基因的过程(即分子间)。反式作用元件通常是含有基因的DNA序列。这一基因编码用于调节所述目标基因的蛋白(或microRNA或其它可扩散分子)。所述反式作用基因可以与目标基因在同一条染色体上，但活性通过其编码的中间蛋白或RNA。使用显性阴性对基因的失活通常涉及反式作用元件。术语顺式调节或顺式作用表示不编码蛋白或RNA的作用；在基因失活的语境中，该术语通常表示基因的编码部分的失活，或对于功能性基因的表达必要的启动子和/或操纵子的失活。

本领域已知的各种技术可以用于失活基因以制造敲除动物和/或将核酸构建体导入动物中，来产生建立者动物和制造动物品系，其中所述敲除或核酸构建体整合到基因组中。这些技术包括但不限于原核(pronuclear)显微注射(美国专利号4,873,191)，逆转录病毒介导的对生殖细胞系的基因转移(VanderPutten等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6148-1652)，对胚胎干细胞的基因靶向(Thompson等，(1989)Cell,56:313-321)，胚胎的电穿孔(Lo(1983)Mol.Cell.Biol.,3:1803-1814)，精子介导的基因转移(Lavitrano等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99,14230-14235；Lavitrano等，(2006)Reprod.Fert.Develop.18,19-23)，以及体细胞(例如卵丘细胞或乳腺细胞)，或成体、胎儿或胚胎干细胞的体外转化，接着进行核移植(Wilmut等，(1997)Nature,385:810-813；和Wakayama等，(1998)Nature,394:369-374)。原核显微注射、精子介导的基因转移，以及体细胞核转移是特别有用的技术。基因组修饰的动物是其中它的所有细胞都具有所述遗传修饰的动物，包括生殖系细胞。当使用的方法产生其遗传修饰为嵌合体的动物时，可以使所述动物同系交配并可以选择基因组修饰的后代。例如，如果在胚泡阶段修饰其细胞，可以使用克隆来制造嵌合体动物，或当修饰单细胞时可以发生基因组修饰。如果通过敲除修饰使具体的基因失活，通常需要纯合。如果通过RNA干扰或显性阴性策略使具体的基因失活，那么杂合往往就够了。

通常来说，在原核显微注射中，将核酸构建体导入受精卵中；1个或2细胞受精卵用作含有来自精子头部的遗传材料的原核，并且卵在原生质内可见。原核分期的受精卵可以在体外或体内获得(即从供体动物的输卵管中手术回收)。可以如下产生体外受精卵。例如，可以在屠宰场采集猪的卵巢，并在运输期间保持在22-28℃。可以冲洗并分离卵巢用于卵泡穿刺，可以使用18号针在真空下将范围从4-8mm的卵泡抽吸到50ml锥形离心管中。可以使用商业化TL-FIEPES(Minitube,Verona,WI)通过预滤器润洗卵泡液和穿刺的卵母细胞。可以选择被紧密的卵丘质包围的卵母细胞并放置到TCM-199卵母细胞成熟培养基(Minitube,Verona,WI)中，其使用0.1mg/mL半胱氨酸,10ng/mL表皮生长因子,10％猪卵泡液,50μΜ2-巯基乙醇,0.5mg/mlcAMP,10IU/mL孕马血清促性腺激素(PMSG)和10IU/mL人绒毛膜促性腺激素(hCG)补充，在潮湿的空气中在38.7℃和5％CO₂持续约22个小时。接着，可以将所述卵母细胞转移到新鲜的TCM-199成熟培养基中，其不含有cAMP,PMSG或hCG并孵育另外22个小时。可以通过在0.1％的透明质酸酶中涡旋振荡1分钟将成熟的卵母细胞从它们的卵丘细胞剥离。

对于猪，成熟的卵母细胞可以在500μlMinitubePORCPROIVFMEDIUMSYSTEM(Minitube,Verona,WI)中在Minitube5孔受精皿中受精。在体外受精(IVF)的准备中，可以将新鲜收集的或冷冻的公猪精液清洗，并在PORCPROIVF培养基中重悬至4x10⁵个精子。精子浓度可以使用计算机辅助精液测试(SPERMVISION,Minitube,Verona,WI)分析。最后，体外授精可以在10μl体积中以终浓度为约40个能动精子/卵母细胞进行，这取决于公猪。将所有受精的卵母细胞在5.0％CO₂气氛中在38.7℃孵育6小时。授精后六小时，推定的合子可以在NCSU-23中清洗两次并移到0.5ml的相同培养基中。该系统通常可以在大多数公猪间以10-30％的多精授精率(polyspermicinseminationrate)产生20-30％的胚泡。

可以将线性化的核酸构建体注射到一个原核中。接着，可以将注射的卵转移到受体雌性(即到受体雌性的输卵管中)并允许在所述受体雌性中发育以产生转基因动物。具体的，体外受精的胚胎可以在15,000Xg离心5分钟来沉淀脂质允许所述原核的可视化。可以使用EppendorfFEMTOJET注射器注射所述胚胎并可以培养直到胚泡形成。可以记录胚胎分裂和胚泡形成的比率以及质量。

可以通过手术将胚胎转移到异步(asynchronous)受体的子宫中。典型地，可以使用5.5英寸导管将100-200(例如，150-200)个胚胎沉积到输卵管的壶腹部-峡部连接(ampulla-isthmusjunction)。手术后，可以进行妊娠的实时超声检查。

在体细胞核转移中，可以将包括如上文所述的核酸构建体的转基因偶蹄动物细胞(例如，转基因猪细胞或牛细胞)例如胚胎卵裂球、胎儿成纤维细胞，成体耳成纤维细胞，或颗粒细胞导入无核的卵母细胞中来建立组合细胞。可以如下将卵母细胞去核，即在极体附近的部分带切开(partialzonadissection)，然后在切开区处压出细胞质。通常，使用具有锋利的有斜面的尖端的注射移液管来将转基因细胞注射到阻滞于减数分裂2的去核卵母细胞中。在有些惯例中，阻滞于减数分裂2的卵母细胞称作“卵”。在生成猪或牛胚胎(例如通过融合并活化卵母细胞进行)后，在活化后约20至24小时，将胚胎转移至接受体雌性的输卵管。参见例如Cibellietal.(1998)Science280,1256-1258及美国专利第6,548,741号。对于猪，可以在转移胚胎后约20-21天对接受体雌性检查妊娠。

精原干细胞提供了用于对家畜遗传修饰的第二种方法。可以在从供体睾丸分离的精原干细胞中执行体外遗传修饰或基因编辑。将修饰的细胞移植到受体的生殖细胞耗竭的睾丸中。移植的精原干细胞产生携带遗传修饰的精子，其可以用于通过人工受精(AI)或体外受精(IVF)繁育来衍生建立者动物。

可以使用标准的育种技术来创建在来自初始杂合建立者动物的外源核酸方面纯合的动物。然而，可以不需要纯合性。可以将本文中描述的转基因猪与感兴趣的其它猪育种。

在一些实施方式中，可以以不相等的量在分开的转座子上提供并且对胚胎或细胞提供感兴趣的核酸和选择标志物，其中含有选择标志物的转座子的量远远超过(5-10倍过量)含有感兴趣核酸的转座子。可以基于选择标志物的存在和表达分离表达感兴趣核酸的转基因细胞或动物。由于转座子会以精确的且不相联的方式(独立转座事件)整合入基因组中，感兴趣的核酸和选择标志物不是遗传连锁的，并且可以容易地经由标准育种通过遗传分离分开。如此，可以生成转基因动物，其不受在后续世代中保留选择标志物(即一个从公共安全性观点看有些顾虑的问题)约束。

一旦生成了转基因动物，可以使用标准技术评估外源核酸的表达。可以通过Southern印迹分析实现初始筛选以测定构建体整合发生与否。关于Southern分析的描述，参见Sambrooketal.,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManualsecondedition,ColdSpringHarborPress,Plainview；NY的9.37-9.52部分。也可以在初始筛选中使用聚合酶链式反应(PCR)技术。PCR指扩增靶核酸的规程或技术。一般地，采用来自感兴趣区域末端或超出的序列信息来设计与要扩增的模板的相反链在序列上相同或相似的寡核苷酸引物。可以使用PCR从DNA及RNA扩增特定序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。引物的长度通常是14至40个核苷酸，但是长度范围可以是10个核苷酸至几百个核苷酸。PCR记载于例如PCRPrimer：ALaboratoryManual,ed.DieffenbachandDveksler,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995。也可以通过连接酶链式反应、链置换扩增、自身维持的序列复制、或基于核酸序列的扩增来扩增核酸。参见例如Lewis(1992)GeneticEngineeringNews,12:1；Guatelli等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1874；和Weiss(1991)Science,254:1292。在囊胚阶段，可逐个处理胚胎用于通过PCR、Southern杂交和splinkerettePCR的分析(参见例如Dupuy等，ProcNatlAcadSciUSA(2002)99:4495)。

可以使用技术评估转基因猪的组织中编码多肽的核酸序列表达，所述技术包括例如对自动物获得的组织样品的Northern印迹分析、原位杂交分析、Western分析、免疫测定法诸如酶联免疫吸附测定法、和逆转录酶PCR(RT-PCR)。

干扰RNA

各种干扰RNA(RNAi)是已知的。双链RNA(dsRNA)诱导同源基因转录体的序列特异性降解。RNA诱导的沉默复合体(RISC)将dsRNA代谢为小的21-23核苷酸的小干扰RNAs(siRNAs)。RISC包含双链RNAse(dsRNase，如Dicer)和ssRNase(如，Argonaut2或Ago2)。RISC利用反义链作为引导以找到切割靶。siRNAs和microRNA(miRNAs)两者都是已知的。在遗传修饰的动物中破坏基因的方法包括诱导针对靶基因和/或靶核酸的RNA干扰，从而降低靶基因和/或靶核酸的表达。

例如，外源核酸序列可诱导针对编码多肽的核酸序列的RNA干扰。例如，与靶DNA同源的双链小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)可以用于降低该DNA的表达。可以生成用于siRNA的构建体，如记载于例如Fire等，(1998)Nature,391:806；Romano和Masino(1992)MolMicrobiol,6:3343；Cogoni等，(1996)EMBOJ,15:3153；Cogoni和Masino(1999)Nature,399:166；Misquitta和Paterson(1999)Proc.Natl.Acad,Sci.USA,96:1451；以及Kennerdell和Carthew(1998)Cell,95:1017的。用于shRNA的构建体可如MclntyreandFanning(2006)BMCBiotechnology,6:1描述的产生。一般地，shRNA转录为含有互补区的单链RNA分子，其可以退火并形成短的发夹。

找到单个的、个别的有功能的针对特定基因的siRNA或miRNA的概率是高的。例如，siRNA的具体序列的可预测性为50％，但有信心生产出的一些干扰RNAs中的至少一个是有功能的。

实施方案包括体外细胞，体内细胞，和经遗传修饰的动物例如家畜动物，其表达针对基因的RNAi，例如发育阶段的选择性基因。例如RNAi可以是选自由siRNA、shRNA、dsRNA、RISC和miRNA组成的组。

诱导型系统

诱导型系统可用于控制基因的表达。已知各种允许在时空上控制基因表达的诱导型系统。数个已被证明在体内转基因动物中是有功能的。术语诱导型系统包括传统的启动子和诱导型基因表达元件。

诱导型启动子的例子是四环素(tet)-开((tet)-on)启动子系统，其可以用于调节核酸的转录。在此系统中，突变的Tet阻抑物(TetR)与单纯疱疹病毒VP16反式激活物蛋白的激活域融合以创建四环素控制的转录激活物(tTA)，其受到tet或多西环素(dox)调节。在缺乏抗生素的情况中，转录是最小程度的，而在存在tet或dox的情况中，转录得到诱导。备选的诱导型系统包括蜕皮激素或雷怕霉素(rapamycin)系统。蜕皮激素是一种昆虫蜕皮激素，其生成受到蜕皮激素受体和超气门蛋白(ultraspiracle)基因(USP)产物的异二聚体控制。通过用蜕皮激素或蜕皮激素类似物诸如MuristeroneA处理诱导表达。对动物施用以触发诱导型系统的药剂称为诱导剂。

四环素诱导型系统和Cre/loxP重组酶系统(组成型的或诱导型的)是更为常用的诱导系统。四环素诱导型系统包括四环素控制的反式激活子(tTA)/反向tTA(rtTA)。在体内使用这些系统的方法包括产生两个遗传修饰的动物品系。一个动物品系在选择的启动子的控制下表达激活子(tTA、rtTA或Cre重组酶)。另一组转基因动物表达接纳体(acceptor)，其中接受tTA/rtTA反式激活子(或侧翼为loxP序列)的靶序列控制感兴趣的基因(或要修饰的基因)的表达。将两个品系的小鼠相交配提供了基因表达的控制。

四环素依赖的调控系统(tet系统)依赖两个组分，即四环素控制的反式激活子(tTA或rtTA)和以四环素依赖方式控制下游cDNA表达的tTA/rtTA依赖的启动子。在缺乏四环素或其衍生物(如强力霉素)的情况下，tTA结合到tetO序列上，允许tTA依赖的启动子的转录激活。然而，当存在强力霉素时，tTA不能与其靶相互作用且不发生转录。使用tTA的系统被称为tet-OFF，因为四环素或强力霉素允许转录下调。四环素或其衍生物的施用允许暂时控制体内转基因表达。rtTA是tTA的变体，其在缺乏强力霉素时是无功能的，但需要配体存在用于反式激活。因此这种系统被称为tet-ON。已在体内将tet系统用于如编码报告基因、原癌基因或参与信号级联的蛋白的数个转基因的诱导表达。

Cre/lox系统使用Cre重组酶，其通过在两远端(distant)的Cre识别序列间，即loxP位点，发生交换而催化位点特异性重组。引入到两loxP序列间的DNA序列(称为floxedDNA)被Cre介导的重组所切除。使用空间控制(带有组织或细胞特异性启动子)或时间控制(带有诱导型系统)在转基因动物中控制Cre的表达导致对两loxP位点间DNA切除的控制。一种应用是条件性基因失活(条件性敲除)。另一种方法用于蛋白过表达，其中将floxed终止密码子插入到启动子序列和感兴趣的DNA之间。直到Cre表达，遗传修饰的动物才表达转基因，导致切除floxed终止密码子。这一系统已经应用于组织特异性癌变和B淋巴细胞中受控的抗原受体的表达。还开发了可诱导的Cre重组酶。只有当施用外源配体时该可诱导的Cre重组酶才被激活。诱导的Cre重组酶是融合蛋白，其含有原来的Cre重组酶和特异的配体结合结构域。Cre重组酶的功能活性依赖于能够结合到融合蛋白中该特异性结构域的外部配体。

实施方式包括体外细胞、体内细胞和经遗传修饰的动物例如家畜动物，其包含受控于诱导系统的基因。动物的遗传修饰可以是基因组的或嵌合的。所述诱导系统例如可以是选自由Tet-On、Tet-Off、Cre-lox和Hif1alpha组成的组。实施方案是本文所列出的基因。

建立者动物、动物系、性状和繁殖

可通过克隆和其它本文中描述的方法生产建立者动物。建立者动物可以是用于遗传修饰的纯合子，如在合子或原代细胞经历纯合修饰的情况中。同样，也可将建立者生产为杂合子。建立者可以是基因组修饰的，这意味着它们基因组内的所有细胞都经历修饰。建立者可以是用于修饰的嵌合体，如可发生在当将载体引入到胚胎(通常在胚泡期)的多个细胞之一中。可检测嵌合动物的子代以鉴定基因组修饰的后代。当建立了能够有性繁殖的或通过辅助生殖技术繁殖，具有持续表达修饰的纯合或杂合后代的动物池(poolofanimals)时，动物系被建立。

在家畜中，已知许多等位基因与多个性状诸如生产性状、类型性状、可加工性(workability)性状、和其它功能性状关联。技术人员习惯于监测和量化这些性状，例如Visscher等，LivestockProductionScience,(1994)40:123-137,US7,709,206,US2001/0016315,US2011/0023140,和US2005/0153317。动物品系可以包括选自下组的性状：生产性状、类型性状、可加工性性状、生育力性状、育儿(mothering)性状和疾病抗性性状。进一步的性状包括表达重组基因产物。

实施方案包括选择具有一个或多个此类性状，或遗传导入性状的动物，和修饰其基因组来包括标记的精子。

重组酶

本发明的实施方案包括将靶向性核酸酶系统与重组酶(例如RecA蛋白，Rad51)或其它与DNA重组相关的DNA结合蛋白一同施用。重组酶与核酸片段形成细丝，并且实际上搜索细胞DNA来寻找与序列基本同源的DNA序列。例如重组酶可以与充当HDR模板的核酸序列组合。接着，重组酶与HDR模板组合以形成细丝并放入细胞中。重组酶和/或与重组酶组合的HDR模板可以作为蛋白、mRNA，或用编码重组酶的载体置于细胞或胚胎中。美国公开文本2011/0059160(美国流水号12/869,232)的公开内容通过提述特此并入本文中用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明书为准。术语重组酶指代遗传重组酶，其在细胞中酶促催化两条相对较长的DNA链之间相对短的DNA部分的连接。重组酶包括Cre重组酶，Hin重组酶、RecA、RAD51、Cre，以及FLP。Cre重组酶是来自PI噬菌体的I类拓扑异构酶，其催化loxP位点之间的DNA的位点特异性重组。Hin重组酶是由198个氨基酸组成的21kD蛋白，其存在于细菌沙门氏菌属(Salmonella)中。Hin属于DNA转化酶的丝氨酸重组酶家族，其中它依赖于活性位点丝氨酸来启动DNA切割和重组。RAD51是人类基因。由该基因编码的蛋白是RAD51蛋白家族的成员，其辅助DNA双链断裂的修复。RAD51家族成员与细菌RecA和酵母Rad51同源。Cre重组酶是实验中用来删除侧翼有loxP位点的特定序列的酶。FLP指代衍生于面包酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的2μ质粒的翻转酶(Flippase)重组酶(FLP或Flp)。

本文中，“RecA”或“RecA蛋白”指代RecA样重组蛋白家族，其具有基本上全部或大部分相同的功能，特别是：(i)将寡核苷酸或多核苷酸正确定位到其同源目标以用于DNA聚合酶的后续延伸的能力；(ii)在拓扑学上制备双链体核酸以合成DNA的能力；和(iii)RecA/寡核苷酸或RecA/多核苷酸复合物高效寻找并结合互补序列的能力。表征得最好的RecA蛋白来自于大肠杆菌；除了蛋白的最初等位形式外，已鉴定了许多突变体RecA样蛋白，例如RecA803。此外，许多生物体具有RecA样链转移蛋白，包括例如酵母、果蝇(Drosophila)、哺乳动物(包括人)，以及植物。这些蛋白包括例如Rec1、Rec2、Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad51E、XRCC2以及DMC1。重组蛋白的一个实施方案是来自大肠杆菌的RecA。或者，RecA蛋白可以是大肠杆菌的突变体RecA-803蛋白，来自另一种细菌来源的蛋白，或来自另一种生物体的同源重组蛋白。

组合物和试剂盒

本发明还提供组合物和试剂盒，其含有，例如，编码位点特异性核酸内切酶，CRISPR，Cas9，ZNFs，TALENs的核酸分子，它们的多肽，含有这些核酸分子或多肽的组合物，或工程化的细胞系。还可以提供对于指示的等位基因基因渗入(introgression)有效的HDR。这些物品可以用作，例如，研究工具或在治疗上使用。

实施例

除非另有说明，材料和方法，包括TALENs的制造，一般如2012年8月24日提交的美国流水号13/594,694中所述。

实施例1：用于Y染色体修饰的TALENs

转染-培养成纤维细胞并如之前所述通过核转染转染。(Carlson等，2011)。在该实验中转座子组分合计1μg。对于同源性依赖修复(HDR)分析，选择了对于双链断裂(DSB)诱导的最佳进行条件，且添加与TALEN质粒相等，3和10倍过剩的修复模板。细胞培养-通过96孔板中在预先确定的密度进行个体集落的分离来产生30-50％的孔中的集落。插入删除检测群体-设计侧接靶位点的引物以产生～500bp的扩增子。使用核酸酶(Transgenomic,OmahaNE)按照建议处理PCR扩增子，并在8-10％的聚丙烯酰胺凝胶上解析。克隆并测序来自插入删除阳性胚泡的扩增子的一部分来表征突变。插入删除检测集落-如上文所使用的侧接靶位点的引物用于使用高分辨率解链分析qPCR预混物(HighResolutionMeltanalysisqPCRmastermix，Invitrogen)的扩增并进行解链曲线分析。实时PCR产物的解链概貌的变化将区分携带TALEN诱导的突变的克隆和野生型序列。来自非转染对照细胞的扩增子的解链温度的标准变化将用作参考。克隆具有超出标准变异的解链概貌的扩增子并测序来表征突变。Y靶向检测-使用一个同源臂外部的引物和一个内部的引物开发PCR试验，使得仅如果已经发生同源重组时可能产生产物。通过全基因组扩增Southern印迹验证PCR阳性的集落。使用REPLI-gMini试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)的半反应根据“血液或细胞的扩增”方案在个体克隆上进行WGASouthern印迹来确认Y-靶向-WGA。Southern印迹的探针杂交来验证靶细胞的5’和3’结(junction)。FACS-制备新鲜的精液用于分选具有X-和Y-的精子细胞，通过将1500万精子放置到1mlBTS中，其中Hoechst33342加到浓度为6.25μM。将该制备物在35℃孵育45分钟。使用改进的流式细胞仪通过DNA含量分选具有X-和Y-的精子，其中所述流式细胞仪具有用于精子分选的标准改进(Johnson等，1987；JolinsonandPinkel,1986)。通过X和Y靶标的定量PCR确定分选的群体的准确度。血清激素测量-使用来自EndocrineTechnologies(Newark,CA)的商业化试剂盒测量睾酮和FSH的血清水平。

制造了四种TALEN对，其针对Y染色体基因添加的两个候选基因座(图4)。第一个候选物定位于SRY的3’端1.7kb处，在两个最高级别的多聚腺甘酸化信号的范围之外。第二个候选基因座是AMELY基因的Y特异性内含子。基于与牛的比较以及猪:牛比较基因图谱数据，预测这些基因座位于SSCY的拟常染色体边界之外(Quilter等，2002；VanLaere等，2008)。因此，它们不能与SSCX或常染色体进行重组，因此预期经过众多代保持在SSCY上。测试的四种TALEN对中有三种表现出了高活性(图4)。

实施例2：分离单-和双-等位基因KO克隆

Carlson等，2012描述了对家畜中的目标基因的修饰，其中当与标准密度(>150个细胞/cm²)的非转基因成纤维细胞(饲养细胞)一同铺板时，转基因原代成纤维细胞有效地扩增并作为集落分离，并使用上文应用的转座子共选择技术进行药物选择(Carlson等，(2011)TransgenicRes.,20:1125和2012年5月9日提交的美国公开文本2012/0220037)。这些技术对于制造体细胞的遗传变化是有用的，所述体细胞可以用于克隆动物。

作为例子，分离使用六种TALEN对处理的细胞的嘌呤霉素抗性集落，并评价它们的基因型。一般来说，插入删除阳性克隆的比例与基于第3天修饰水平的预测相似。对于7种不同TALEN对中的6种鉴定了双等位基因敲除克隆，发生于高达百分之35的插入删除阳性细胞中。在大多数的例子中，插入删除是纯合的(每个等位基因上相同的插入删除)而不是在每个等位基因上独特的插入删除，表明姐妹染色单体作为模板的修复是普遍的。值得注意的是，在这些修饰的克隆中，对于大多数TALEN对，如果染色体切割作为单独的事件处理的话，双等位基因修饰的频率(17-60％)超过了基于第3天修饰水平的预测(10-17％)。

实施例3：家畜细胞中TALEN介导的切割作为HDR的靶标

靶向猪低密度脂蛋白受体(LDLR)基因的第四个外显子的TALEN对(LDLR4.2)与超螺旋质粒Ldlr-E4N-stop共转染，所述质粒含有对应猪LDLR基因的同源臂和使得HDR时新霉素磷酸转移酶能够表达的基因诱捕(genetrap)。培养3天后，PCR分析表明，即使没有抗生素选择，可以在30℃靶向的基因座处检测到对应HDR事件的条带。使用遗传霉素(G418)对培养细胞14天的群体的选择导致HDR细胞的显著富集。

实施例4：用于模板的单链DNA

Tan等，2013描述了使用单链DNA的模板驱动的基因修饰。对于TALEN刺激的HDR，单链寡脱氧核苷酸(ssODNs)是有效的模板。靶向基因座来将11碱基对BelgianBlue牛突变基因渐渗到Wagyu细胞中。设计了两种76碱基对的ssODN来模拟包括所述11碱基对删除的BBGDF8基因的正义或反义链。将四微克的编码TALEN的质粒转染到Wagyu细胞中，而0.3nMol的ssODNs与TALENS共转染，或在TALEN核转染24小时后通过MirusLT1(M)试剂或LipofectamineLTX(L)试剂递送。第三天的半定量PCR表明了在TALEN转染24小时后使用LIPOFECTAMINELTX试剂递送ssODNs的情况下高达5％的等位基因转化频率。在针对所述靶标涉及的正义和反义ssODNs之间没有观察到PCR信号的差异。

实施例5：使用寡HDR将等位基因导入猪(Ossabaw)细胞中

Tan等(2013)描述了使用编码TALENs的mRNA和单链寡核苷酸的组合修饰细胞以将一个物种中天然存在的等位基因置入另一个物种中(物种间迁移)。选择了PiedmonteseGFD8SNPC313Y作为例子并导入Ossabaw猪细胞中。在任意阶段，这些细胞中没有使用标志物。使用0.4nmolssODN在猪和牛细胞之间观察到了HDR中相似的峰(未示出)，然而，在Ossabaw成纤维细胞中通过更高浓度的ssODN，HDR没有消除。

实施例6：CRISPR/Cas9设计和产生

根据他们的方法将基因特异性gRNA序列克隆到ChurchlabgRNA载体中(AddgeneID:41824)。通过hCas9质粒的共转染或从RCIScript-hCas9合成mRNA提供Cas9核酸酶。该RCIScript-hCas9通过将Xbal-Agel片段从hCas9质粒(包含hCas9cDNA)亚克隆到RCIScript质粒中来构建。除了使用KpnI进行线性化外，如上文进行mRNA的合成。

实施例7：CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9介导的HDR用于将p65S531P突变从疣猪基因渗入到常规的猪中。参考图5，组a)通过在猪p65(RELA)的核苷酸1591处的T-C转化产生S531P错义突变。该S-PHDR模板包括诱发性的TC转化突变(大号字体)，其引入新的XmaI位点并使得能够RFLP筛选。与先前实验中使用的p65.8TALENs一起示出了两种gRNA序列(P65_G1S和P65_G2A)。组b)使用S-P-HDR寡聚物(2μΜ)，两种量的编码hCas9的质粒(0.5μg对2.0μg)；以及五种量的G2A转录质粒(0.05至1.0μg)转染长白猪(Landrace)成纤维细胞。将每个转染的细胞分为60:40并分别在30和37℃培养3天，接着在37℃延长培养直到第10天。Surveryor试验表明活性范围从16-30％。组c和d)第3天和第10天取样细胞的RFLP分析。通过黑色箭头指示了191和118bp的预期切割产物。尽管DSB与目标SNP紧密接近，但对于S531P的基因渗入，CRISPR/Cas9介导的HDR比TALENs效率低。也使用每种gRNA序列分析了个体集落。

实施例8：CRISPR/Cas9

在猪APC中比较TALENs和CRISPR/Cas9介导的HDR。参考图6，组a)相对于野生型APC序列示出了APC14.2TALENs和gRNA序列APC14.2Gla。下方，示出了HDR寡聚物，其递送4bp插入(见文字)，产生新的HindIII位点。使用2μΜ寡HDR模板，以及1μgTALENmRNA，编码hCas9的DNA和gRNA表达质粒各1μg；或1μg编码hCas9的mRNA和0.5μggRNA表达质粒转染的猪成纤维细胞接着分离并在30或37℃培养3天，接着在37℃扩增直到第10天。组b)显示RFLP和Surveyor试验结果的图表。如先前确定的，TALEN刺激的HDR在30℃最有效，而CRISPR/Cas9介导的HDR在37℃最有效。对于该基因座，TALEN比CRISPR/Cas9系统更有效刺激HDR，尽管通过SURVEYOR试验测量的DNA切割频率相似。与TALENs相反，当hCas9作为mRNA递送时，相对于作为质粒递送HDR中仅存在极小的差别。

实施例9：靶向Y染色体

使用TALENs和质粒同源性基因盒的组合将mCaggs-EGFP基因盒靶向Y染色体。为了这一实验的目的，当转基因基因盒和内源基因(SRY或AMELY)两者的定向相同时为正定向，当它们定向相反时，为负定向。在单个100μl电穿孔中，将一微克TALENmRNA加上500ng同源性基因盒与600,000个细胞混合。使用NEON电穿孔系统(LifeTechnologies)转染细胞，在30℃培养3天，并以低密度铺板用于得到单细胞衍生的集落。通过接合PCR(junctionPCR)使用同源臂外部的一个引物和转基因基因盒范围内的第二引物分析集落中对Y染色体的正确靶向。几个集落对于预期的扩增子是阳性的。图8是图7中示出的结果的总结。Y靶向阳性的克隆范围为6-24％。所述转基因基因盒的定向似乎对Y靶向的效率有一些影响。

实施例10：对Y染色体的短同源性靶向

质粒同源性基因盒的一种替换方案是线性模板，其具有开发用于靶向AMELY和SRY位点的短(50-100bp)同源臂。通过对泛素EGFP基因盒的PCR扩增创建所述同源性模板，其使用结合该基因盒的5’和3’末端的引物，且所述同源性模板包括对应假定的TALEN诱导的双链断裂的序列5’和3’的尾部，如描述于Orlando等，2010(NAR；2010Aug；38(15))。所述引物包括前两个核苷酸之间的硫代磷酸酯键，来抑制被内源性核酸酶降解。在典型的100μl电穿孔中包括两微克的TALENmRNA(或没有作为对照)和1μg对每个位点特异性的短同源性模板。电穿孔后，将细胞分开用于在30或33℃培养三天，接着通过接合PCR测试Y靶向。在30或33℃培养的细胞在5’和3’接合处对于Y靶向都是阳性的，虽然产物强度说明在30℃时Y靶向更有效。对于每个位点，对应正确Y靶向的扩增子依赖于TALEN，注意SRY3’接合的顶部条带是非特异性背景信号。转染后培养14天的细胞群体应当不再表达非整合的模板。对第14天的群体进行了EGFP的FACs，来确定TALEN加上短同源性模板的组合，相对于单独模板，是否增加EGFP阳性细胞的比例。确实，当包括TALEN时，EGFP阳性细胞富集了～3倍，且观察到极小的温度影响(图10)。对单个EGFP阳性集落进行基因分型分析了Y靶向。对于AMELY，来自最初分别在30或33℃培养的细胞的0/5(0％)和2/5(20％)的EGFP阳性集落对于Y靶向也是阳性的(图11)。对于SRY，来自最初分别在30或33℃培养的细胞的5/24(21％)和0/9(0％)的EGFP阳性集落对于Y靶向也是阳性的(图11)。

实施例11

建立了一系列的三种SleepingBeauty转座子来携带假定的顺式限制转基因，所述转基因在猪ACE,CK-15或SP10启动子的指导下，所有的这些都由申请人的团队基于与小鼠的比较数据最先克隆。如Carlson等，2011中所述通过原核注射SleepingBeauty转座子产生了小鼠(图12)。接着，首先通过睾丸中的EGFP转基因的qRT-PCR分析转基因小鼠F0或F1(图13)。虽然在ACE或CK-15转基因中没有观察到显著的表达，使用SP10启动子在F0和F1小鼠中都存在显著的表达。这一结果不是预期的，因为直系同源鼠ACE和CK-15启动子可靠地在小鼠精原细胞中表达(Langford,KG等，1991；Albanesi等，1996)。通过免疫组织化学(IHC)检测分析了睾丸中EGFP表达的定位。信号在曲细精管的区域中富集，与正常的精子发生过程一致(图14)。最后，通过IHC分析了附睾精子的EGFP表达。与qPCR一致，仅在来自SP10建立者的精子中检测到了信号。观察到建立者SP10-11具有多拷贝的cisX转基因，其由高F1传递频率指示。

免疫组织化学

睾丸样品制备。从安乐死的雄性小鼠收集的睾丸组织纵向平分，以形成大约40μm长x40μm直径的两半。将组织置于4％PFA/10％蔗糖的PBSpH7.2中过夜并在-70℃包埋于OCT化合物中。其后，将包埋的组织储存在-80℃。冷冻切片切成6μm，在载玻片上空气干燥至少30分钟，并在冷丙酮中后固定5分钟。

染色。使用压力锅法在柠檬酸盐缓冲液pH6.1(Dako)中处理载玻片用于抗原恢复。玻片在含有0.125％Triton-X100的PBS中通透5分钟并在PBS中洗涤一次，接着浸没在封闭缓冲液[含有2.5％羊血清(DGS),2.5％胎牛血清(FBS)的PBS]中50分钟。在PBS中洗涤一次玻片，5分钟，并添加以1:200稀释于具有DGS和FBS各1.25％的PBS中的200μl一抗，多克隆兔抗GFP(Abcam,ab290)。作为阴性对照(二抗对照)的玻片接收200μl封闭缓冲液。玻片在潮湿的室中4℃孵育过夜。在PBS中洗涤玻片(5次换液，每次5分钟)，并添加200μl，4μg/ml二抗，缀合ALEXAFLUOR594(Invitrogen)的山羊抗兔IgGF(ab')₂。在室温暗处孵育玻片1小时。在PBS中洗涤玻片(5次换液，每次5分钟)并装在含有DAPI的水性封固剂中，如显微镜检查中所述检查。

精子样品制备。从安乐死的雄性小鼠的附睾中收集精子的等分试样到标准的精液冷冻保存媒介物中，并储存于-80℃。在1mlPBS中洗涤二十微升的每种样品(800xg，10分钟)。将精子重悬于200μl的PBS中。将12mm聚-D-赖氨酸包被的盖玻片(BDBIOCOAT/Corning)放置到24孔板的孔中。在每个盖玻片上涂布50μl重悬的精子。盖玻片在37℃干透并在100％的甲醇中固定35秒。干燥盖玻片并储存于-20℃。

染色。固定到盖玻片的精子样品在含有0.1％TRITON-X100的PBS中通透另外40分钟，并在含有DGS和FBS各2.5％的PBS中封闭1小时。盖玻片在1mlPBS中洗涤一次，5分钟，并向每个孔添加200μl一抗，多克隆兔抗GFP(Abcam,ab290)，以1:200稀释于具有DGS和FBS各1.25％的PBS中。作为阴性对照(二抗对照)的盖玻片接收200μl封闭缓冲液。24孔板中包含的盖玻片在4℃孵育过夜。在PBS中洗涤盖玻片(5次换液，每次5分钟)，并添加200μl，4μg/ml二抗，缀合于ALEXAFLUOR594(Invitrogen)的山羊抗兔IgGF(ab')₂。在室温暗处孵育玻片1小时。在PBS中洗涤玻片(5次换液，每次5分钟)。将盖玻片从孔中小心取出并使用10μl含有DAPI的水性封固剂装在玻片上，并如显微镜检查中所述检查。

显微镜检查。在NikonE800直立显微镜上检查含有睾丸和精子样品的玻片，所述显微镜装备有机动化滑台以在透射光，DIC，落射荧光，epi-polarization，以及高光谱模式下成像，使用PhotometriesCOOLSNAPMYO黑白摄像机和装载在HP计算机(64位)上的NikonELEMENTSAR软件。荧光信号，其由X-Cite120LED灯源照射，通过U/B/G(三重DAPI/FITC/TexasRed)窄带立方体获得。使用NikonElementsAR软件，使用20X物镜在相等的曝光时间(TexasRed16秒/DAPI30秒)收集每种样品的组织切片成像(图13)，而使用40X物镜和每个通道20秒的曝光时间收集精子成像(图14)。

定量PCR

睾丸样品制备。从安乐死的雄性小鼠收集的睾丸组织纵向平分，以形成大约40μm长x40μm直径的两半。将一个睾丸的一半置于RNALATER(Invitrogen)中并储存于-80℃。

RNA分离和cDNA生成。从RNAlater取出睾丸样品，并使用polytron装置在含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液中遵循制造商的说明(Qiagen,RNEASY)破碎所述样品。使用RNeasy试剂盒纯化总RNA。使用两步cDNA试剂盒(QuantaBiosciences)将一微克总RNA转化为cDNA，所述试剂盒整合了寡聚dT和作为引物的随机六聚体的专有混合物。

定量PCR(qPCR)。在使用SYBR绿作为报告物的qPCR中将等量的cDNA用作模板。使用EGFP和整合素α6(Itga6)的引物在BioRadCFXConnect实时系统上运行反应，整合素α6是精原干细胞的一个标志物，用于标准化。

序列

下划线标出了Cis-X基因盒-EGFP，EGFP前面和后面的序列是Smokl的5’和3’UTR。

TGTGTGTTTGGGAGGAGCTTGTGTGTGTGAGTTGTGTTTTAAGTTTATTTGCGTGTGAGTACCTTTGGGTTTTTGTGTGTGTCTGTGTGTGTTTGTGTGTGTATAACTGTGGGTGACTGTAAGTGCACCTGTGTGTTTGTACGTGAGTGTGTAAGACTGTGTGTGTGCACAAGAGCGTGTGTAGGTGCACGTGTTGTAGGTGTGAGAACACCTGTTGTGTTTAGGCCATCAGTCAGCTTGGTCATTGTTTCTAAGGTAGCATTTATACTTTGTTACCTCAAGTGGGCTCTGGGAGTCAACAGAAGTCAGAAAAGCTCAGATCCAAGCCCCCTTTTTCTGACCTCGAGACCATGGCCAGGAACGTCACGAAACGGAAAAACAGGTGC CGCGGACATCAGAAGGCTATTTACAAGAAAAAGTCTGTGAGCAAGGGCGAGGAG CTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGC CACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTG ACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCG TGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAA GCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCAC CATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGA GGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGA CGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTA TATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCA CAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCC CATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCC GCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTC GTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGTCGAGATATGTCGACGACACAGGAAGGGTGTCAGGAGAACGAGCATTCGGCTCGGCACAGGTACATTTTTGTATTTGAATGTATCTATGTTACTCATGTCTGTGTCAACTGGCAGACATGTGCTTTTGCATTTTAGAAGATCACTAGAGGATGCCGGATGCTATGATTCAACAGTTATAGTATTGGAAAGGACCCATGTATAGACATGGACCTGCAAAAGGGAACCTTGTGGAAAGGCATCATGTTCTGGGTCCAGCCAGAGGGAAGAAAGCAAATGATGAAATCCCAGATGGTCTCCGGGATCACCATTCCGAGCAGGGGCTGAAAGCCTGTCCAAAGCTGGTAGAGACAAAAGCCCCTCTGCCTACCCAGGGTCATAATCAGACTCCTGCTCTGAGAATAAAATAGATGTTTGTGAAAGATG(SEQIDNO：11)

猪SP10启动子

CAGTGGGTTAGGGATCTGGTGTTGCCGTGAGCTATGGTGTAGGTTGCAGACATGGCTTGGATCCTTCGAAGGCCGGCAGCAACAGCTCCAATTAGACCCCTAGCCTGAGAATCTCCATATGCCACAGGCGTGGCCCTAAAAGGACAAAAGACAAAATAAAGAAAGAAACAAAGAATCAAACAAGAAATCACCAGCTACTCTCACCTCACTGTCAAGAATACTTTAAAAAGAGAGTTTACGTTATTTTGGTGATAAGATTTTTTAAGGTAGGGCAGAACCCCAACACACCATTGTACACATGGTGAATTGGCCTTCACAGGTACAGTCTGCTCTAGGTTTGCCAGAGGGCCAACCTGCCTGCACAGGTGCCATGAGGACCTCAGCACAGCCCATTGTGAGGAAACATGGATTGTTTCTGAGGTTCTAGAATTTCCAGATGCTGTGGCTCAGCACTGGGAGCTTCTGCTCATAGGTTTTCTTCACGGCTCTTGG(SEQIDNO：12)

猪ACE启动子：

ATTGACTGAGTGGGCCTCCTGGCTGGCATGGGGCAAGACAAATGTCCCCCCCTTCCAAAGCTCCTAGTTCCCTGTGTCTTAATGCTGCTGTCCTTGCCATCCAGTGGGGGCAGAAGTGGCCAGAGGTGGGGCAAAAGGGCCAGGGCAGCAGTAGTGGACCCCAGTCAGAGGTCCCTGTGCCCACAGTGCCACTCTGCCTAACAGGGCAGTGCTGCAGGCAGGCTCCTCGCGGCCCTGGCAGGAGGTGCTGAAGGACATGGTTGGCTCAGGGGCCCTGGACGCTCAACCATTGCTCGACTACTTCCAGCCGGTCACACAGTGGCTAGAGGAGCAGAACCAGCGGAGCGGCGATATCCTGGGCTGGCCAGAATATCAGTGGCGCCCACCGATGCCCGACAATTACCCGGAGGGCATTGGTAAAGCCGGGAGGGAGACGGGGCGGGGCGCTACGGAGGGCTCTGGGCTGGGCTCTGGCCCCAGGCCCTGGGTTCATGGCTCCAATCAGCTTCTCCCAGCTGGGATAT(SEQIDNO:13)

猪CK-15启动子

CCGGGTTCGGAAGATTCCTCTCCCCACCCCCACCGCCCCCAAGGAGCATTTTAGAGCCGTAGTTAGAAAGCAGAGTGCCATTTGCAGTGTGGTAACCAAAAGCAGAGGAAATAGAGTTTCTTCATGTTCCAACTGCTGTCTCTTTGGAATTCTTGTTCTCATTTATAAGCCTTAAAGTGCACGCCTGTCTAAATGAGCTTTCTATGAATATATTTTTTTATATGCAATGAATTCATTTAAAACTTGGCTTTTAGGATATAGGAGCTGCTCTTAGACCATAGAGAGAGAATGATTTTAACAGCAAAAGGAGGGGGAACTTCGTGTAGTTGCAATACTCAGTGAAGCCTGTGCCTGGGTCTTTTTGAAGTTAGACCTCAAATATTGCATAGATGCTTTAGGAAGTGTGATCGGGGCAGGGAATCAAGAGAAAGTAATTAACAGTTGATAAGGAGATTGGGGATGGAAGAGAATGATGGAACCAAAACAAGGAGCCAGGGCTCTTAGAAGGGTAAGAGGAATTCATTAGAAAATGGGGCTCACAGAATAGAATGTGGTTACAGATCTTACCCTCTCGTGTCCTTGGTGACATTTCCAAACAATTGCCAAACTAAACGAGGTTTTAGGATAGCTGAAATCAAGAGCCTCTTCCCCATGTCCTTGAGAGGTGTCAAACTGAAGTTGCAAACATTTTAGAAACTCTTTAGAAAAAGACCTTCAAAGAGAAACATGCAAAATGAGTTTTCCATTTTAAAAAAATGATACGACTGTTTATCACGTATTTTCCTATGAATGAAAGCAGTCCTAAGAAGAAAAAAGCATTTATCTGAGTTGGTTTCGAAAGCGATTATAGCAATTAAAGTCCTCACGATGTGAAATACACATTTGAACATCATTCACAGCGCAATTTGGATGTTTATTTTTGGTGCACCGAATAGTTTAAGTGTAAAGCAAAAATATTGGCACCATATAACATAGGCAGCATTCTAGCATTAAACATAGCTTTCCCTCTTGAAAAGTTTAAAATAAATTTCAGTGGTTTTCTTTTGTCCCCCCGA(SEQIDNO:14)

本文列出的所有公开，专利申请，以及专利在此通过提述并入本文用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明书为准。

其它公开

实施方案，其包括，例如：

一种经遗传修饰的精子细胞，所述精子细胞包含X染色体或Y染色体，其包含由所述精子细胞表达的外源序列。所述序列可以是顺式限制的，例如顺式限制的转基因。实施方案包括实施例11中所述列出的那些。2.1的精子细胞，其包含X染色体。3.1的精子细胞，其包含Y染色体。4.1-3任一项的精子细胞，其中所述外源序列编码静电分选试剂。5.1-3任一项的精子细胞，其中所述外源序列编码可视化试剂。6.0的精子细胞，其中所述可视化试剂选自下组：荧光标志物，染料，DNA嵌入型荧光染料，钙激活染料，以及不透射线剂。7.1-3任一项的精子细胞，其中所述外源序列编码毒性分子。8.0的精子细胞，其中所述毒性分子选自下组：毒素，核酸酶，凋亡因子，以及致命显性阴性物。9.0的精子细胞，其中所述毒性分子是毒素或选自下组的毒性基因产物：TOXIN基因，Barnase，白喉毒素A，胸苷激酶，以及蓖麻毒蛋白毒素。10.1-3任一项的精子细胞，其中所述外源序列编码毒素的解毒剂。11.0的精子细胞，其中所述解毒剂/毒素组合包含Barnase/Barstar。12.1-3任一项的精子细胞，其中所述外源系列编码结合抗原的抗体的至少一部分。13.1-3任一项的精子细胞，其中所述外源序列编码外源表位。14.1-3任一项的精子细胞，所述外源序列编码生物素，亲合素，或聚His。15.1-3任一项的精子细胞，其中所述外源序列有效地损害精子运动性。16.1-3任一项的精子细胞，其中所述外源序列是融合蛋白的一部分。17.0的精子细胞，其中所述融合蛋白是外源序列与编码定位于精子质膜的蛋白的序列的融合物，精子的质膜指代所述精子细胞外部的质膜。18.0的精子细胞，其中所述融合蛋白是外源序列和编码选择性地定位于选自下组的精子部分的蛋白的序列的融合物：头部，中段，尾部，鞭毛，末段，主段，以及颈部。19.1-0任一项的精子细胞，其中所述外源序列在所述精子的外部表达。20.1-0任一项的精子细胞，其中所述外源序列表达于所述精子细胞的内部。21.一种经遗传修饰的动物，其产生如1-0任一项中的精子细胞。22.0的动物的后代，其表达如1-0任一项中的精子细胞。23.从0或0的动物产生的精子。24.一种分选精子的方法，包括创建如1-0任一项中的动物。25.一种精子分选的方法，包括基于至少一种生物表达的标志物的存在，或不存在，将含有X染色体的精子从含有Y染色体的精子分离。26.0的方法，进一步包括创建建立者动物，其产生所述精子。27.0的方法，其中所述生物表达的标志物选自下组：荧光标志物，染料，DNA嵌入型荧光染料，钙激活染料，不透射线剂，可见光波长中的颜色，荧光波长中的颜色，荧光，射线不透性，外源表位，结合配体，和抗体的至少一部分。28.0或0的方法，包括使用所述标志物使精子可视化。29.0或0的方法，包括使用FAC-SORT或精子选择设备。30.0或0的方法，包括使所述生物表达的标志物与特异性结合所述标志物的配体结合。31.0或0的方法，包括使所述生物表达的标志物与固体表面结合，所述固体表面包含与所述标志物特异性结合的配体，或使复数个精子通过交联体互相结合，所述交联体表达复数个与表达的标志物特异性结合的配体。32.0的方法，其中所述分离基于精子运动性。33.0的方法，其中所述分离包括活/死试验。34.0的方法，其中所述标志物选自下组：毒性物质和解毒剂。35.一种用于精子分选的系统，包括包含表达标志物的X染色体的精子，或包含表达标志物的Y染色体的精子，或包含表达第一标志物的X染色体的精子与包含表达第二标志物的Y染色体的精子的混合物；以及选择性地结合所述标志物的结合部分，例如，对所述标志物具有特异性结合的配体，或基本仅与所述标志物而不是其它精子结合的物质。36.0的系统，其中所述结合部分固定化到固体表面或聚合物。37.0的系统，其中所述结合部分附接到毒性物质，所述毒性物质损害由所述配体结合的精子细胞。38.0的系统，其中所述结合部分是选自下组的配体：亲合素，生物素，结合所述标志物的抗体的至少一部分，特异性结合所述标志物的肽，适体，和特异性结合所述标志物的核酸。39.0的系统，其中所述标志物用于阴性选择。或者，其中所述标志物用于阳性选择。40.一种用于精子分选的系统，包括包含表达标志物的X染色体的精子，或包含表达标志物的Y染色体的精子，或包含表达第一标志物的X染色体的精子与包含表达第二标志物的Y染色体的精子的混合物；其中提供所述标志物用于通过可视化分离。41.一种经遗传修饰的家畜动物，所述动物包括X染色体或Y染色体上的外源基因，所述基因在所述动物的精子中表达标志物。42.40或41的动物，其中所述外源基因在配子发生中选择性活化的基因表达元件的控制下。43.0的动物，其中所述外源基因在可诱导启动子的控制下。44.0或0的动物，其中所述染色体是Y染色体。45.0或0的动物，其中所述染色体是X染色体。46.0-0的动物，其中所述基因表达元件包括选自下组的启动子：细胞周期蛋白A1启动子，Stra8，SP-10启动子，Stra8启动子，C-Kit，ACE，和鱼精蛋白。47.0-0的动物，其中所述外源基因编码所述因子与microRNA的融合物。48.一种具有经标记以指示每个精子中性染色体的性别的精子的动物。49.0的动物，其中所述性染色体是X且所述X染色体具有所述标志物。50.0的动物，其中所述性染色体是Y且所述Y染色体具有所述标志物。51.1-50任一项的用途。用于制造1-50任一项的试剂盒。

表1：使用HDR等位基因克隆的频率

Claims (32)

1.经遗传修饰的家畜动物，所述动物产生包含标志物的精子，所述标志物用于选择具有X染色体的精子或具有Y染色体的精子。

2.权利要求1的动物，其中所述X染色体包含编码所述标志物的外源基因。

3.权利要求1的动物，其中所述Y染色体包含编码所述标志物的外源基因。

4.权利要求1的动物，其中所述标志物由可诱导启动子控制下的外源基因表达。

5.权利要求1的动物，其中所述标志物由基因表达元件控制下的外源基因表达，所述基因表达元件在配子发生中选择性活化。

6.权利要求5的动物，其中所述基因表达元件包含选自下组的启动子：细胞周期蛋白A1启动子，Stra8，SP-10启动子，Stra8启动子，C-Kit，ACE，和鱼精蛋白(protamine)。

7.权利要求1的动物，其中所述标志物由编码所述标志物和microRNA的融合物的外源基因表达。

8.权利要求1的动物，其中所述标志物由外源基因表达且所述标志物选自下组：选择标志物，静电分选试剂，可视化试剂，和外源抗原。

9.权利要求8的动物，其中所述标志物是可视化试剂且选自下组：荧光标志物，染料，DNA嵌入型荧光染料，钙活化染料，以及不透射线剂。

10.权利要求8的动物，其中所述标志物是选择标志物。

11.权利要求10的动物，其中所述选择标志物是毒性分子。

12.权利要求11的动物，其中所述毒性分子选自下组：毒素，核酸酶，凋亡因子，以及致命显性阴性物(fataldominantnegative)。

13.权利要求11的动物，其中所述毒性分子是选自下组的毒素或毒性基因产物：TOXIN基因，Barnase，白喉毒素A，胸苷激酶，和蓖麻毒蛋白毒素。

14.权利要求10的动物，其中所述选择标志物包含毒素的解毒剂。

15.权利要求8的动物，其中所述标志物是抗原，其中所述抗原选自下组：生物素，亲合素，以及聚His。

16.权利要求1的动物，其中所述标志物包含损害精子运动性的因子。

17.权利要求1的动物，其中所述标志物表达在所述精子的外部，且具有对双分子因子的特异性结合。

18.权利要求1的动物，其中所述标志物是融合蛋白的一部分，所述融合蛋白包含所述精子天然所有的蛋白。

19.权利要求18的动物，其所述精子天然所有的蛋白选自下组：外部蛋白，内部蛋白，头部，中段，尾部，鞭毛，末段，主段，和颈部。

20.权利要求1的动物的精子。

21.一种精子分选的方法，包括基于生物表达的标志物的存在或不存在，将包含X的染色体的精子与包含Y染色体的精子分离。

22.权利要求21的方法，其中所述生物表达的标志物选自下组：荧光标志物，染料，DNA嵌入型荧光染料，钙活化染料，不透射线剂，可见光波长中的颜色，荧光波长中的颜色，荧光，射线不透性，外源表位，结合配体，和抗体的至少一部分。

23.用于精子分选的系统，包含

包含表达标志物的X染色体的精子，或

包含表达标志物的Y染色体的精子，或

包含表达第一标志物的X染色体的精子与包含表达第二标志物的Y染色体的精子的混合物；

和

选择性地结合所述标志物的结合部分或使用所述标志物以分选精子的装置。

24.经遗传修饰的精子细胞，所述精子细胞包含X染色体或Y染色体，其包含由所述精子细胞表达的外源序列。

25.权利要求24的精子细胞，其包含所述X染色体。

26.权利要求24的精子细胞，其包含所述Y染色体。

27.权利要求24-26任一项的精子细胞，其中所述外源序列编码静电分选试剂，可视化试剂，标志物，毒素，配体，抗原，解毒剂。

28.权利要求27的精子细胞，其中

所述可视化试剂选自下组：荧光标志物，染料，DNA嵌入型荧光染料，钙活化染料，和放射不透剂，

所述毒性分子选自下组：毒素，核酸酶，凋亡因子，致命显性阴性物，TOXIN基因，Barnase，白喉毒素A，胸苷激酶，和蓖麻毒蛋白毒素，或

所述解毒剂/毒素包含Barnase/Barstar。

29.权利要求24-26任一项的精子细胞，其中所述外源序列编码结合抗原的抗体的至少一部分，外源表位，生物素，亲合素，或聚His。

30.权利要求24-26任一项的精子细胞，其中所述外源序列有效地损害精子运动性。

31.权利要求24-26任一项的精子细胞，其中所述外源序列是融合蛋白的一部分。

32.权利要求24-26任一项的精子细胞，其中所述外源序列是顺式限制的。