CN1414975A - 性染色体特异性蛋白质,种特异性和精子特异性蛋白质以及它们的鉴定和分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了与动物精子细胞膜相关联的性染色体特异性分子，以及分离它们的方法。具体描述了在SDS－PAGE上具有表观分子量为32kDa的X染色体特异性分子(蛋白质)。该方法涉及从动物精细胞制备细胞膜级分；用一种或多种物质处理该细胞膜级分，所述物质结合细胞膜级分中的X或Y染色体特异性分子并且X或Y染色体特异性分子与所述物质之间形成结合物；分离细胞膜级分中不结合所述物质的材料，获得含有性染色体特异性分子的亚级分。还描述了使用这种性染色体特异性分子确定精子性别的方法。

Description

性染色体特异性蛋白质，种特异性和 精子特异性蛋白质以及它们的鉴定和分离方法

发明领域

本发明涉及新的性染色体特异性分子，种特异性和精子特异性蛋白质，更具体地说，涉及X性染色体特异性和Y性染色体特异性蛋白质，鉴定和分离它们的方法，以及它们的使用方法。

发明背景

关于在哺乳动物中分离携带Y-和X-染色体的精子已经进行了大量研究，以降低性连锁遗传病的发生率或者提高动物食品产量(参见Windsor等，1993；Gledhill，1988，和Amann，1989)。以Y-和X-精子之间的各种明显差异为基础进行了分离尝试，所述Y-和X-精子之间的各种明显差异是例如密度(Harvey，1946；Sumner和Robinson，1976)，pH敏感性(Rothschild，1960)，游动速度(Ericsson等，1973；Rhode等，1973)，表面电荷(Kaneko等，1984；Cartwright等，1993)，精子对交联葡聚糖的粘附(Steeno等，1975；Adimoelja，1987)，H-Y抗原含量(Goldberg等，1971；Peter等，1993；Sills等，1998)，活力特征(Sarkar，1984；Sarkar等，1984)，DNA含量(Pinkel等，1982；Johnson等，1989)，大小，头部形状，和质量(参见Windsor等人的综述，1993，Reprod.Fert.Dev.5：155)。

迄今为止，这些方法中，证明只有以DNA为基础的技术始终是可重复的。用挑选的精子人工授精(AI)或者体外受精(IVF)结果表明牛，兔和猪的性别比例向期望的方向有所改变(Morrell等，1988；Johnson等，1989；Cran等，1993)。但是，即使是该方法也不会用于商业上，因为产生的活精子少，而且分类挑选需要长时间。另外，由于染色程序，其中DNA本身被标记，并且精子暴露于激光束，仍保留关于突变的可能性和从该精子产生的后代长期存活力降低的顾虑。而且所需的设备大，固定不动并且昂贵，而且需要高度熟练的操作者。

很多人曾尝试过从精子表面鉴定和纯化性别特异性蛋白质，但是这样的蛋白质是否存在于精子表面还在争论之中(Fenner等，1992；Cartwright等，1993；Hendricksen等，1996；Howes等，1997)。在很多哺乳动物物种中报道过携带Y-染色体的精子上的“雄性特异性”抗原，即所谓H-Y(组织相容性，Y-染色体)，例如牛，山羊，猪，大鼠和绵羊(参见Wachtel等，1988)。该H-Y抗原曾被用作对携带Y-和X-染色体的精子进行分类和分离的标记(Ali等，1990；Peter等，1993)。但是，其它人报道过使用H-Y抗原标记物未成功分选出携带Y-和X-染色体的精子(Hendriksen等，1993；Sills等，1998)。一致的意见是H-Y抗原不能分开X和Y精子。

Fabricant等，(美国专利No.4,722,887)，描述了以精细胞表面磺基糖脂的差异表达为基础通过聚合相分离区分X-和Y-精子的方法。

Spaulding，(美国专利No.5,021,244)描述了将精子分类为富集携带X-和Y-染色体制备物的方法。Spaulding使用DNA含量和细胞分选技术来分离亚群。Spaulding只曾获得纯度70-80％的X或Y精子。Johnson能够实现90-95％纯度。Spaulding要求鉴定胞外蛋白质并且要求提供一长列仍需鉴定的蛋白质。Spaulding还提出这些蛋白质可以用来产生抗体，但是他的工作没有提供任何数据支持这样的抗体的存在。此外，如美国专利No.5,021,244中所述，Hoechst染色和UV技术可以引起DNA的变化。最后，Spaulding假设亚群是各种类型精子的富集，但是Spaulding没有验证，各分离组的精子事实上是X-精子和Y-精子。事实上，Howes等(1997)和Hendricksen(1996)利用美国专利No.5,021,244中教导的方法，不能从精子鉴定任何性别特异性抗原。他们工作的结论是象Spaulding这样的鉴定精子性别的方法是不可能成功的。

Blecher(WO国际专利公开No.WO 97/07399)描述了利用异种抗原免疫产生抗胎牛非性别特异性抗原的抗体的方法。使用抗非性别特异性抗原的抗体去除抗原物质的非性别特异性成分，从而富集残留性别特异性分子的抗原物质。纯化之后，使用性别特异性物质来产生异种相反性别(雌性抗雄性或雄性抗雌性)抗体。

发明概述

本发明人鉴定了来自动物精子的性染色体特异性蛋白质(X-SCSPs或Y-SCSPs)，并且发展出一种鉴定和分离这样的来自动物精子的性染色体特异性蛋白质(X-SCSPs或Y-SCSPs)的方法。SCSP是一种蛋白质，其由各性染色体上的基因编码或者由另一个染色体上的基因编码，并且处于性别特异性染色体上的基因的直接或间接调控之下。本文使用的“X-染色体特异性分子”指与Y精子相比，在X精子之中或之上特异性或占优势的任何分子或表位。本文使用的“Y-染色体特异性分子”指与X精子相比在Y精子之中或之上特异性或占优势的任何分子或表位。这样的分子优选是蛋白质。本文使用的“X精子”指携带X性染色体的精子。本文使用的“Y精子”指携带Y性染色体的精子。

从动物精子分离雄性和雌性性染色体特异性分子为大量制备具有高亲和性的抗体提供可能。这些抗体可用于区别动物精细胞的性别，并且提供同时具有高特异性(即较少假阳性)和高敏感性(较少假阳性)的区别性别的非侵入方法。

因此本发明提供鉴定与动物精子细胞膜相结合的性染色体特异性分子的方法，其包括：

(a)给第二和第三动物注射来自第一物种(SP1)动物的全精子或精细胞级分，其中第二和第三动物属于第二物种(SP2)，并且SP2动物是雄性和雌性各一种；

(b)收集第二和第三SP2动物产生的抗体；

(c)将来自第二和第三SP2动物的抗体分别与来自SP1动物的精子细胞膜级分反应；

(d)分离细胞膜级分中不与抗体结合的物质和抗体以及来自第二和第三SP2动物的各抗体的结合物质；

(e)分离结合物质和抗体，得到结合的和未结合的亚级分；

(f)比较来自第二SP2动物抗体的结合物质和来自第三SP2动物抗体的结合物质，并且将另一动物抗体结合物质中不存在的第二和第三SP2动物抗体之一的结合物质鉴定为性染色体特异性分子；和

(g)分离性染色体特异性分子。

优选从牛精子细胞膜获得细胞膜级分，最优选细胞膜级分是质膜级分。可以使用的其它膜包括顶体膜，线粒体膜或内质网膜。

根据另一个实施方案，本发明提供纯化和分离的性染色体特异性分子，优选是一种蛋白质，其特征如下：(a)X染色体特异性；(b)可以与牛精细胞的细胞膜相结合，优选在SDS PAGE上具有大约6kDa至大约40kDa的分子量。

根据本发明的优选实施方案，提供性染色体特异性分子，优选是一种蛋白质，其特征如下：(a)X染色体特异性；(b)可以与来自牛精子组织的精子的质膜相结合；和(c)根据十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，具有大约32千道尔顿(kDa)的分子量。

根据本发明的优选实施方案，提供具有下面特征的纯化和分离的性染色体特异性蛋白质：

(a)X染色体特异性；

(b)可以与牛精细胞的细胞膜结合；和

(c)在SDS-PAGE上的分子量和pI范围选自：24，5-5.5；23，4.8-5.3；21，5.3-5.8；20，5.3-5.8；14，4.8-5.3；和15，5-5.5。

根据另一个实施方案，本发明提供具有下面特征的纯化和分离的性染色体特异性蛋白质：

(a)Y染色体特异性；

(b)可以与牛精细胞的细胞膜结合，优选该蛋白质在SDS-PAGE上的分子量是大约5kDa至大约50kDa，更优选其分子量范围是大约10kDa至大约25kDa。

根据本发明的优选实施方案，提供具有下面特征的纯化和分离的性染色体特异性蛋白质：

(a)Y染色体特异性；

(b)可以与牛精细胞的细胞膜结合；并且在SDS-PAGE上的分子量和pI范围选自：27，5-6.5；20，5-5.5；9，5-5.6；9，5.3-5.8；和5，5.3-5.8。

根据另一个实施方案，本发明提供具有下面特征的纯化和分离的性染色体特异性分子，优选是一种蛋白质：

(a)X染色体特异性；

(b)可以与猪精细胞的细胞膜结合，优选该蛋白质在SDS-PAGE上的分子量是大约20kDa至大约100kDa。

根据本发明的优选实施方案，提供具有下面特征的纯化和分离的性染色体特异性蛋白质：

(a)X染色体特异性；

(b)可以与猪精细胞的细胞膜结合；并且

(c)分子量和pI范围选自：99-100，5.3-5.7；43，5.3-5.7；53，6.1-6.7；31，5-5.6；30，6-6.5；和25，7.5-9。

根据另一个实施方案，本发明提供具有下面特征的纯化和分离的性染色体特异性蛋白质：

(a)Y染色体特异性；

(b)可以与猪精细胞的细胞膜结合，优选该蛋白质在SDS-PAGE上的分子量是大约5kDa至大约50kDa。

根据本发明的另一个优选实施方案，提供具有下面特征的纯化和分离的性染色体特异性蛋白质：

(a)Y染色体特异性；

(b)可以与猪精细胞的细胞膜结合；并且

(c)分子量和pI范围分别选自：36-37和6.2-6.8。

使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子，或者其异构体或部分，可以与其它分子例如蛋白质，多肽结合，和/或它们可以被糖基化。

本发明为构建对编码用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子的核酸分子独特的，并因此对所述性染色体特异性分子，或者其异构体或者其部分独特的核苷酸探针提供可能。因此，本发明还涉及包括编码用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子的核苷酸序列的探针。该探针可以用例如可检测物质标记，并且它可以用来从核苷酸序列的混合物中筛选编码性染色体特异性分子或者其部分的核苷酸序列。

从组织分离的或者重组产生的使用本发明方法鉴定的分子可以用来制备抗体。因此本发明进一步涉及具有抗使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子或者该分子的异构体或者部分的表位的特异性的抗体。可以用可检测物质标记抗体并且它们可以用来检测组织样本中的性染色体特异性分子。

可以使用通过本文描述的方法鉴定的性染色体特异性抗原和抗这样的性染色体特异性分子的表位的抗体来提高后代是期望的性别或者它们将携带或者不携带性染色体连锁特征的基因的概率。

以测定可以与细胞膜(优选质膜)相结合的性染色体特异性分子的存在为基础，抗使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子表位的抗体可用来区分雄性和雌性胚胎。因此，本发明还涉及区别雄性和雌性的方法，其包括在抗体与性染色体特异性分子之间形成结合物的条件下，将胚胎或者胚胎的培养基与对使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子的表位特异性的一种或多种抗体接触，并检测该结合物。用抗雄性-特异性分子抗体检测出结合物则确定为雄性，用抗雌性-特异性分子抗体检测出结合物则确定的雌性。

使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子可以用来鉴定具有编码性染色体特异性分子，优选性染色体特异性蛋白质，更优选在SDS-PAGE上测得分子量大约32kDa的雌性性染色体特异性蛋白质的序列的核酸分子。因此，根据本发明的一个实施方案，提供含有编码使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子的序列的纯化和分离的核酸分子。

可以将编码性染色体特异性分子的核酸分子或者其片段插入到合适的表达载体中，即，包含转录和翻译插入的蛋白质-编码序列所需要的元件的载体。因此，可以构建适合宿主细胞转化的重组DNA分子，其包括编码使用本发明方法鉴定的分子的核酸分子，和与该核酸分子可操作连接的一个或多个转录和翻译元件。

可以使用重组分子来制备表达本发明的核酸分子编码的分子或者其部分的转化宿主细胞。因此，本发明进一步提供含有本发明重组分子的宿主细胞。

本发明进一步提供使用通过本文描述的方法鉴定的纯化的和分离的核酸分子制备性染色体特异性分子，或者其异构体或者其部分的方法。

本发明进一步涉及从天然精液中分离决定雄性和雌性的精子的方法，其包括用一种或多种抗使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子的抗体处理天然精子，在决定雄性或雌性的精子与抗体之间形成结合物，并且分离该结合物和没有结合抗体的精子。

抗使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子的表位的抗体也可以与使精子失活的细胞毒素偶联。例如，这可以通过包被精子的抗体实现，然后用光活化激活细胞毒素。或者，可以使用磁珠方法或者凝集作用。容易理解，可以使用本领域技术人员显而易见的任何其它类似方法。

本发明涉及通过施用免疫原性量的使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子来免疫雌性抗X-精子，Y-精子，或者两者，从而提高特定性别后代的概率，或者降低生育力。也可以使用抗本发明的性染色体特异性分子表位的抗体和补体，在体外或体内杀死X-精子或Y-精子。具体地说，可以在交配之前将抗本发明的性染色体特异性分子表位的抗体和补体放入雌性动物的生殖道中来杀死X-精子或Y-精子。

使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子也可以用来检测样本中对性染色体特异性分子特异性的抗体的存在。

本发明还涉及用于进行本发明方法的试剂盒，其包括抗使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子表位的抗体，和用于进行本发明方法的合适的载体。

本发明的其它特征和优点可通过下面的详细描述变得显而易见。但是要理解详细描述和指出本发明优选实施方案的具体的实施例只是为了举例说明，因为通过详细描述，在本发明精神和范围内的各种变更和修改对本领域技术人员是显而易见的。

附图说明

参照附图，将更好理解本发明，其中：

图1是显示与抗胎儿组织抗体反应的精子膜抗原的蛋白质印迹。

图2是精子膜级分的SDS-PAGE分析。

图3是猪X精子样本的二维聚丙烯酰胺凝胶分析。

图4是猪Y精子样本的二维聚丙烯酰胺凝胶分析。

图5是牛X精子样本的二维聚丙烯酰胺凝胶分析。

图6是牛Y精子样本的二维聚丙烯酰胺凝胶分析。

发明详述

1.表征使用本发明方法鉴定的分子

本发明人使用本文描述的方法鉴定了X-性染色体特异性分子。如图1和图2所示，在精子物质中鉴定了性染色体特异性蛋白质，其特征在于与牛精细胞质膜结合。该分子在SDS-PAGE上的分子量大约32 kDa。本发明的X-染色体特异性分子包括在SDS-PAGE上测定的分子量从大约6kDa至大约40kDa，优选从大约31kDa至大约33kDa的那些分子。本发明的Y-染色体特异性分子包括在SDS-PAGE上测定的分子量从大约50kDa至大约200kDa，优选从大约50kDa至大约90kDa的那些分子。

本发明方法可以用来分离具有编码性染色体特异性分子的序列的核酸分子。例如，可以确定性染色体特异性分子的部分氨基酸序列，在该氨基酸序列的基础上可以合成DNA探针，该探针可以用来筛选从产生性染色体特异性分子的细胞的mRNA构建的cDNA文库，或者基因组DNA文库。可以分离含有与该探针杂交的cDNA或基因组DNA的克隆，通过例如测序，或者通过在真核表达系统中表达cDNA并且鉴定产生与性染色体特异性分子特异性抗体结合的蛋白质的克隆，可以鉴定编码该分子的cDNA或基因组DNA序列。还可以使用部分氨基酸序列来创建在扩增编码性染色体特异性分子的基因的PCR中使用的引物。可以对PCR-分离的基因测序并且将其插入表达载体中作克隆。

因此，根据本发明的实施方案，提供含有编码本发明性染色体特异性分子的序列的纯化和分离的核酸分子。

本发明包括所述核酸分子的片段。在一个实施方案中，所述片段包括具有至少15个碱基并且能够在本文所述严格杂交条件下与编码性染色体特异性分子的核苷酸序列杂交的片段。

也可以理解包括本发明的核酸分子或者其片段的双链核苷酸序列(其中所述分子或片段通过氢键与互补核苷酸碱基序列结合)，和该核苷酸序列转录产生的RNA都包括在本发明中。

此外，要明白本发明包括与本文所述的那些序列具有实质序列同一性的其它核酸或氨基酸序列。术语“具有实质序列同一性的序列”指有轻微或者不重要的序列变异的核酸和氨基酸序列，即所述序列与实际序列功能基本相同，并产生基本相同的多肽。所述变异可以归纳为局部突变，多态，或者结构修饰，或者交叉物种同源性的最小差异。

严格杂交条件是严格到足以提供特异性，减少错配数目，并且还具有足够的灵活性使得以可接受的速率形成稳定杂合体的那些条件。这样的条件对于本领域技术人员是已知的并且描述于例如Sambrook等，(1989，分子克隆，实验室指南(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，冷泉港)。

本发明进一步提供本发明的性染色体特异性分子的氨基酸序列和与该氨基酸序列具有实质同一性的序列。本发明还进一步提供了对本发明的性别特异性分子独特的肽。优选所述肽具有至少10至20个氨基酸，但是长度也可以短至5个氨基酸。

本发明核酸分子中包含的核酸序列或者其片段可以相对它们正常状态反向转录以产生反义核酸分子。利用化学合成和利用本领域公知方法的酶连接反应可以构建所述反义核酸分子。本发明的反义核酸分子或者反义序列片段优选包含至少15个碱基，其可以使用天然存在的核苷酸或者为了提高分子的生物稳定性或者提高与mRNA或基因形成的双螺旋的物理稳定性而设计的各种经修饰的核苷酸，例如硫代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸化学合成。使用以重组质粒，噬菌粒或减毒病毒形式引入细胞中的表达载体可以生物学制备反义序列，在载体中反义序列的产生在高效调控区控制之下，载体所引入的细胞类型可以确定其活性。

II.鉴定性染色体特异性分子的方法

如上所述，本发明涉及鉴定与动物精细胞优选细胞膜更优选精细胞质膜结合的性染色体特异性分子的方法。使用本发明方法鉴定的分子，特别是性别特异性分子，包括糖蛋白，脂蛋白和磷蛋白、多肽，和肽以及这些分子的复合体。

本文描述的方法可以应用于任何种群的动物，其中性别特异性分子在进化中足够保守，因此所述方法适用于很多种动物。例如，它可适用于哺乳动物，鸟类物种，爬行动物，和鱼类，优选商业上重要的哺乳动物，包括牛，狗，猫，马，猪和绵羊的。也适用于人。

根据本发明方法的一个实施方案，通过使用来自动物的全精子制备物可以鉴定与动物精子细胞膜结合的性染色体特异性分子。全精子制备物优选是没有分类的，即，没有特别富集X-或Y-精子。在另一个实施方案中，可以对分类的精子进行相同的方法。

根据该方法，从第一动物，优选牛或猪，获得全精子制备物。但是，如上所述，第一动物可以是哺乳动物，鸟类，爬行动物或者鱼类。然后将来自第一SPl动物的精子制备物注射至雄性第二SP2动物和雌性第三动物(反之亦然)。雄性和雌性第二和第三SP2动物可以是同窝的交配同胞动物，甚至可以是近交同窝的交配同胞。并且，第二和第三SP2动物可以再次选自兔，绵羊，大鼠，小鼠，马，牛、山羊，和/或类似或相应的动物(就非哺乳动物物种例如各种家禽来说)。但是，如本文使用的第二和第三SP2动物包括动物王国的所有成员。在优选实施方案中，SPl动物是牛，第二和第三SP2动物是兔。根据用牛精子免疫雄性和雌性兔的实施方案，免疫导致雄性兔抗牛精子抗体和雌性兔抗牛精子抗体的产生。在SPl和SP2都是哺乳动物物种的优选实施方案中，通过异种免疫制备的雌性抗-Y精子抗体和雄性抗X-精子抗体制备物可以被进一步处理来保证制备物只含有分别抗雌性性染色体特异性分子或雄性性染色体特异性分子的抗体。可以使结合精子质膜中X或Y染色体特异性分子的抗体固相化以有利于分离含有抗体和相应的特异性分子的结合物的亚级分。可以使同样没有处理的雄性兔抗-牛精子抗体和雌性兔抗-牛精子抗体固相化以有利于分离含有结合物的亚级分。例如，抗体可以与合适的载体结合。下面讨论可以进行固相化的方法和合适载体的例子。

根据其中使用没有处理过的雄性和雌性兔抗-牛精子抗体的实施方案，将雄性兔抗-牛精子抗体与来自第一动物的精子细胞膜级分制备物反应。分别将雌性兔抗-牛精子抗体也与来自第一动物的精子细胞膜级分制备物反应。来自第一动物的精子细胞膜级分可以是用来提供全精子制备物的相同动物。但是，对于该方法目的，精子细胞膜级分不需要来自相同的第一动物，而是可以来自相同物种的另一个第一动物。

从各前述雄性兔抗-牛精子抗体和雌性兔抗-牛精子抗体之间的反应分离没有结合的物质和结合的物质，提供各雄性和雌性抗体的结合制备物和各制备物的没有结合的级分。

然后处理结合物以释放结合物质，产生来自各雄性和雌性抗体的亚级分。

任选地，然后可以将各亚级分与相反抗体反应，即，从雌性兔抗-牛精子抗体结合物释放的亚级分与雄性兔抗-牛精子抗体反应；而从雄性兔抗-牛精子抗体结合物释放的亚级分与雌性兔抗-牛精子抗体制备物反应。和前面一样，分离结合物和没有反应的物质，接着结合物质释放成两种分离的亚级分。在两种情况下，然后用拆分它们各个成分的合适的方法处理亚级分，例如，SDS-PAGE或2-D凝胶电泳，蛋白质层析，包括例如凝胶过滤和离子交换层析。比较两种亚级分拆分的结果，一个亚级分的一种拆分方法中提示存在一种分子，但是在另一个亚级分的相应的拆分中该分子没有出现，则将该分子指定为性染色体特异性分子。例如，从与雄性兔抗-牛精子抗体结合物释放的物质与从雌性兔抗-牛精子抗体释放的物质在SDS-PAGE上跑胶。来自雄性抗体的物质的凝胶上出现一条条带，但是来自雌性抗体的物质的凝胶上没有出现该条带，或者来自雄性抗体的物质的凝胶上出现的条带显著深于来自雌性抗体的物质的凝胶上的条带，则反映X-染色体特异性分子的存在。相反，任何在来自雌性兔抗牛精子抗体结合物的凝胶上出现，而在来自雄性抗体的物质的凝胶上没有出现的条带反映Y-染色体特异性分子的存在。然后根据本文描述的技术分离该分子。

所述方法也涉及首先从动物制备精子组织样本。所述组织样本优选从细胞膜获得，例如质膜(外膜)，顶体膜，线粒体膜，和内质网膜，最优选质膜。例如，可以如下获得质膜级分。对于精子膜溶解，可以根据Klint(1985)，Fenner(1992)和Hendriksen(1995)描述的方法作修改并使用。例如可以用HEPES缓冲盐水(质量/升，ddH₂O中：8.76g NaCl；2.38g HEPES，pH7.2)将公牛精液洗涤三次，合并并且在25℃下以600×g离心10分钟。可以加入Triton X-100至终浓度0.5％(v/v)。向每毫升洗过的精子应该加入10微升100X蛋白酶抑制备物“鸡尾酒合剂”(质量/毫升，ddH₂O中：30.2mg EDTA；357微克甲苯磺酰氟；81.2mg NEM；811微克胃蛋白酶抑制备物A)。然后在冰上振荡试管1小时并且在4℃下以107,000×g离心1小时，并对其进行蛋白质分析。根据另选的实施方案，可以利用成腔分离膜囊泡，优选氮气成腔(参见例如，Gillis等，制备生物化学(Prep.Biochem.)，8，pp.363-378，1978)。然后可以通过沉淀离心获得主要由来自精子头部，尾部和其它微粒的头部细胞膜和一些尾部细胞膜组成的细胞膜囊泡，优选离心两次，以2500×g离心大约30分钟。然后可以将含有细胞膜成分的上清液离心(例如100,000×g)，获得要在本发明方法中使用的物质。该物质可以在HEPES-缓冲盐水(10mM，pH 7.2)中重悬和洗涤。

在本发明实施方案中，通过首先制备X和Y富集精子级分可以从精子制备物获得细胞膜级分。可以以X-和Y-精子的DNA含量为基础制备富集级分。根据该实施方案，将精子制备物进行流式细胞仪分析，其基于这样的事实，即X精子含有的DNA比Y精子多，而在用结合DNA的荧光染料(Hoechst 33342)处理之后X-精子表现出比Y-精子稍强的荧光。在另一个实施方案中，用抗雄性或雌性胚胎或胎儿抗原的抗体处理精子制备物，获得X-和Y-精子富集制备物。

使用获得的膜级分制备免疫接种物。例如，用从SP1动物分离的精子细胞膜级分对雄性和雌性SP2动物免疫。从而雌性SP2产生抗-Y性染色体特异性SP2抗体，而雄性产生SP2抗-X性染色体特异性抗体。选择第一和第二动物物种，使得SP2动物产生抗不同性别SP1动物的性染色体特异性分子的抗体，但是彼此相似足以(进化上足够保守)不产生抗来自相同性别的性染色体特异性分子的抗体。但是，可以在第三物种中产生抗性别特异性分子的抗体，因此关于以进化距离为基础选择SP2没有限制。

第一和第二动物物种可以选自兔，绵羊，大鼠，小鼠，马，牛，山羊，和猪，和/或类似或相应的动物(对于非哺乳动物物种如各种家禽来说可以考虑)。但是，如本文使用的动物包括动物王国的所有成员。在本发明的实施方案中，用牛精细胞质膜级分免疫雄性和雌性兔，产生雄性兔抗-牛精子抗体和雌性兔抗-牛精子抗体。

通过异种免疫制备的雌性抗Y-精子抗体和雄性抗X-精子抗体制备物可以被进一步处理以确保该制备物只分别含有抗雌性性染色体特异性分子的抗体和抗雄性性染色体特异性分子的抗体。

可以使与质膜级分中X或Y染色体-特异性分子结合的抗体或者其部分固相化，以有利于分离含有抗体与X或Y染色体-特异性分子的结合物的亚级分，以及含有非性染色体特异性分子的亚级分。例如，抗体可以与合适的载体结合。合适的载体的例子是琼脂糖，纤维素，葡聚糖，交联葡聚糖，琼脂糖凝胶，羧甲基纤维素聚苯乙烯，滤纸，离子交换树脂，塑料薄膜，塑料管，玻璃珠，多胺-甲基乙烯基醚-马来酸共聚物，氨基酸共聚物，乙烯-马来酸共聚物，尼龙，丝绸等等。载体的形状可以是例如管状，壳板状，珠，片，球状等。

利用已知的化学或物理方法例如溴化氰偶联，可以通过使物质与合适的不溶性载体反应制备固相化抗体。

通过传统分离技术可以从含有非性染色体特异性分子的亚级分分离抗体与X或Y染色体特异性分子的结合物，例如盐析，层析，电泳，凝胶过滤，分级分离，吸收，聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝集，或者它们的组合。当抗体被固相化后，可以使用常规方法洗脱结合物。

在本发明实施方案中，利用本领域公知的技术，通过分子大小和/或pI来分离性染色体特异性分子。根据Sambrook，J.等(分子克隆：实验室指南(Molecular Cloning A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，Sections 6.3-6.9，1989，在本文引作参考)所述的标准操作，可以利用电泳来分离性染色体特异性分子，并且通常使用载体例如凝胶片或板(例如，聚丙烯酰胺，琼脂糖或者其它聚合物)作为支持介质。优选使用以例如分子大小和pI两个特征为基础分离蛋白质的二维凝胶；最优选使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS/PAGE)，或者固定pH梯度凝胶SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(IPG SDS/PAGE)来分离性染色体特异性分子。使用常规方法，例如Lee等(1987，分析生物化学(Analyt.Biochem.)166：308)描述的方法可以从凝胶洗脱或去除性染色体特异性分子。

III.制备利用本发明方法鉴定的分子

可以使用上述方法分离编码使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子的核酸分子或其片段并且测序，或者使用本领域公知方法通过化学合成和酶促连接反应构建所述核酸分子。

利用重组DNA方法可以制备本发明的性染色体特异性分子，或者其异构体或部分。相应地，可以用已知方法将具有编码性染色体特异性分子的序列的核酸分子或者其片段插入合适的表达载体，其保证该分子或者其异构体，或者其部分很好的表达。可能的表达载体包括但不限于粘粒，质粒，或者修饰的病毒，只要该载体与使用的宿主细胞相容。

因此本发明涉及包含编码使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子的核酸分子，或者其片段，和插入序列转录和翻译必需的元件的重组分子。合适的转录和翻译元件可以来自多种来源，包括细菌，真菌，病毒，哺乳动物，或者昆虫基因。对合适的转录和翻译元件的选择取决于所选择的宿主细胞，这是本领域技术人员容易实现的。这样的元件的例子包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，包括翻译起始信号。另外，取决于所选择的宿主细胞和使用的载体，可以向表达载体插入其它遗传元件，例如复制起点，附加的DNA限制位点，增强子，和赋予转录可诱导性的序列。也可以理解天然基因和/或其侧翼区可以提供必要的转录和翻译元件。

所述重组分子还可以包含报道基因，其有利于选择用本发明的重组分子转化或转染的宿主细胞。报道基因的例子是编码例如β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰基转移酶和萤火虫荧光素酶这样的蛋白质的基因。通过例如β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰基转移酶或萤火虫荧光素酶这样的报道蛋白的浓度变化监测报道基因的转录。这使得观察和测试重组分子的表达成为可能。

可以通过转化，转染，感染、电穿孔等将重组分子引入宿主细胞。转化转染宿主细胞等来表达外源DNA的方法是本领域公知的(参见例如，Itakura等，美国专利No.4,704,362；Hinnen等，PNAS USA 75：1929-1933，1978；Murray等，美国专利No.4,801,542；Upshall等，美国专利No.4,935,349；Hagen等，美国专利No.4,784,950；Axel等，美国专利No.4,399,216；Goeddel等，美国专利No.4,766,075；和Sambrook等，分子克隆：实验室指南(Molecular Cloning ALaboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室出版社，1989，都在本文引作参考)。

合适的宿主细胞包括多种原核和真核宿主细胞，包括细菌，哺乳动物，酵母或者其它真菌，病毒，植物，或者昆虫细胞。

也可以利用蛋白质化学领域公知的技术，通过化学合成制备本发明的性染色体特异性分子或者其异构体或者部分，例如固相合成(Merrifield，1964，美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Assoc.)85：2149-2154)或者在均质溶液中合成(Houbenweyl，1987，有机化学方法(Methods of Organic Chemistry)，E.Wansch编著，Vo1.15 I和II，Thieme，Stuttgart)。

本发明的性染色体特异性分子或者其异构体或者部分可以与其它分子例如蛋白质或者多肽偶联。可以通过重组技术将性染色体特异性分子区域或者其部分与具有期望生物学功能的选择蛋白质或标记融合，制备融合蛋白。可以用来制备融合蛋白的蛋白质的例子包括细胞毒素和免疫原性蛋白质。它们也可以与其它特定分子包括抗体偶联，来指导分子定位于特定靶位点。另外，在位点专一启动子控制下可以将编码该分子的基因插入表达载体的靶特定位点。为了提高分子的抗原性，也可以构建包含性别特异性分子编码序列和强免疫原性分子序列的遗传构建体(Tao和Levy，1993，自然(Nature)Vol.362：755-758)。

本发明还涉及筛选主要组织相容性复合体分子呈递的性染色体特异性分子的表位的方法。这可以通过以下方法来实现，即分离用性染色体特异性分子脉冲的巨噬细胞或单核细胞的质膜制备物，并且使用通过本文描述的方法获得的对性染色体特异性分子特异性的抗体分离表位。

IV.使用本发明方法鉴定的分子的应用

编码使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子的核酸分子，或者其片段，可使本领域技术人员构建可用于检测生物材料中的核苷酸序列的的核苷酸探针。可以用可检测物质标记核苷酸探针，例如放射性标记，其提供适当的信号并且具有足够的半衰期，例如³²P，³H，¹⁴C等等。其它可以使用的可检测物质包括特异性标记抗体识别的抗原，荧光化合物，酶(例如lacZ)，对标记抗原特异性的抗体，和化学发光物质。针对杂交率和探针与要检测的核苷酸序列的结合和可杂交的核苷酸的量可以选择合适的标记。标记的探针可以在固体载体例如硝酸纤维素滤膜或者尼龙膜上与核酸杂交，这一般描述于Sambrook等，1989，分子克隆，实验室指南(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)(第二版)。可以使用核苷酸探针来检测编码使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子的基因。

使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子或者其异构体和部分可以用来制备抗体。也可以针对通过如上所述在宿主细胞中表达编码该分子的核酸分子制备的蛋白质产生对该分子具有特异性的抗体。

在本文中，抗体理解为包括单克隆抗体，多克隆抗体，抗体片段(例如Fab，和F(ab’)₂)和重组产生的结合配偶体。

本领域普通技术人员可以从多种温血动物容易获得多克隆抗体，例如马，牛，猪，各种家禽，兔，山羊，绵羊，小鼠，或者大鼠。简要的说，使用性染色体特异性分子通过腹膜内，肌内，眼内，静脉内，皮下，intranondal，脾内植入，例如使用硝化纤维素作为载体，或者皮下注射，与佐剂例如弗氏完全佐剂或不完全佐剂结合，或者通过结合或者化学修饰提高抗原性，来免疫动物。几次加强免疫之后，收集血清样本并且测定其对性染色体特异性分子的反应性。特别优选的多克隆抗血清对这些测试之一会给出信号，该信号比背景至少强三倍。就其对性染色体特异性分子的反应性来说，一旦动物的效价达到平台，通过每周一次取血或者通过对动物放血可以容易获得更大量抗血清。

使用常规技术也容易获得单克隆抗体(参见Kohler和Milstein，自然(Nature)256，495-497，1975，本文引作参考；也参见单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析的新方面(Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses)，Plenum Press，Kennett，McKearn，和Bechtol(编著)，1980，和抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，Harlow和Lane(编著)，冷泉港实验室出版社，1988，本文也引作参考)。

简要的说，在一个实施方案中，对受试动物例如大鼠和小鼠注射性染色体特异性分子。为了提高所致的免疫应答，可以将该分子与佐剂例如弗氏完全佐剂或不完全佐剂混合。初次免疫之后1星期和3星期之间，可以用另一次加强免疫对动物再次免疫，并且测定对该分子的反应性。一旦动物对该蛋白质的反应性达到平台，将动物杀死，取出含有大量B细胞的器官例如脾和淋巴结。

可以通过用病毒例如EB病毒(EBV)转染将从免疫动物得到的细胞无限增殖(参见Glasky和Reading，杂交瘤(Hybridoma)8(4)：377-389，1989)。或者，为了产生分泌单克隆抗体的“杂交瘤”，使收集的脾和/或淋巴结细胞悬液与合适的骨髓瘤细胞融合。合适的骨髓瘤细胞系包括例如NS-1(ATCC No.TIB 18)，和P3X63-Ag 8.653(ATCC No.CRL1580)。

融合之后，将细胞置于含有合适的培养基例如RPMI 1640，或DMEM(Dulbecco’s Modified Eagles Medium)(JRH Biosciences，Lenexa，Kansas)，以及添加成分，例如胎牛血清(FBS，例如，得自Hyclone，Logan，Utah，或者JRH Biosciences)的培养板中。另外，培养基中应该含有一种试剂，其选择性地使融合的脾细胞和骨髓瘤细胞生长，例如HAT(次黄嘌呤，氨基蝶呤，和胸苷)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)。大约7天之后，为了测定抗性染色体特异性分子抗体的存在可以筛选所得的融合细胞或杂交瘤。可以利用很多种测试来测定抗性染色体特异性分子抗体的存在，包括，例如荧光激活细胞分选术，对流免疫电泳，放射免疫测定，放射免疫沉淀，酶联免疫吸附测定(ELISA)，斑点印迹测定，抑制或竞争测定，和夹心测定(参见美国专利Nos.4,376,110和4,186,530；也参见抗体：实验室手册(Antibodies：A LaboratoryManual)，Harlow和Lane(编著)，冷泉港实验室出版社，1988)，几次克隆稀释和反复测定之后，可以分离产生抗性染色体特异性分子抗体的杂交瘤。

也可以使用其它技术来构建单克隆抗体(参见William D.Huse等，在噬菌体入中产生免疫球蛋白成分的大重组文库(“Generation of aLarge Combinational Library of the Immunoglobul in Repertoire inPhage Lambda”)，Science(科学)246：1275-1281，1989年12月；也参见L.Sastry等，“在大肠埃希菌中克隆免疫物质来产生单克隆催化抗体：重链可变区-特异性cDNA文库的构建”(“Cloning of theImmunological Repertoire in Escherichia coli for Generation ofMonoclonal Catalytic Antibodies：Construction of a Heavy ChainVariable Region-Specific cDNA Library，”)，美国国家科学院院报(Proc Natl.Acad.Sci USA)86：5728-5732，1989年8月；也参见Michelle Alting-Mees等，“单克隆抗体表达文库：快速得到杂交瘤的选择”(″Monoclonal Antibody Expression Libraries：A RapidAlternative to Hybridomas″)，分子生物学策略(Strategies inMolecular Biology)3：1-9，1990年1月；这些参考文献描述了从Stratacyte，La Jolla，California购得的体系，其通过重组技术产生抗体)。

类似地，利用重组DNA技术引入一个基因的可变区和另一个基因的恒定区，例如非人动物可变区和人恒定区，也可以构建结合配偶体。在一个实施方案中，利用可变区的核苷酸引物扩增编码产生所感兴趣单克隆抗体的杂交瘤的可变区的基因。本领域普通技术人员可以合成这些引物，或者从商业来源购买。小鼠和人可变区引物可购自Stratacyte(LaJolla，Calif)。这些引物可以用来扩增重链或轻链可变区，然后将其分别插入载体例如ImmunoZAP^TM H或者ImmunoZAP^TML(Stratacyte)。然后可以将这些载体引入大肠埃希菌中表达。利用这些技术，可以产生大量含有V_H和V_L结构域的融合体的单链蛋白质(参见Bird等，Science(科学)242：423-426，1988)。另外，这样的技术可以用来变″鼠″抗体为″人″抗体，而不改变抗体的结合特异性。

一旦获得合适的抗体或结合配偶体，可通过本领域普通技术人员熟知的很多技术将它们分离或纯化(参见抗体：实验室手册(Antibodies：ALaboratory Manual)，Harlow和Lane(编著)，冷泉港实验室出版社，1988)。合适的技术包括肽或蛋白质亲和柱，HPLC或RP-HPLC，在蛋白质A或蛋白质G柱上纯化，或者这些技术的任何组合。

通过与纯化的抗原制备物反应可以证实抗体或结合配偶体对性染色体特异性分子的特异性。例如，可以通过将抗体与从没有雄性性染色体特异性抗原的单性生殖生物制备的组织样本反应证实抗体对雌性性染色体特异性抗原的特异性。

在本发明的一个实施方案中，通过给不同物种的合适的受体动物注射纯化的牛性染色体特异性分子产生可以与牛细胞膜结合的抗雄性-或雌性性染色体特异性分子的抗体，所述受体动物优选是兔，绵羊和山羊。图1中所示一维凝胶电泳图中的各个条带可能代表多于一种的蛋白质，这一点由二维电泳证实。因此各个条带产生的抗体是寡特异性的；也就是说，它们对少数(例如三种或四种)不同的抗原有反应性。通过使用二维电泳，优先分离单一分子并且产生单特异性抗体。特别是使用二维蛋白质印迹，鉴定最具有抗原性的，性别特异性的，和易于结合的分子。

可以使用抗性染色体特异性分子的单克隆抗体或多克隆抗体来纯化性染色体特异性抗原和检测胚胎，各种细胞和组织(例如精细胞，脾，肾，卵巢，和睾丸，提取物和细胞)，和生物材料(例如体液例如血液，尿液和囊胚腔液和羊膜液)中的性染色体特异性分子或者其异构体或者部分。为了测定其在特定细胞事件或者病理状态中的作用，也可以使用抗体来测定样本中性染色体特异性分子或者其异构体或者部分的量。具体地说，可以将本发明的多克隆和单克隆抗体用于免疫组织化学分析，例如在细胞来亚-亚细胞水平，来检测本发明的性染色体特异性分子，来将其定位于特定细胞，组织，胚胎，和生物体并定位于特定亚细胞位置，并且用来定量测定表达水平。

所述抗体还可以用来检测在组织培养和杂交瘤分析中来自特定物种的细胞。

可以使用直接方法，其中如上所述用可检测物质标记抗体。也可以使用间接方法，其中通过引入对抗性染色体特异性分子抗体具有特异性的二抗来扩增初级抗原-抗体反应。举例来说，如果对本发明性染色体特异性分子具有特异性的抗体是兔IgG抗体，则二抗可以是如上所述用可检测物质标记的山羊抗-兔免疫球蛋白G。一般情况下，可以用可检测物质标记本发明的抗体，并且基于可检测物质的存在检测本发明的性染色体特异性分子。可检测物质的例子包括各种酶，荧光物质，发光物质，生物素，磁性颗粒，微颗粒或大颗粒，和放射性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或者乙酰胆碱酯酶；合适的荧光物质的例子包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯或者藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；合适的放射性物质的例子包括放射性碘I¹²⁵，I¹³¹或者氚。抗体也可以与电子致密物质偶联，例如铁蛋白或者胶态金，其用电子显微镜容易观察。

可以通过氯胺-T方法(Greenwood等，生物化学杂志(Biochem.J.)89：114，1963)，乳过氧化物酶方法(Marchalonis等，生物化学杂志(Biochem.J.)  124：921，1971)，Bolton-Hunter方法(Bolton和Hunter，生物化学杂志(Biochem.J.)133：529，1973和Bolton Review18，Amersham International Limited，Buckinghamshire，英国，1977)，生碘方法(Fraker和Speck，生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)80：849，1978)，碘珠方法(Markwell，生物化学年鉴(Anal.Biochem.)125：427，1982)用¹²⁵I作放射性标记或者通过还原甲基化方法(Tack等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)255：8842，1980)用氚作放射性标记，来制备放射性标记物质。

可以使用已知的偶联方法(例如Wilson和Nakane，“免疫荧光和相关的染色技术”(“Immunofluorescence and Related StainingTechniques”)，W.Knapp等，编著，p.215，Elsevier/North-Holland，Amsterdam & New York，1978；P.Tijssen和E.Kurstak，生物化学年鉴(Anal.Biochem.)136：451，1984)来制备酶标记物质。可以通过将所述物质与伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯，罗丹明的衍生物(例如四甲基异硫氰酸罗丹明)，或者藻红蛋白反应制备荧光标记物质。

当使用标记的抗体时，通过测定标记的抗原-抗体结合物可以检测性染色体特异性分子。测定标记的结合物的合适的方法取决于所用的可检测物质。例如，如果标记试剂是一种酶，则可以使用对比色法，发光系统或荧光系统合适的酶底物检测性染色体特异性分子。如果标记试剂是一种荧光物质，则可以通过荧光强度来测定性染色体特异性分子的存在，如果标记试剂是一种放射性物质，则可以通过放射自显影来定位本发明的性染色体特异性分子。用各种光学方法或者计数颗粒，通过测定放射自显影照片中的颗粒密度，可以将放射自显影的结果量化。

通过与合适的载体结合可以使抗性染色体特异性分子的抗体固相化。合适的载体的例子是本文描述的。用已知的化学或物理方法例如溴化氰偶联，将所述物质与合适的不溶性载体反应可以制备固相化抗体。

在常规测定例如ELISA，放射免疫测定，抑制或竞争测定，夹心测定，斑点印迹测定，放射免疫沉淀，或者组织化学试验中可以使用所述抗体和如上所述用可检测物质标记的抗体来检测性染色体特异性分子的存在。

举例来说，可以使用所述抗体在抑制测定中检测细胞，组织或者生物材料中的性染色体特异性分子，其中将要检测材料的提取物包被在板上，使抗体与试验溶液中递增量的抗原反应，并且当使预处理过的抗体与平板中包被的抗原反应时，根据发生抑制的量，测定试验溶液中抗原存在的量。在另一种夹心方法或捕捉试验中，将纯化的抗性染色体特异性分子抗体与平板结合，引入不同量的推定来源的抗原，洗涤平板并且通过使用与生物素偶联的抗体或者抗生物素蛋白生物素化过氧化物酶指示剂测定结合的抗原的量。

可以将适合检测性染色体特异性分子的抗体和核酸探针装入方便的试剂盒中，提供包装到合适的容器中的必要材料。例如，这样的试剂盒可以包括一系列抗性别特异性分子的抗体。所述试剂盒还可以包括用于进行本发明方法的合适的载体。

本发明的抗体，核酸探针和试剂盒具有很多实际用途。用本文描述的方法鉴定的性染色体特异性分子存在于细胞的细胞膜上。通过将胚胎暴露于抗这些性染色体特异性分子的特异性抗体，有可能鉴定胚胎的性别，例如使用能与抗体结合的可检测物质。可以回收用这种方法选出的胚胎，洗掉抗体，继续在体外培养之后转移给母牛，致成功妊娠。

因此，本发明还广泛涉及区分雄性和雌性的方法，其包括在使得抗体和性染色体特异性分子之间形成结合物的条件下，将胚胎或者胚胎培养基暴露于对使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子的表位特异性的一种或多种抗体，并且检测结合物。检出抗体与Y-染色体特异性分子的结合物则确定为雄性，而检出抗体与X-染色体特异性分子的结合物则确定为雌性。可以单独、联合，或者顺序使用抗-X染色体和抗-Y染色体特异性分子抗体来区别雄性和雌性。可以使用上面讨论的常规测定例如ELISA，放射免疫测定，或者组织化学测试中具体的直接和间接方法来确定胚胎性别。

使用本文描述的方法确定性别的胚胎可以得自哺乳动物物种，包括牛，狗，猫，马，猪，山羊和绵羊。对非哺乳动物动物包括鸟类物种，鱼类和爬行动物，可以使用相似或相应动物。在某些这样的动物中，雌性是异型配子的(而哺乳动物中雄性是异型配子的)，因此，一些哺乳动物雄性性染色体特异性分子可以与这些非哺乳动物物种中的一些的雌性性染色体特异性分子同源，反之亦然。

所述胚胎可以是体外或体内受精胚胎，或者单性繁殖胚胎。

可以使用常规技术获得胚胎。例如，可以从超排卵的绵羊，山羊，猪和牛获得胚胎。可以以12小时间隔对绵羊，山羊，猪和牛注射递降的分剂的FSH-P，大约3天，接着注射前列腺素类似物(例如Ono-1052，OnoPharma.Co.Ltd.，日本)。可以用腹腔镜从山羊和绵羊中取出胚胎。牛胚胎可以在动情期和人工授精之后大约6-7天通过冲洗超排卵供体的子宫以非手术方式收集。胚胎可以在补充10％bCS的BMOC-3培养基中在37℃下在5％CO2：95％空气中培养大约6小时(Brinster，RL，1972：哺乳动物胚胎的培养(Cultivation of the mammalian embryo).于：G.Rothblat，VJ Cristfalo(编著)；“培养细胞的营养和代谢”(″Nutrition and Metabolism of Cells in Culture″)，Vol.2.纽约：Academic Press，pp.252-286)。

利用本文描述的方法可以制备对使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子的表位特异性的抗体。所采用的使得抗体与性染色体特异性分子之间形成结合物的条件是本领域公知的。可以根据抗体的类型和性染色体特异性分子的性质选择用来形成结合物的抗体的量。可以通过常规分离技术分离结合物，例如，盐析，层析，电泳，凝胶过滤，分级分离，吸收，聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝集，或者它们的组合。

对于分离胚胎优选使用下面三种技术或者它们的组合：

a)双抗体方法。可以将胚胎暴露于抗一种或多种性染色体特异性分子的抗体，接着再暴露于荧光素标记抗γ-球蛋白二抗。顺序使用抗-雄性和抗-雌性抗体，接着使用它们各自的抗体。用该方法可人工分离标记和未标记胚胎。

b)当将胚胎与抗性染色体特异性分子的抗体温育时，可以以它们的形态为基础分离胚胎，类似于Utsumi等的方法，(1993，分子生殖发育(Mol.Reprod.Devel.)36：238)。当使用抗-雄性抗体时，抗体可以可逆性延缓雄性胚胎生长而不延缓雌性胚胎生长，或者使用抗-雌性抗体时反之亦然。抗体也可以与或不与添加物，如补体一起使用，来不可逆地抑制或杀死一种性别的胚胎，基本上剩下另一种性别的纯培养物。该方法也要人工分离。

c)磁珠标记。在该方法中，将胚胎暴露于市售的用合适的抗体包被的显微镜可观察到的小磁珠(例如Olsaker等，1993，动物遗传学(Amni.Genet.)24：311)，此处所用的抗体是雄性特异性或雌性特异性抗体。将用市售的山羊抗兔免疫球蛋白包被的磁珠加入预先暴露于雄性特异性或雌性特异性抗体的胚胎。或者，可以用例如抗-兔免疫球蛋白然后用雄性特异性抗体包被磁珠，并且将磁珠直接置于合适容器中的胚胎悬液中。因为性别特异性蛋白质存在于上皮细胞表面，雄性胚胎将与磁珠上的雄性特异性抗体结合，而雌性胚胎则不结合。然后使用磁体将磁珠与附着的胚胎吸到培养皿的侧壁。也可以使用二抗和抗生物素蛋白-生物素的市售组合强化的磁珠，例如，蛋白质A或者蛋白质G包被的磁珠。

利用公知的方法例如染色体分析和/或通过DNA方法可以证实分开的胚胎的性别。

精子细胞膜含有与使用本发明方法产生的Y染色体特异性分子或者X染色体特异性分子抗体反应的分子。不同的分子，雄性-染色体特异性和雌性-染色体特异性分子分别位于两类精子，Y和X中。

因此，本发明还涉及从天然精子中分离决定雄性和雌性的精子的方法，其包括将天然精子与抗使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子的一种或多种抗体温育，在决定雄性或雌性的精子和抗体之间形成结合物，并且分离该结合物和没有与结合物结合的精子。该方法中使用的抗体是是抗从精细胞质膜制备物分离的雄性-和雌性-染色体特异性分子的抗体。

抗X-或Y-染色体特异性抗原的抗体可以分别与X-或Y-精子结合并且使其失活，并且可以，在某些情况下，阻止它们使卵子受精。没有结合抗体的精细胞可以保持成活并且具有使卵受精的活性。因此，本发明提供产生富集有活性X-或Y-精子精液样本的方法，并且因此能够提高期望性别，或者携带或不携带性染色体连锁特征的基因的后代的概率。

可以使用磁珠方法(例如如Olsaker等所述，1993，上文)来分离推定的X-和Y-精子。可以将这些例如用雄性-染色体特异性抗体包被的磁珠置于合适的容器中的精细胞的悬液中。因为性染色体特异性蛋白质存在于精细胞质膜中，Y-精细胞结合磁珠上的雄性染色体特异性分子抗体，而X-精子则不能。然后使用磁体将该磁珠吸到培养皿侧壁。回收粘附于磁珠的(Y)和不粘附的(X)两类精细胞。

也可以使用下面的方法来分离决定雄性和雌性的精子。可以将天然精子制备物暴露于结合雄性染色体特异性分子的一抗。暴露过的精子可以与专一结合一抗的二抗和免疫吸附底物的结合物一起悬浮于没有蛋白质的稀释液中，形成结合物/精子制备物，其中产生雄性或携带Y染色体的精子与底物结合。然后可以通过底物的特异性结合从底物回收精子。

该方法不需要机械操作；是无损伤的；它们不要求与细胞内结构化学结合；它们涉及最小操作；它们不昂贵；对设备和仪器要求最小，并且容易操作。

也可以使用抗使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子的抗体在体内控制后代的性别。例如，可以使用含有使用本发明方法鉴定的性染色体特异性抗原的疫苗，免疫雌性以抗X-精子，Y-精子或者两者，从而提高某一性别后代的概率或者完全降低生育力。可以控制动物(优选哺乳动物)后代的性别，通过在性交之前分别将抗X或Y染色体特异性分子的抗体和补体置入子宫或生殖道，以影响/选择精子来杀死不需要的精子，而生产更多的雌性或雄性。

抗使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子表位的抗体也可以与灭活精子的细胞毒素结合。这样，细胞毒素可以特异性定向精子。因此这些制剂可以用作避孕药。通过使精子与抗-雄性和抗-雌性抗体两者接触，抗用本文描述的方法鉴定的雄性和雌性特异性分子的抗体也可以用作避孕药。雄性和雌性特异性分子的反义序列也具有用作避孕药的用途。

使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子也可以用来检测对样本中对性染色体特异性分子特异性的抗体的存在。

对使用本发明方法鉴定的性染色体特异性分子特异性的抗体在预防人类致死性性连锁遗传病的医学领域中也是重要的。例如，可以用X或Y染色体特异性抗体产生富集有活性Y-精子的精液样，从而提高不携带性染色体连锁特征基因的后代的概率。

下面非限制性实施例详细说明本发明：

                             实施例

实施例的背景方法

制备来自精子的质膜蛋白质

从GenCor，Guelph获得新鲜精子和冷藏精子(在卵黄膨胀剂中)。对于蛋白质印迹，使用氮气成腔方法(Buhr，M.M.等(1994)；和Buhr，M.M.私人联系)。对于精子膜溶解，对Klint(1985)；Fenner(1992)和Hendriksen(1995)的方法进行改进。用HEPES-缓冲盐水(质量/L于ddH₂O中：8.76g NaCl；2.39g HEPES，pH7.2)将来自三只公牛的精液洗涤三次，集中并且在25℃下以600×g离心10分钟。可以加入TritonX-100至终浓度0.5％(v/v)。向每毫升洗过的精子加入10微升100X蛋白酶抑制备物″鸡尾酒合剂″(质量/毫升，于ddH₂O中：30.2mg EDTA；357微克苯甲磺酰氟；81.2mg NEM；811微克胃蛋白酶抑制备物A)。然后在冰上振荡试管1小时并且在4℃以107,000×g离心1小时，并且对其进行蛋白质分析。

免疫印迹(蛋白质印迹)

如Sambrook所述(分子克隆：实验室指南(Molecular Cloning：ALaboratory Manual).第二版，Vol.3，pp.18.60-18.75，1989)进行蛋白质印迹。使用蛋白质A-辣根过氧化物酶，和二氨基联苯胺为底物检测结合的抗体。事先对免疫印迹使用的所有的原始抗体进行ELISA(Hudson，1980)分析以确定效价。以1微克/孔(对于没有纯化的可溶性蛋白质)或者100ng/孔(对于半纯化或纯化的SSP)包被雌性和雄性抗原。

电泳

使用厂商说明书描述的标准Mini-Gel方法(BioRad)，通过SDS-PAGE分离蛋白质级分。凝胶在0.2％(wt/vol)考马斯蓝中染色或者用银染色。

抗胎儿膜蛋白抗体

通过4次皮下注射(sc)及随后一次肌内(im)强化对3.0-3.5kg的新西兰白兔(Maple Lane Rabbitry and Charles River Rahbitry，CharlesRiver，加拿大)进行免疫。如下用希腊字母符号代表抗血清：雌性兔抗-雄性组织-alpha(α)；雌性兔抗-雌性牛-beta(β)；雄性兔抗-雌性牛-gamma(γ)；雄性兔抗-雄性牛-delta(δ)。

抗精子膜蛋白抗体

用合并的新鲜和冷藏的精子免疫雄性和雌性兔(4×皮下(sc)和1次肌内(im))。用HEPES-缓冲盐水(HBS)Sperm TALP(蒂罗德液，白蛋白，乳酸，丙酮酸)(Rieger，E.等，生殖生育杂志(J.Reprod.Fertil.)1995；105：9l-98)将精细胞洗涤两次，室温下(RT)以200×g离心10分钟。使用该相对非严格处理是为了保存细胞存活力。在血细胞计数器中进行精子计数。每一支皮下注射液含有39.9×10⁶集中的精子+200微升弗氏不完全佐剂(FIA)；肌内强化注射液含有79.8×10⁶集中的精子+200微升FIA(根据Ambrose(J.Androl.1996；17：567-578；)，Castle(Biol.Reprod.1997；56：153-159)和Howes(1997)的修改)。分别用希腊字母epsilon(ε)和zeta(ζ)代表来自雌性和雄性兔的抗精子抗血清。这些分别是推定的″抗-Y″和″抗-X″抗血清。为了测定这些抗血清对精子膜蛋白的特异性，对冷藏精子的甲醇固定涂片进行免疫细胞化学分析。二抗是异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的山羊抗-兔IgG(Sigma Chemical Co.)(1/10，在ddH₂O中)。在Zeiss^TM IM35 UV显微镜下观察玻片。

胎儿膜蛋白纯化

利用以兔免疫前血清为配体的CNBr-激活的Sepharose 4B亲和柱(Amersham Pharmacia Biotech)将溶解的胎儿质膜蛋白质预清除。收集没有结合的和结合的洗脱级分。通过吸光度(A280)，蛋白质分析(Pierce)，SDS-PAGE和免疫印迹分析级分以排除高级脂，高级洗涤剂，低级蛋白质，非-SSP级分。

通过HPLC(Beckman Instruments，Inc./System Gold：Ultraffinity-EP columsn，0.5ml或5.0ml柱容量)对SSP进行免疫亲和富集。根据厂商说明将柱子衍生化。将β和δIgG在单一柱子上混合或者顺序在各柱子上使用。将在0.1M磷酸钾，pH7.0中的预清除的溶解的蛋白质通过该柱子。收集没有结合的级分；用含有0.5M KCl的1.0M磷酸钾，pH2.7溶液洗脱结合的蛋白质。用3千道尔顿(kDa)截断值的Centriprep-30浓缩器(Amicon，Inc.)浓缩没有结合的和结合的级分，并且通过蛋白质浓度测定，SDS-PAGE，蛋白质印迹和ELISA进行分析。

使用HPLC(Beckman Instruments Inc.)进行凝胶过滤。根据厂商说明使用Superdex 200 HiLoad 16/60制备级或者Sephacryl 16/60 HR-100(Amersham Pharmacia Biotech)，用含有0.15M NaCl的0.05M磷酸钠，pH7.0。和前面步骤一样浓缩和分析级分。根据厂商说明在Superdex75HR 10/30柱(Amersham Pharmacia Biotech)上通过大小排阻进一步分离合并的推定的SSP级分(洗脱缓冲液和下面的分析如上)。

使用0.02M Tris羟甲基氨基甲烷pH8.0，使用连续的盐梯度至1.0MNaCl，在DEAE Sephacryl柱(Amersham Pharmacia Biotech)上进行阴离子交换层析。和前面一样分析结合的和没有结合的级分。使用厂商提议的pH7.0和5.0的合适的缓冲液使用盐梯度进行进一步分离。分析结合的和没有结合的级分中SSP的存在。

实施例1

使用相同性别抗体(β和δ型)作为配体，对溶解的膜蛋白进行亲和层析，产生预计的典型性别分子的富集物(未显示)。使用这种部分纯化的物质(60％非-SSP被去除并且通过在免疫前血清柱上除去大约20％以上非-SSP物质)免疫相反性别的兔子。将所得的血清用于进行蛋白质印迹来确定在1-D电泳上雄性和雌性样本中发现的大小相似的分子是性别特异性的还是非特异性的。通过凝胶过滤然后通过离子交换层析进一步富集SSP。在SDS-PAGE上，对于雄性和雌性SSP，分别在较高(50-60kDa及以上)和较低(35kDa和以下)MW范围，见到可重复的特征曲线。

在精子膜蛋白的蛋白质印迹中使用针对纯化的雄性和雌性胎儿SSPs(分别是SSABsα和γ)以及非-SSABs(β和δ)产生的抗体。分别通过α和γ抗血清在这些印迹中检测到与一些雄性和雌性胎儿SSPs大约相同大小的条带(参见图1)，在那里蛋白质印迹显示与抗胎儿抗体反应的精子膜抗原。泳道指定如下：抗原：精子头部(H)和尾部和中间部分(T)膜蛋白。抗体：雌性抗雄性(α)，雌性抗雌性(β)，雄性抗雌性(γ)，雄性抗雄性(δ)。箭头指示与胎儿SSPs可比较的分子量的条带。

图1，如所注释的，详细说明用抗胎儿抗体检测的精子膜抗原。该图的制备方法涉及使用精子膜制备物，将其在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并且在用雌性抗雄性(α)，雌性抗雌性(β)，雄性抗雌性(γ)，雄性抗雄性(δ)抗血清免疫印迹之后检测。将精子膜从头部区域(H)或者从尾部和中间区域(T)溶解。外道是分子量标准(STD)。箭头表示具有与先前对于胎儿SSPs观察到的蛋白分子量相当的蛋白质。

实施例2

可以进一步研究并且最后分离精子质膜上的性染色体特异性分子。在该方法中，我们生产针对雌性兔和雄性兔的精子质膜表面分子的抗体。我们分别称这些抗血清为ε型和ζ型。这两种免疫产生不同的抗体应答，即产生识别不同抗原(分别是Y-和X-染色体)的抗体。

具体地说，对雌性兔免疫将产生对Y-染色体特异性精子表面蛋白质(Y-SCSPs)的应答，而对X-染色体特异性蛋白质(X-SCSPs)则不产生应答。尽管不期望受任何一项假设的约束，有用的假设是雌性(在本实施例中是雌兔)免疫系统认为Y-SCSPs(它可能是雄性相关的)是″非己的″，而可能注定涉及雌性性别决定的精子X-SCSPs会被认为是″自我的″。对于雄性免疫则相反。因此这两种类型免疫将产生可以在免疫亲和试验中用作配体的抗血清，来分别分离Y-SCSPs和X-SCSPs。

实施例3

用如上所述获得的抗-Y(也称为ε)和抗-X(也称为ζ)型抗血清来制备亲和柱。然后使精子膜制备物通过这些柱子。预计，这将导致推定的性染色体特异性分子的差异结合。然后可以对与两种不同的柱子结合的物质和没有结合的物质的蛋白质含量进行研究。以这种方法使用，ε和ζ柱应该产生被结合的和没有被结合的蛋白质的不同排列。

在先导研究中，我们将全精子膜蛋白质流经了一个柱子(例如ε)。然后从第一个柱子上洗脱结合的蛋白质，然后使结合的和没有结合的物质流经另一个柱子(ζ)。其它样本以相反的顺序流过。这使我们发现哪些蛋白质特异性结合特定的柱子，例如与ε结合但是不与ζ结合，即，推定为Y-特异性。我们对在这些柱子上的精子质膜的层析的先导研究得出初步的结果，提示我们从ε柱获得较大分子量(MW)分子增加，而从ζ柱获得较小MW分子增加。这样我们不仅看到差异；这些差异也与我们从胎儿SSPs的结果预计的方向一致，因为我们的雄性SSPs在较高分子量范围内而雌性SSPs在较低分子量范围内(参见图1)。这些结果表明该方法可能成功分离精子SCSPs。

迄今为止在这些试验中观察到的最具重复性的结果是大约32kDa的推定X-SCSP条带的存在(在6次试验中的范围在31.0-32.8之间；平均值32.2)。由于是在与ζ柱结合但是与ε柱不结合的蛋白质样本中见到(参见图2，第1道)，而在与ε柱结合但是与ζ柱不结合的蛋白质样本中未见到(参见图2，第2道)，将该泳带指定为推定的X-SCSP。在6次试验中的5次中，尝试了分离Y染色体-特异性抗原；有五分之三证明50-80kDa范围的蛋白质的富集。

6个大约32kDa条带的Rf值(蛋白质相对前面染料的移动)的计算方差小于在各试验中已知是相同蛋白质的大小最接近的两个MW标准物(26kDa和38kDa)的方差。这支持这样的结论，即在6次试验的每一次中，大约32kDa的分子是相同的蛋白质。

在SDS-PAGE凝胶中可重复鉴定性染色体特异性分子，并且从凝胶中提取所述分子，用于通过二维电泳和蛋白质印迹作进一步研究，以确定在一维电泳中见到的单一条带含有一种还是多种性别-特异性分子。可用各性染色体特异性分子产生特异性抗体，并且用于氨基酸测序，得出用于PCR的核苷酸序列。

实施例4

提取出SDS-PAGE凝胶中反复鉴定的性染色体特异性分子，用二维电泳和蛋白质印迹作进一步研究。牛和猪中这些研究的结果如表1所示。图3(其说明猪的X精子样本)，图4(其说明猪的Y精子样本)，图5(其说明牛精子X样本)，和图6(其说明牛精子Y样本)中提供了样本进行二维电泳和蛋白质印迹的结果。由图可见，各图分别详细说明了表1中的斑点鉴定数。

实施例5

如本文所述制备的抗体可用来开发分离两类精细胞的方法。例如，可使用如下通过使用抗体分离细胞的确立的方法。用合适的抗体包被市售的显微镜下可观察的小磁珠(Olsaker等，1993，动物遗传学(Anim.Genet.)24：311)，此处所用的抗体是雄性染色体-特异性或者雌性染色体-特异性抗体(或者使用二抗例如山羊抗-兔IgG)。将例如用X染色体-特异性抗体包被的磁珠置于合适的容器例如玻璃皿中的精细胞悬液中。因为性染色体特异性蛋白质存在于细胞表面，所以X-精细胞会与磁珠上的雌性特异性抗体结合，而Y-精子则不结合。然后利用磁体将磁珠吸到皿的侧壁。回收两类精细胞，一类与磁珠粘着(Y)另一类则不粘着(X)。也可以利用精细胞的凝集作用。在这样的方法中，可以将活的未分类的精子悬浮于无血清的体外培养基中，并且暴露于Y或X染色体特异性抗体(如所期望的)。处理之后将培养基经玻璃棉滤器过滤，使用滤液中的精子进行体外受精。

讨论

利用相同的IgG配体(β，δ或者两者)对雄性和雌性蛋白质制备物进行亲和层析，产生两种性别不同MW分子的差异富集。这为纯化SSP提供了基础。

抗-雄性和抗-雌性SSABs(α和γ)分别表现为精子膜蛋白蛋白质印迹中～50-60kDa和～或＜35kDa的条带(图1)，相应于SDS PAGE中见到的雄性和雌性胎儿膜蛋白的大小。这支持了X和Y精子的表面上存在可用SSABsα和γ检测的SCSPs的可能性。

事实上，使用ε和ζ抗血清作为配体的亲和柱富集不同的精子蛋白质。推定能够结合X-SCSPs的ζ柱子始终如一地分离(n＝6次试验中的6次)～32kDa(平均MW＝32.2)的分子。这6个条带的Rf值的方差比26kDa和38kDa MW标准物的小。这表明这6条～32kDa条带可能代表相同的分子，其解释为推定的X-SCSP蛋白质。数据提示它是一种细胞表面分子，因为ε和ζ抗血清是通过注射完整的活精子产生的；相对于细胞毒性T-细胞，B细胞预期优先对表面分子应答。免疫组织化学方面，得到的抗血清事实上是优选与细胞表面蛋白质(和顶体)反应的。

尽管不期望受任何一个理论限制，X和Y精子表面上存在不同SCSPs意味着这些分子在减数分裂之后进行转录和/或翻译(PMT/T)，并且它们不跨越精细胞间的胞质桥。现在有大量的证据证明存在PMT/T(例如，Hendriksen等，1995)，并且显然不是所有的PMT/T分子都跨越胞质桥(Zheng，Y.等，精子学第8次国际研讨会(8th Intl Symposium onSpermatology)，Montreal，加，拿大1998，摘要Pl-31)。如果，如上文提出的，这些分子存在有选择优势，那末也会有选择压力使它们不跨越胞质桥。可能确保这一点的一种机理是注定在质膜的分子在合成之后可能立即被放置在那里(Caldwell，K.A.，美国国家科学院院报(Proc.Nat.Acad.Science，USA)1991；88：2407-2411)。或者，SCSP转录物可能以″翻译受阻抑状态″贮存于精细胞中(Steger，K.解剖胚胎学(Anat.Embryol)(Berl)1999；199：471487)，并且在合适的精细胞中从该状态被释放出来。最后，性染色体在减数分裂过程中主要是异染色质的；可能相关位点被灭活，而只有在胞质桥关闭之后转录才发生。

在优选实施方案中已经详细说明和描述了本发明原理，本领域技术人员应该明白可以在顺序和细节上修改本发明而不背离这些原理。我们要求保护在后面的权利要求书范围内的所有修改。

本文引述的所有公开物，专利和专利申请在本文整体引作参考，其程度就和各公开物，专利或专利申请具体地并且分别地整体引作参考一样。

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                     表1

斑点鉴定	～MW(kD)	～pI范围
			牛精子“X”凝胶
BXC6	24	5-5.5
			BXC7a，b	23，24	4.8-5.3
BXC8	21	5.3-5.8
			BXC9	20	5.3-5.8
BXC10	20	5.3-5.8
			BXC11	14	4.8-5.3
BXC12	15	5-5.5
			牛精子“Y”凝胶
BYC18，19，20	27	5-6.5
			BYC21	20	5-5.5
BYC27	9	5-5.6
			BYC28	9	5.3-5.8
BYC29	5	5.3-5.8
			猪精子“X”凝胶
PXC1a，b	99，100	5.3-5.7
			PXC5	43	5.3-5.7
PXC6	53	6.1-6.7
			PXC7	31	5-5.6
PXC8	30	6-6.5
			PXC11	25	7.5-9
猪精子“Y”凝胶
			PYC14a，b	36，37	6.2-6.8

Claims (30)

1.纯化和分离的性染色体特异性蛋白质，其特征如下：(a)X染色体特异性；(b)与牛精细胞的细胞膜相关联；和(c)在SDS-PAGE上具有大约32kDa的分子量。

2.纯化和分离的性染色体特异性蛋白质，其特征如下：

(a)X染色体特异性；

(b)与牛精细胞的细胞膜相关联；和

(c)在SDS-PAGE上具有的分子量和pI范围选自：24，5-5.5；23，4.8-5.3；21，5.3-5.8；20，5.3-5.8；14，4.8-5.3；和15，5-5.5。

3.纯化和分离的性染色体特异性蛋白质，其特征如下：

(a)Y染色体特异性；

(b)与牛精细胞的细胞膜相关联；并且

(c)在SDS-PAGE上具有的分子量和pI范围选自：27，5-6.5；20，5-5.5；9，5-5.6；9，5.3-5.8；和5，5.3-5.8。

4.纯化和分离的性染色体特异性蛋白质，其特征如下：(a)X染色体特异性；(b)与猪精细胞的细胞膜相关联；并且(c)具有的分子量和pI范围选自：99-100，5.3-5.7；43，5.3-5.7；53，6.1-6.7；31，5-5.6；30，6-6.5；和25，7.5-9。

5.纯化和分离的性染色体特异性蛋白质，其特征如下：(a)Y染色体特异性；(b)与猪精细胞的细胞膜相关联；并且(c)具有的分子量和pI范围分别选自36-37和6.2-6.8。

6.分离和纯化的核酸序列，其编码根据权利要求1，2，3，4或5任一项的分子。

7.鉴定与动物精子细胞膜相关联的性染色体特异性分子的方法，其包括：

(a)给第二和第三SP2动物注射来自SP1动物的全精子，其中所述第二和第三动物是雄性和雌性中的各一种；

(b)收集第二和第三SP2动物产生的抗体；

(c)将来自第二和第三SP2动物的抗体分别与来自SP1动物的精子细胞膜级分反应；

(d)分离细胞膜级分中不与抗体结合的物质和抗体以及来自第二和第三SP2动物的各抗体的结合物质；

(e)分离结合物质和抗体，得到结合的和没有结合的亚级分；

(f)比较来自第二SP2动物抗体的结合物质和来自第三SP2动物抗体的结合物质，并且将另一动物抗体结合物质中不存在的第二和第三SP2动物抗体之一的结合物质鉴定为性染色体特异性分子；和

(g)分离性染色体特异性分子。

8.鉴定与动物精子细胞膜相关联的性染色体特异性分子的方法，其包括：

(a)给第二和第三SP2动物注射来自SP1动物的精细胞级分；

(b)收集第二和第三SP2动物产生的抗体；

(c)将来自第二和第三SP2动物的抗体分别与来自SP1动物的精子细胞膜级分反应；

(d)分离细胞膜级分中不与抗体结合的物质和抗体以及来自第二和第三SP2动物的各抗体的结合物质；

(e)分离结合物质和抗体，得到结合的和没有结合的亚级分；

(f)比较来自第二SP2动物抗体的结合物质和来自第三SP2动物抗体的结合物质，并且将另一动物抗体结合物质中不存在的第二和第三SP2动物抗体之一的结合物质鉴定为性染色体特异性分子；和

(g)分离性染色体特异性分子。

9.权利要求7或8中的方法，其中从牛或猪精细胞的细胞膜获得所述细胞膜级分。

10.权利要求7，8或9任一项中的方法，其中所述细胞膜级分是质膜，顶体膜，线粒体膜或内质网膜级分。

11.权利要求10的方法，其中通过用从第二动物物种的精细胞获得的精子细胞膜级分免疫第一动物物种雄性动物产生抗-X染色体特异性分子抗体。

12.权利要求10的方法，其中通过用从第二动物物种的精细胞获得的精子细胞膜级分免疫第一动物物种雌性动物产生抗-Y染色体特异性分子抗体。

13.权利要求7-12任一项的方法，其进一步包括制备具有针对性染色体特异性分子表位的特异性的抗体。

14.一种抗体，其抗根据权利要求13的方法鉴定的性染色体特异性分子的表位。

15.筛选性染色体特异性分子的方法，其包括将试验样本与权利要求10的抗体反应并且测定试验样本中与该抗体结合的抗原。

16.权利要求15的方法，其中用可检测物质标记所述抗体。

17.从天然精液分离决定雄性和雌性的精子的方法，其包括用抗根据权利要求13的方法鉴定的性染色体特异性分子表位的一种或多种抗体处理天然精液，使在天然精液中决定雄性和雌性的精子与抗体之间形成结合物，并且分离该结合物和没有结合抗体的精子。

18.实施权利要求17的方法的试剂盒，其包括抗性染色体特异性分子表位的抗体，和实施本发明方法中有用的合适载体。

19.一种避孕药，其包括(a)与灭活精子的细胞毒素结合的用权利要求7或8的方法鉴定的性染色体特异性分子；或者(b)权利要求11的抗体。

20.纯化和分离的性染色体特异性蛋白质，其特征如下：(a)X染色体特异性；(b)与牛精细胞的细胞膜相关联。

21.纯化和分离的性染色体特异性蛋白质，其特征如下：(a)X染色体特异性；(b)与牛精细胞的细胞膜相关联，和(c)在SDS-PAGE上的分子量是大约6kDa至大约40kDa。

22.纯化和分离的性染色体特异性蛋白质，其特征如下：(a)Y染色体特异性；(b)与牛精细胞的细胞膜相关联。

23.纯化和分离的性染色体特异性蛋白质，其特征如下：(a)Y染色体特异性；(b)与牛精细胞的细胞膜相关联，和(c)在SDS-PAGE上的分子量是大约5kDa至大约50kDa。

24.权利要求23的蛋白质，其具有的分子量范围是大约10kDa至大约25kDa。

25.纯化和分离的性染色体特异性蛋白质，其特征如下：(a)X染色体特异性；(b)与猪精细胞的细胞膜相关联。

26.纯化和分离的性染色体特异性蛋白质，其特征如下：(a)X染色体特异性；(b)与猪精细胞的细胞膜相关联，和(c)在SDS-PAGE上的分子量是大约20kDa至大约100kDa。

27.纯化和分离的性染色体特异性蛋白质，其特征如下：(a)Y染色体特异性；(b)与猪精细胞的细胞膜相关联。

28.纯化和分离的性染色体特异性蛋白质，其特征如下：(a)Y染色体特异性；(b)与猪精细胞的细胞膜相关联，和(c)在SDS-PAGE上的分子量是大约5kDa至大约50kDa。

29.根据权利要求7-13任一项的方法制备的分子。

30.分离和纯化的核酸序列，其编码根据权利要求20-28任一项的分子。

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