JP2016519955A - 選別可能な精子を有する動物を作製するための遺伝子技術 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年5月31日に出願された米国仮特許出願第61/829,672号明細書および2013年8月27日に出願された米国仮特許出願第61/870,586号明細書の優先権を主張し、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の研究の諸側面は、農務省(USDA)−飲食農業研究所(National Institute of Food and Agriculture)のバイオテクノロジーリスク評価プログラム競争的助成金第2012−33522−19766号による支援を受けた。米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
哺乳動物精細胞は、頭部、中片および尾部を有する。頭部は、雌卵への侵入に使用される酵素を含有する先体により前方で包囲された緻密にコイルされたクロマチン線維を有する核を含有する。中片は、雌頸部、子宮および卵管を通る遊走のためのATP生産に使用される多くのミトコンドリアが周辺にパックされている中心糸状コアを有する。尾部または「鞭毛」は、精母細胞を推進させる鞭様の移動を遂行する。
精子上または精子中で発現される種々の生物分子が存在する。哺乳動物精子タンパク質は、一般に十分に保存されており、その結果、ある哺乳動物の精子上のタンパク質は、別の種中の相当物を有する。当業者は、特定の種中のタンパク質が同定されたら、その相当物を種にわたるタンパク質に位置付けることに慣れている。1つのカテゴリーは、精子線維鞘タンパク質である。Chriva−Internati et al.,Cancer Immunity,2008,(8):8−13が、この群を概説している。精子の鞭毛は、(a)連結片;(b)ミトコンドリアを含む中片;(c)主部、および(d)短い終末部を有する。主要な細胞骨格構造は、軸糸、外側緻密線維、および線維鞘(FS)である。FSは、細胞膜下に存在し、軸糸および外側緻密線維を包囲する。FSは、糖分解酵素およびシグナリング分子のための足場として機能すると考えられる。FS中に局在するいくつかのタンパク質、例として、例えば、Sp17、CABYR、AKAP3、AKAP4、TAKAP−80、ロピリン(Rhopilin)、ロッポリン(Ropporin)、GSTM5およびフィブラウシーシン(fibrousheathin)が同定されている。
図2Aは、遺伝子改変精子:表面上で改変された精子;内部で改変された精子;内部および表面上の両方で改変された精子の実施形態を示す。内部改変は、可視化技術に基づく選別法または例えば、生存もしくは他の変化、例えば、運動性の変更に基づく他の選択法に有用である。マーカーは、それらがリガンドにより結合され、または特異的に結合されるように選択することができる。図2Bは、マーカーに結合するリガンドを含むビーズに結合するマーカーを発現する精子を示す。精子をビーズに曝露し、標識精子がリガンドを介してビーズに結合し、ビーズを未結合精子から、例えば、磁気、遠心分離、または重力により分離する。代替法としては、例えば、試料を受容するカラム中のビーズへのリガンドの固定化、リガンドによりコーティングされた計深棒の試料中への配置、およびリガンドによるビーカーまたは容器壁のコーティングが挙げられる。別の代替法は、複数のリガンドを可溶性材料に結合させ、材料が標識精子を架橋して物質相分離、または沈殿を作出することを可能とすることである。
マーカーに選択的に結合する結合部分は、より一般的な相互作用、例えば、静電性、イオン性、または疎水性親和性により結合するリガンドまたは化学基であり得る。リガンドは、その標的への特異的結合を示す化学部分である。リガンド相互作用としては、酵素−基質、受容体−リガンド、および抗体−抗原結合イベントが挙げられる。
配偶子形成において選択的に活性化されるプロモーターの制御下にある外因性遺伝子を含む染色体を含む細胞を含む遺伝子改変動物の一実施形態。動物は、細胞または胚の遺伝子改変により作出することができる。性染色体、すなわち、XまたはY染色体の一方または両方を改変する。外因性遺伝子により発現されるマーカーは、精子形成の段階に選択的な発現エレメントの制御下にある。発現エレメントは、例えば、プロモーター、マイクロRNAである。
配偶子形成は、生殖系列前駆細胞が細胞分裂および分化を受けて成熟半数体配偶子を形成する生物学的プロセスを指す。動物は、性腺中の減数分裂を介して配偶子を生産する。始原生殖細胞(PGC)は、発生の間に生殖原細胞を形成する。雌生殖原細胞は、卵母細胞形成、卵子細胞形成(ootidogenesis)および卵子を形成するための成熟(卵子形成と称されることもある)の下位プロセスを有する卵子形成を受ける。雄生殖原細胞は、精子形成を受ける。生殖原細胞は、一次精母細胞(二倍体)を生じさせる精原細胞(二倍体)を生産するための減数分裂を受ける雄一次精細胞(二倍体)の前駆体である。一次精母細胞は、減数分裂を受け、精細胞としても公知の成熟精子(半数体)に発達する精子細胞(半数体)を形成する二次精母細胞(半数体)を形成する。精巣の精細管は、このプロセスのための出発点であり、内管壁に隣接する幹細胞は壁から開始して求心方向で分裂し、最も内側の部分に進行して精子細胞を生産する。精子細胞の成熟は、精巣上体中で生じる。マウスまたはラットにおける研究は、第1の動物の精細管がドナー動物からの組織および/または精原細胞を受容し得、その結果、供与された細胞が機能的な精子に成熟することを示している。レシピエントの精細管は、ドナー細胞についての精子形成プロセスを効率的に受け入れ得る。
相同性指向修復(HDR)は、ssDNAおよび二本鎖DNA(dsDNA)損傷を修復するための細胞中の機序である。この修復機序は、損傷部位と顕著な相同性を有する配列を有するHDRテンプレートが存在する場合に細胞により使用され得る。特異的結合は、生物学分野において一般に使用される用語であり、非標的組織と比較して相対的に高い親和性で標的に結合し、一般に複数の非共有相互作用、例えば、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などを含む分子を指す。特異的ハイブリダイゼーションは、相補的配列を有する核酸間の特異的結合の形態である。タンパク質も、例えば、TALENもしくはCRISPR/Cas9系において、またはGal4モチーフによりDNAに特異的に結合し得る。アレルの遺伝子移入は、テンプレートガイド型プロセスにより内因性アレルを上回って外因性アレルをコピーするプロセスを指す。内因性アレルは実際に切り出され、一部の状況において外因性核酸アレルにより置き換えられ得るが、現在の理論は、このプロセスはコピー機序であるということである。アレルは遺伝子ペアであるため、それらの間には顕著な相同性が存在する。アレルは、タンパク質をコードする遺伝子であり得、またはそれは他の機能、例えば、生物活性RNA鎖をコードすることまたは調節タンパク質もしくはRNAを受容するための部位を提供することを有し得る。
ゲノム編集ツール、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)および亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、バイオテクノロジー、遺伝子療法および多くの生物における機能的ゲノム研究の分野に影響を与えた。ごく最近、RNAガイド型エンドヌクレアーゼ(RGEN)が、相補的RNA分子によりその標的部位に指向される。Cas9/CRISPR系は、RGENである。tracrRNAは、別のそのようなツールである。これらは、標的化されるヌクレアーゼ系の例であり:これらの系は、ヌクレアーゼを標的部位に局在化させるDNA結合メンバーを有する。次いで、部位はヌクレアーゼにより切断される。TALENおよびZFNは、DNA結合メンバーに融合しているヌクレアーゼを有する。Cas9/CRISPRは、標的DNA上で互いに遭遇するコグネートである。DNA結合メンバーは、染色体DNA中のコグネート配列を有する。DNA結合メンバーは、典型的には、目的部位における、またはその近くの核酸分解作用を得るように目的コグネート配列に照らして設計される。ある実施形態は、全てのそのような系、限定されるものではないが、例として、ヌクレアーゼ再開裂を最小化する実施形態、目的残基において正確にSNPを作製するための実施形態、およびDNA結合部位において遺伝子移入されているアレルの配置に適用可能である。
本明細書において使用されるTALENという用語は広義であり、別のTALENからの支援なしで二本鎖DNAを開裂し得るモノマーTALENを含む。TALENという用語は、同一部位においてDNAを開裂するために一緒に機能するように遺伝子操作されたTALENのペアの一方または両方のメンバーを指すためにも使用される。一緒に機能するTALENは、DNAまたはTALENペアの掌性を参照する左側TALENおよび右側TALENと称することができる。
亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、亜鉛フィンガーDNA結合ドメインをDNA開裂ドメインに融合させることにより生成される人工的制限酵素である。亜鉛フィンガードメインは、所望のDNA配列を標的化するように遺伝子操作することができ、これにより、亜鉛フィンガーヌクレアーゼが複合体ゲノム内のユニーク配列を標的化することが可能となる。内因性DNA修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して高等生物のゲノムを変更することができる。ZFNは、遺伝子を不活性化させる方法において使用することができる。
ノックアウト目的のため、遺伝子の不活性化のため、遺伝子の発現を得るため、または他の目的のために、種々の核酸を細胞中に導入することができる。本明細書において使用される核酸という用語は、DNA、RNA、および核酸アナログ、および二本鎖または一本鎖(すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖)である核酸を含む。核酸アナログは、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善するように塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において改変することができる。デオキシリボースリン酸骨格は、それぞれの塩基部分が6員モルホリノ環に連結しているモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格がシュードペプチド骨格により置き換えられており、4つの塩基が保持されるペプチド核酸を生産するように改変することができる。
動物は、TALENまたは他の遺伝子操作ツール、例として、リコンビナーゼ融合タンパク質、または公知の種々のベクターを使用して改変することができる。このようなツールにより作製される遺伝子改変は、遺伝子の破壊を含み得る。遺伝子の破壊という用語は、機能的遺伝子産物の形成の妨害を指す。遺伝子産物は、それがその通常の(野生型)機能を実行する場合にのみ機能的である。遺伝子の破壊は、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を妨害し、遺伝子によりコードされる配列中ならびに/または動物中の遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび/もしくはオペレーターの1つ以上の塩基の挿入、欠失、または置換を含む。破壊される遺伝子は、例えば、動物のゲノムからの遺伝子の少なくとも一部の除去、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を妨害するための遺伝子の変更、干渉RNA、または外因性遺伝子によるドミナントネガティブ因子の発現により破壊することができる。遺伝子改変動物の材料および方法は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる2012年2月24日に出願された米国特許出願第13/404,662号明細書、2012年5月9日に出願された米国特許出願第13/467,588号明細書、および2009年11月10日に出願された米国特許出願第12/622,886号明細書にさらに詳述されており、矛盾する場合、本明細書が優先する。トランス作用という用語は、異なる分子からの標的遺伝子に対して(すなわち、分子間)作用するプロセスを指す。トランス作用エレメントは、通常、遺伝子を含有するDNA配列である。この遺伝子は、標的遺伝子の調節において使用されるタンパク質(またはマイクロRNAもしくは他の拡散性分子)をコードする。トランス作用遺伝子は、標的遺伝子と同一の染色体上に存在し得るが、活性は、中間タンパク質またはそれがコードするRNAを介するものである。ドミナントネガティブを使用する遺伝子の不活性化は、一般に、トランス作用エレメントを含む。シス調節またはシス作用という用語は、タンパク質もRNAもコードしない作用を意味し;遺伝子不活性化に関して、これは、一般に、遺伝子のコード部分、または機能的遺伝子の発現に必要なプロモーターおよび/もしくはオペレーターの不活性化を意味する。
種々の干渉RNA(RNAi)が公知である。二本鎖RNA(dsRNA)は、相同遺伝子転写物の配列特異的分解を誘導する。RNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)は、dsRNAを小さい21〜23ヌクレオチドの小分子干渉RNA(siRNA)に代謝する。RISCは、二本鎖RNアーゼ(dsRNアーゼ、例えば、ダイサー)およびssRNアーゼ(例えば、Argonaut2またはAgo2)を含有する。RISCは、開裂可能な標的を見出すためのガイドとしてアンチセンス鎖を利用する。siRNAおよびマイクロRNA(miRNA)の両方が公知である。遺伝子改変動物中の遺伝子を破壊する方法は、標的遺伝子および/または核酸の発現が低減するように標的遺伝子および/または核酸に対するRNA干渉を誘導することを含む。
誘導性系を使用して遺伝子の発現を制御することができる。遺伝子の発現の時空間的制御を可能とする種々の誘導性系が公知である。いくつかは、トランスジェニック動物中でインビボで機能的であることが証明されている。誘導性系という用語は、慣習的なプロモーターおよび誘導性遺伝子発現エレメントを含む。
ファウンダー動物は、クローン化および本明細書に記載の他の方法により生産することができる。ファウンダーは、接合子または初代細胞がホモ接合性の改変を受ける場合のように、遺伝子改変についてホモ接合性であり得る。同様に、ヘテロ接合性のファウンダーを作製することもできる。ファウンダーはゲノム的に改変されていてもよく、このことは、そのゲノムにおける細胞の全てが改変を受けていることを意味する。ファウンダーは、ベクターを胚における複数の細胞の1つに、典型的には胚盤胞段階において導入する場合に起こり得るように、改変についてモザイクであり得る。モザイク動物の子孫を試験してゲノム的に改変されている子孫を同定することができる。有性生殖させることができ、または生殖補助技術により生殖させることができ、異種またはホモ接合性の子孫が常に改変を発現する動物のプールが作出された場合、動物系統が樹立される。
本発明の実施形態は、標的化されるヌクレアーゼ系をリコンビナーゼ(例えば、RecAタンパク質、Rad51)またはDNA組換えに関連する他のDNA結合タンパク質と投与することを含む。リコンビナーゼは、核酸断片とフィラメントを形成し、事実上、細胞DNAを探索してその配列と実質的に相同なDNA配列を見出す。例えば、リコンビナーゼは、HDRについてのテンプレートとして機能する核酸配列と組み合わせることができる。次いで、リコンビナーゼをHDRテンプレートと組み合わせてフィラメントを形成し、細胞中に配置することができる。リコンビナーゼおよび/またはリコンビナーゼと組み合わさるHDRテンプレートは、細胞または胚中に、タンパク質、mRNAとして配置し、またはリコンビナーゼをコードするベクターにより配置することができる。米国特許出願公開第2011/0059160号明細書(米国特許出願第12/869,232号明細書)の開示が、本明細書により全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれ、矛盾する場合、本明細書が優先する。リコンビナーゼという用語は、細胞中で2つの比較的長いDNA鎖間の比較的短いDNA片の結合を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素を指す。リコンビナーゼとしては、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、RecA、RAD51、Cre、およびFLPが挙げられる。Creリコンビナーゼは、loxP部位間のDNAの部位特異的組換えを触媒するP1バクテリオファージからのI型トポイソメラーゼである。Hinリコンビナーゼは、細菌のサルモネラ属(Salmonella)中に見出される198アミノ酸から構成される21kDのタンパク質である。Hinは、DNA開裂および組換えの開始を活性部位セリンに頼るDNAインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。RAD51はヒト遺伝子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、DNA二本鎖分解の修復を支援するRAD51タンパク質ファミリーのメンバーである。RAD51ファミリーメンバーは、細菌RecAおよび酵母Rad51と相同である。Creリコンビナーゼは、loxP部位によりフランキングされる規定の配列を欠失させるための実験において使用される酵素である。FLPは、パン酵母の出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の2μプラスミドに由来するフリッパーゼ組換え酵素(FLPまたはFlp)を指す。
本発明はまた、例えば、部位特異的エンドヌクレアーゼ、CRISPR、Cas9、ZNF、TALENをコードする核酸分子、そのポリペプチドを含有する組成物およびキット、そのような核酸分子もしくはポリペプチド、または遺伝子操作細胞系を含有する組成物を提供する。示されるアレルの遺伝子移入について効率的なHDRを提供することもできる。このようなアイテムは、例えば、研究ツールとして、または治療的に使用することができる。
形質移入 − 線維芽細胞を培養し、既に記載されているヌクレオフェクションにより形質移入する(Carlson et al.,2011)。トランスポゾンは、実験中の合計1μgを構成する。相同性依存性修復(HDR)分析のため、二本鎖分解(DSB)誘導のための最良の実施条件を選択し、修復テンプレートをTALENプラスミドに等量、3および10倍過剰において添加する。細胞培養 − 個々のコロニーの単離は、所定密度における96ウェルプレート中の選択により実施してウェルの30〜50%中のコロニーをもたらす。インデル検出集団 − 約500bpのアンプリコンをもたらすように標的部位をフランキングするプライマーを設計する。PCRアンプリコンをSURVEYOR(登録商標)ヌクレアーゼ(Transgenomic,Omaha NE)により提案のとおりにより処理し、8〜10%のポリアクリルアミドゲル上で分解する。インデル陽性胚盤胞からのアンプリコンの一部をクローン化し、配列決定して突然変異を特徴決定した。インデル検出コロニー − 上記で使用される標的部位をフランキングするプライマーを、高解像度融解分析qPCRマスターミックス(Invitrogen)を使用する増幅に使用し、融解曲線分析を実施する。リアルタイムPCR産物の融解プロファイルの変動は、TALEN誘導突然変異を担持するクローンを野生型配列から区別する。アンプリコン由来非形質移入対照細胞の融解温度の通常の変動を参照として使用する。通常の変動外の融解プロファイルを有するアンプリコンをクローン化し、配列決定して突然変異を特徴決定する。Y標的化検出 − PCRアッセイを相同性アームの外側のプライマーおよびアーム内の1つのプライマーにより開発して相同組換えが生じた場合にのみ考えられる産物をもたらす。PCR陽性コロニーをホールゲノム増幅サザンブロッティングにより検証する。Y標的化を確認するためのWGAサザンブロッティング − REPLI−g Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA)の半反応を「Amplification of Blood or Cells」プロトコルに従って使用してWGAを個々のクローンに対して実施する。サザンブロッティングのためのプローブをハイブリダイズさせて標的化される細胞の5’および3’ジャンクションを検証する。FACS−XおよびY担持精細胞のソーティングのために、Hoechst33342が6.25uMの濃度に添加された1mlのBTS中に1500万個の精子を装入することにより新たな精液を調製する。この調製物を35℃において45分間インキュベートする。精子ソーティングのための標準的な改変を有する改変フローサイトメーターを使用してXおよびY担持精子をDNA含有率によりソーティングする(Johnson et al.,1987;Johnson and Pinkel,1986)。ソーティングされた集団の精度は、XおよびY標的についての定量的PCRにより決定する。血清ホルモン計測 − Endocrine Technologies(Newark,CA)からの市販のELISAキットを使用してテストステロンおよびFSHの血清レベルを評価する。
Carlson et al.,2012は、トランスジェニック初代線維芽細胞を効率的に拡張させ、非トランスジェニック線維芽細胞(フィーダー細胞)と標準的密度(>150個の細胞/cm2)においてプレーティングし、上記に適用されるトランスポゾン同時選択技術を使用する薬物選択に供した場合にコロニーとして単離する家畜における標的遺伝子の改変を記載している(Carlson et al.,(2011)Transgenic Res.,20:1125および2012年5月9日に出願された米国特許出願公開第2012/0220037号明細書)。これらの技術は、動物をクローン化するために使用することができる体細胞の遺伝子変化の作製に有用である。
ブタ低密度リポタンパク質受容体(LDLR)遺伝子の第4エキソンに標的化されるTALENペア(LDLR4.2)を、ブタLDLR遺伝子に対応する相同性アームおよびHDR時にネオマイシンホスホトランスフェラーゼの発現を可能とする遺伝子トラップを含有するスーパーコイルドプラスミドLdlr−E4N−stopと同時形質移入した。培養3日後、PCR分析により、抗生物質選択なしでも、HDRイベントに対応するバンドを30℃において標的化される遺伝子座において検出することができることが明らかになった。geneticin(G418)による14日間の培養細胞の集団の選択は、HDR細胞の顕著な濃縮をもたらした。
Tan et al.2013は、遺伝子のテンプレートドライブ型改変の一本鎖DNAの使用を記載している。一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)は、TALEN刺激HRのための効率的なテンプレートである。11塩基対のBelgian Blueウシ突然変異をWagyu細胞中に遺伝子移入させるように遺伝子座を標的化した。11塩基対を欠失するBB GDF8遺伝子のセンスまたはアンチセンス鎖のいずれかを模倣するように2つの76塩基対ssODNを設計した。4マイクログラムのTALENコードプラスミドをWagyu細胞中に形質移入し、0.3nMolのssODNをTALEN(N)と同時形質移入し、またはMirusLT1(M)試薬もしくはLipofectamine LTX試薬(L)のいずれかによりTALENヌクレオフェクションの24時間後に送達した。3日目における半定量PCRは、ssODNをTALEN形質移入の24時間後にLIPOFECTAMINE LTX試薬により送達した条件において最大5%のアレル変換頻度が送達されたことを示した。標的に対して設計されたセンスおよびアンチセンスssODN間でPCRシグナルの差は観察されなかった。
Tan et al.,(2013)は、ある種中で天然に生じるアレルを別の種に配置する(種間移動)ためのmRNAコードTALENおよび一本鎖オリゴヌクレオチドの組合せによる細胞の改変を記載している。PiedmonteseGFD8SNP C313Yが、一例として選択され、Ossabowブタ細胞中に導入された。これらの細胞中では、いずれの段階においてもマーカーは使用されなかった。0.4nmolのssODNにおいてHDRの類似ピークがブタおよびウシ細胞間で観察されたが(示さず)、HDRは、Ossabaw線維芽細胞中のより高濃度のssODNによっては消失しなかった。
遺伝子特異的gRNA配列をChurch実験室gRNAベクター(Addgene番号:41824)中にその研究者らの方法に従ってクローン化した。Cas9ヌクレアーゼは、hCas9プラスミド(Addgene番号:41815)またはRCIScript−hCas9から合成されたmRNAのいずれかの同時形質移入により提供された。このRCIScript−hCas9は、hCas9プラスミド(hCas9cDNAを包含)からのXbaI−AgeI断片の、RCIScriptプラスミド中へのサブクローン化により構築した。mRNAの合成は、上記のとおり実施したが、但し直鎖化はKpnIを使用して実施した。
CRISPR/Cas9媒介HDRを使用してイボイノシシからのp65S531P突然変異を慣用のブタ中に遺伝子移入した。図5を参照すると、パネルa)において、S531Pミスセンス突然変異をブタp65(RELA)のヌクレオチド1591におけるT−Cトランシジョンにより引き起こした。S−P HDRテンプレートは、新規XmaI部位を導入し、RFLPスクリーニングを可能とする原因TCトランシジョン突然変異(大文字)を含む。2つのgRNA配列(P65_G1SおよびP65_G2A)を、予備実験において使用されるp65.8TALENとともに示す。パネルb)において、Landrace線維芽細胞を、S−P−HDRオリゴ(2μM)、hCas9をコードする2つの量のプラスミド(0.5μgと2.0μg);5つの量のG2A転写プラスミド(0.05〜1.0μg)により形質移入した。それぞれの形質移入からの細胞を60:40に分け、それぞれ30および37℃において3日間培養してから10日目まで37℃において培養を延長した。Surveyorアッセイにより、16〜30%に及ぶ活性が明らかになった。パネルcおよびd)3および10日目において試料採取された細胞のRFLP分析。191および118bpの予測開裂産物を黒色矢印により示す。DSBと標的SNPとの近接性にかかわらず、CRISPR/Cas9媒介HDRはS531Pの遺伝子移入についてTALENより効率的でなかった。それぞれのgRNA配列を使用して個々のコロニーも分析した。
ブタAPCにおけるTALENおよびCRISPR/Cas9媒介HDRの比較。図6を参照すると、パネルa)において、APC14.2TALENおよびgRNA配列APC14.2G1aを、野生型APC配列に対して示す。最下段に、新規HindIII部位をもたらす4bp挿入(文字参照)を送達するHDRオリゴを示す。次いで、2μMのオリゴHDRテンプレート、および1μgのTALENmRNA、hCas9をコードする1μgのそれぞれのプラスミドDNAおよびgRNA発現プラスミドのいずれか;またはhCas9をコードする1μgのmRNAおよび0.5μgのgRNA発現プラスミドにより形質移入されたブタ線維芽細胞を分け、30または37℃のいずれかにおいて3日間培養してから10日目まで37℃において拡張させた。パネルb)RFLPおよびSurveyorアッセイ結果を示すチャート。既に決定されたとおり、TALEN刺激HDRは30℃において最も効率的であった一方、CRISPR/Cas9媒介HDRが37℃において最も効率的であった。この遺伝子座について、TALENは、SURVEYORアッセイにより計測された類似DNA切断頻度にかかわらずHDRの刺激についてCRISPR/Cas9系より効率的であった。TALENとは対照的に、hCas9をプラスミドに対してmRNAとして送達した場合にHDRにほとんど差が存在しなかった。
TALENおよびプラスミド相同性カセットの組合せを使用してmCaggs−EGFPカセットをY染色体に標的化した。この実験目的のため、陽性配向は、トランス遺伝子カセットの両方および内因性遺伝子(SRYまたはAMELY)が同一配向である場合であり、陰性配向は、それらを逆の配向である場合である。1マイクログラムのTALENmRNAと500ngの相同性カセットを、単一の100ulのエレクトロポレーションで600,000個の細胞と混合した。NEONエレクトロポレーション系(Life Technologies)を使用して細胞を形質移入し、30℃において3日間培養し、単一細胞由来コロニーの誘導のために低密度においてプレーティングした。相同性アームの外側の1つプライマーおよびトランス遺伝子カセット内の第2のプライマーを使用するジャンクションPCRによりY染色体の正確な標的化についてコロニーを分析した。いくつかのコロニーを予測アンプリコンについて陽性であった。図8は、図7に示される結果のまとめである。Y標的化について陽性のクローンは、6〜24パーセントに及んだ。トランス遺伝子カセットの配向は、Y標的化の効率に対するいくらかの効果を有すると考えられた。
プラスミド相同性カセットの代替法として、AMELYおよびSRY部位を標的化するように短鎖(50〜100bp)相同性アームを有する直鎖テンプレートを開発した。相同性テンプレートは、カセットの5’および3’末端に結合したプライマーを使用するユビキチンEGFPカセットのPCR増幅により作出し、Orlando et al.,2010(NAR;2010 Aug;38(15))に記載のとおり、想定TALEN誘導二本鎖分解の配列5’および3’に対応するテールを含んだ。プライマーは、内因性ヌクレアーゼによる分解を阻害するための第1の2つのヌクレオチド間のホスポルチオエート(phosporthioate)結合を含んだ。2マイクログラムのTALENmRNA(または対照としての不使用)およびそれぞれの部位に特異的な1ugの短鎖相同性テンプレートを、典型的な100ulのエレクトロポレーションに含めた。エレクトロポレーション後、細胞を30または33℃のいずれかにおける3日間の培養のために分割し、次いでジャンクションPCRによりY標的化について試験した。30または33℃において培養された細胞は、Y標的化が30℃においてより効率的であることを産物強度が示唆するにもかかわらず、5’および3’ジャンクションの両方におけるY標的化について陽性であった。それぞれの部位について、正確なY標的化に対応するアンプリコンは、TALENに依存的であり、SRY3’ジャンクション上段バンドが非特異的バックグラウンドシグナルであることに留意されたい。形質移入後14日間培養された細胞集団は、非統合テンプレートをもはや発現しないはずである。EGFPについてのFACsを14日目の集団に実施しTALENと短鎖相同性テンプレートの組合せがテンプレート単独に対してEGFP陽性細胞の比率を増加させるか否かを決定した。実際、EGFP陽性細胞は、TALENを含めた場合に約3倍濃縮されており、温度の効果はほとんど観察されなかった(図10)。個々のEGFP陽性コロニーを、Y標的化についてゲノタイピングした。AMELYについては、EGFP陽性コロニーの0/5(0%)および2/5(20%)が30または33℃においてそれぞれ最初に培養された細胞からのY標的化についても陽性であった(図11)。SRYについては、EGFP陽性コロニーの5/24(21%)および0/9(0%)が30または33℃においてそれぞれ最初に培養された細胞からのY標的化についても陽性であった(図11)。
マウスとの比較データに基づき本出願人らのチームにより全て最初にクローン化されたブタACE、CK−15またはSP10プロモーターのいずれかの方向で推定シス制限トランス遺伝子を担持するように一連の3つのSleeping Beautyトランスポゾンを作出した。マウスをCarlson et al.,2011に記載のとおりSleeping Beautyトランスポゾンの前核注入により生産した(図12)。続いて、トランスジェニックマウスをF0またはF1で最初にqRT−PCRにより精巣中のEGFPトランス遺伝子について分析した(図13)。有意な発現はACEでもCK−15トランス遺伝子でも観察されなかった一方、SP10プロモーターを有するF0およびF1マウスにおいて有意な発現が存在した。この結果は、予測されなかった。これは、オルソロガスネズミACEおよびCK−15プロモーターは、マウス精原細胞中で確実に発現するためである(Langford,KG et al.,1991;Albanesi et al.,1996)。精巣中のEGFP発現の局在化は、免疫組織化学(IHC)検出により分析した。シグナルは、精細管の領域中で濃縮され、このことは精子形成の通常の進行に合致した(図14)。最後に、精巣上体精子をEGFPの発現についてIHCにより分析した。qPCRの結果と一致して、シグナルがSP10ファウンダーからの精子中でのみ検出された。ファウンダーSP10〜11が複数のコピーのシスXトランス遺伝子を有することが観察され、高いF1伝達頻度により示される。
精巣試料調製。安楽死雄マウスから回収された精巣組織を縦側で1回両断して長さ約40μm×直径40μmの二等分のものを形成した。組織をPBS、pH7.2中4%のPFA/10%のスクロース中で一晩配置し、−70℃においてOCT化合物中で包埋した。包埋組織をそれ以降−80℃において貯蔵した。冷凍切片を6μmにおいて切断し、帯電スライド上で少なくとも30分間空気乾燥させ、冷温アセトン中で5分間、後固定(post−fix)した。
精巣試料調製。安楽死雄マウスから回収された精巣組織を縦側で1回両断して長さ約40μm×直径40μmの二等分のものを形成した。1つの精巣の2分の1をRNALATER(Invitrogen)中に配置し、−80℃において貯蔵した。
実施形態は、例えば、以下を含む:
1.精細胞により発現される外因性配列を含むX染色体またはY染色体を含む遺伝子改変精細胞。配列は、シス制限、例えば、シス制限トランス遺伝子であり得る。実施形態は、実施例11に記載のものを含む。2.前記X染色体を含む、1の精細胞。3.前記Y染色体を含む、1の精細胞。4.前記外因性配列が、静電選別剤をコードする、1〜3のいずれかの精細胞。5.前記外因性配列が、可視化剤をコードする、1〜3のいずれかの精細胞。6.前記可視化剤が、蛍光マーカー、色素、DNAインターカレート蛍光色素、カルシウム活性化色素、および放射線不透過剤からなる群から選択される、0の精細胞。7.前記外因性配列が、毒性分子をコードする、1〜3のいずれかの精細胞。8.前記毒性分子が、毒素、ヌクレアーゼ、アポトーシス因子、および致死ドミナントネガティブからなる群から選択される、0の精細胞。9.前記毒性分子が、毒素遺伝子、ベルナーゼ、ジフテリア毒素A、チミジンキナーゼ、およびリシン毒素からなる群から選択される毒素または毒性遺伝子産物である、0の精細胞。10.前記外因性配列が、毒素に対する解毒剤をコードする、1〜3のいずれかの精細胞。11.前記解毒剤/毒素の組合せが、ベルナーゼ/バルスター(Barstar)を含む、0の精細胞。12.前記外因性配列が、抗原に結合する抗体の少なくとも一部をコードする、1〜3のいずれかの精細胞。13.前記外因性配列が、外因性エピトープをコードする、1〜3のいずれかの精細胞。14.前記外因性配列が、ビオチン、アビジン、またはポリHisをコードする、1〜3のいずれかの精細胞。15.前記外因性配列が、精子運動性を効率的に損傷させる、1〜3のいずれかの精細胞。16.前記外因性配列が、融合タンパク質の一部である、1〜13のいずれかの精細胞。17.前記融合タンパク質が、外因性配列および精子の細胞膜(精細胞外部の細胞膜を指す)に局在化するためのタンパク質をコードする配列の融合物である、0の精細胞。18.前記融合タンパク質が、前記外因性配列および頭部、中片、尾部、鞭毛、終末部、主部、および頸部からなる群から選択される精子の一部に選択的に局在化するタンパク質をコードする配列の融合物である、0の精細胞。19.前記外因性配列が、前記精細胞外部上で発現される、1〜0のいずれかの精細胞。20.前記外因性配列が、前記精細胞内部中で発現される、1〜0のいずれかの精細胞。21.請求項1〜0のいずれかの精細胞を生産する遺伝子改変動物。22.1〜0のいずれかの精細胞を発現する、0の動物の子孫。23.0または0の動物から生産された精子。24.1〜0のいずれかの動物を作出することを含む、精子を選別する方法。25.少なくとも1つの生物発現マーカーの存在または不存在に基づき、Y染色体を含む精子からX染色体を含む精子を分離することを含む、精子を選別する方法。26.前記精子を生産するファウンダー動物を作出することをさらに含む、0の方法。27.前記生物発現マーカーが、蛍光マーカー、色素、DNAインターカレート蛍光色素、カルシウム活性化色素、および放射線不透過剤、可視光波長の色、蛍光波長の色、蛍光、放射線不透過性、外因性エピトープ、結合リガンド、ならびに抗体の少なくとも一部からなる群から選択される、0の方法。28.前記マーカーを有する精子を可視化することを含む、0または0の方法。29.FAC−SORTまたは精子選択装置の使用を含む、0または0の方法。30.前記生物発現マーカーを、前記マーカーに特異的に結合するリガンドと結合させることを含む、0または0の方法。31.前記生物発現マーカーを、前記マーカーに特異的に結合するリガンドを含む固体表面と結合させること、または前記発現マーカーに特異的に結合する複数のリガンドを発現する架橋剤を介して複数の精子を互いに結合させることを含む、0または0の方法。32.前記分離が、精子運動性に基づく、0の方法。33.前記分離が、生存/死亡アッセイを含む、0の方法。34.前記マーカーが、毒性物質および解毒剤からなる群から選択される、0の方法。35.マーカーを発現するX染色体を含む精子、またはマーカーを発現するY染色体を含む精子、または第1のマーカーを発現するX染色体を含む精子と第2のマーカーを発現するY染色体を含む精子との混合物;および前記マーカーに選択的に結合する結合部分、例えば、前記マーカーについての特異的結合を有するリガンドまたは実質的に前記マーカーにのみ結合し、他の精子には結合しない物質を含む精子選別のための系。36.前記結合部分が、固体表面またはポリマーに固定化されている、0の系。37.前記結合部分が、前記リガンドにより結合される精細胞を損傷させる毒性物質に付着している、0の系。38.前記結合部分が、アビジン、ビオチン、前記マーカーに結合する抗体の少なくとも一部、前記マーカーに特異的に結合するペプチド、アプタマー、および前記マーカーに特異的に結合する核酸からなる群から選択されるリガンドである、0の系。39.前記マーカーが、陰性選択のためのものである、0の系。あるいは、前記マーカーは、陽性選択のためのものである。40.マーカーを発現するX染色体を含む精子、またはマーカーを発現するY染色体を含む精子、または第1のマーカーを発現するX染色体を含む精子と第2のマーカーを発現するY染色体を含む精子との混合物を含む精子選別のための系であって、前記マーカーが可視化による分離を提供する系。41.X染色体またはY染色体上の外因性遺伝子を含む遺伝子改変家畜動物であって、前記遺伝子が、前記動物中の精子中でマーカーを発現する動物。42.前記外因性遺伝子が、配偶子形成において選択的に活性化される遺伝子発現エレメントの制御下にある、40または41の動物。43.前記外因性遺伝子が、誘導性プロモーターの制御下にある、0の動物。44.前記染色体が、Y染色体である、0または0の動物。45.前記染色体が、X染色体である、0または0の動物。46.前記遺伝子発現エレメントが、サイクリンA1プロモーター、Stra8、SP−10プロモーター、Stra8プロモーター、C−Kit、ACE、およびプロタミンからなる群から選択されるプロモーターを含む、0〜0の動物。47.前記外因性遺伝子が、前記因子およびマイクロRNAの融合物をコードする、0〜0の動物。48.それぞれの精子中の性染色体の性を示すように標識された精子を有する動物。49.前記性染色体が、Xであり、前記X染色体が、前記マーカーを担持する、0の動物。50.前記性染色体が、Yであり、前記Y染色体が、前記マーカーを担持する、0の動物。51.1〜50のいずれかの使用。1〜50のいずれかを作製するためのキット。
Claims (32)
- X染色体を有する精子またはY染色体を有する精子の選択のためのマーカーを含む精子を生産する、遺伝子改変家畜動物。
- 前記X染色体が、前記マーカーをコードする外因性遺伝子を含む、請求項1に記載の動物。
- 前記Y染色体が、前記マーカーをコードする外因性遺伝子を含む、請求項1に記載の動物。
- 前記マーカーが、誘導性プロモーターの制御下にある外因性遺伝子により発現される、請求項1に記載の動物。
- 前記マーカーが、配偶子形成において選択的に活性化される遺伝子発現エレメントの制御下にある外因性遺伝子により発現される、請求項1に記載の動物。
- 前記遺伝子発現エレメントが、サイクリンA1プロモーター、Stra8、SP−10プロモーター、Stra8プロモーター、C−Kit、ACE、およびプロタミンからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項5に記載の動物。
- 前記マーカーが、前記マーカーおよびマイクロRNAの融合物をコードする外因性遺伝子により発現される、請求項1に記載の動物。
- 前記マーカーが、外因性遺伝子により発現され、かつ前記マーカーが、選択マーカー、静電選別剤、可視化剤、および外因性抗原からなる群から選択される、請求項1に記載の動物。
- 前記マーカーが、可視化剤であり、かつ蛍光マーカー、色素、DNAインターカレート蛍光色素、カルシウム活性化色素、および放射線不透過剤からなる群から選択される、請求項8に記載の動物。
- 前記マーカーが、前記選択マーカーである、請求項8に記載の動物。
- 前記選択マーカーが、毒性分子を含む、請求項10に記載の動物。
- 前記毒性分子が、毒素、ヌクレアーゼ、アポトーシス因子、および致死ドミナントネガティブからなる群から選択される、請求項11に記載の動物。
- 前記毒性分子が、毒素遺伝子、ベルナーゼ、ジフテリア毒素A、チミジンキナーゼ、およびリシン毒素からなる群から選択される毒素または毒性遺伝子産物である、請求項11に記載の動物。
- 前記選択マーカーが、毒素に対する解毒剤を含む、請求項10に記載の動物。
- 前記マーカーが、抗原であり、前記抗原が、ビオチン、アビジン、およびポリHisからなる群から選択される、請求項8に記載の動物。
- 前記マーカーが、精子運動性を損傷させる因子を含む、請求項1に記載の動物。
- 前記マーカーが、前記精子の外部上で発現され、かつ二分子因子についての特異的結合を有する、請求項1に記載の動物。
- 前記マーカーが、前記精子に天然に存在するタンパク質を含む融合タンパク質の一部である、請求項1に記載の動物。
- 前記精子に天然に存在する前記タンパク質が、外部タンパク質、内部タンパク質、頭部、中片、尾部、鞭毛、終末部、主部、および頸部からなる群から選択される、請求項18に記載の動物。
- 請求項1に記載の動物の精子。
- 生物発現マーカーの存在または不存在に基づき、Y染色体を含む精子からX染色体を含む精子を分離することを含む、精子を選別する方法。
- 前記生物発現マーカーが、蛍光マーカー、色素、DNAインターカレート蛍光色素、カルシウム活性化色素、および放射線不透過剤、可視光波長の色、蛍光波長の色、蛍光、放射線不透過性、外因性エピトープ、結合リガンド、ならびに抗体の少なくとも一部からなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- マーカーを発現するX染色体を含む精子、または
マーカーを発現するY染色体を含む精子、または
第1のマーカーを発現するX染色体を含む精子と第2のマーカーを発現するY染色体を含む精子との混合物;
および
前記マーカーに選択的に結合する結合部分または前記マーカーを使用して前記精子を選別する装置
を含む精子選別のための系。 - 精細胞により発現される外因性配列を含むX染色体またはY染色体を含む遺伝子改変精細胞。
- 前記X染色体を含む、請求項24に記載の精細胞。
- 前記Y染色体を含む、請求項24に記載の精細胞。
- 前記外因性配列が、静電選別剤、可視化剤、マーカー、毒素、リガンド、抗原、解毒剤をコードする、請求項24〜26のいずれか一項に記載の精細胞。
- 前記可視化剤が、蛍光マーカー、色素、DNAインターカレート蛍光色素、カルシウム活性化色素、および放射線不透過剤からなる群から選択され、
前記毒性分子が、毒素、ヌクレアーゼ、アポトーシス因子、致死ドミナントネガティブ、毒素遺伝子、ベルナーゼ、ジフテリア毒素A、チミジンキナーゼ、およびリシン毒素からなる群から選択され、または
前記解毒剤/毒素が、ベルナーゼ/バルスターを含む、
請求項27に記載の精細胞。 - 前記外因性配列が、抗原に結合する抗体の少なくとも一部、外因性エピトープ、ビオチン、アビジン、またはポリHisをコードする、請求項24〜26のいずれか一項に記載の精細胞。
- 前記外因性配列が、精子運動性を効率的に損傷させる、請求項24〜26のいずれか一項に記載の精細胞。
- 前記外因性配列が、融合タンパク質の一部である、請求項24〜26のいずれか一項に記載の精細胞。
- 前記外因性配列が、シス制限性である、請求項24〜26のいずれか一項に記載の精細胞。
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