CN105651804A - 一种慢性萎缩性胃炎大鼠模型的构建及评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于模型的构建及评价方法技术领域,具体涉及一种慢性萎缩性胃炎大鼠模型的构建及评价方法。本发明主要解决了现有慢性萎缩性胃炎模型的构建及评价方法存在精确性低、成本高和费时费力的技术问题。本发明采用代谢组学的技术,通过分析造模前后机体终端产物尿液中内源性代谢产物的变化,获得代谢轮廓动态轨迹图谱。同时,使用MestReNova软件对所有的NMR谱进行处理得到积分数据,并结合18个生物标志物的含量统计学分析,发现造模前后尿液中的18个生物标记物积分均值的变化一定程度上反应了慢性萎缩性胃炎大鼠尿液代谢轨迹的变化趋势,从而针对性地评价慢性萎缩性胃炎的模型。
Description
技术领域
本发明属于模型的构建及评价方法技术领域,具体涉及一种慢性萎缩性胃炎大鼠模型的构建及评价方法。
背景技术
慢性萎缩性胃炎(Chronicatrophicgastritis,CAG)是消化系统的常见疾病之一,是指胃黏膜上皮遭受反复损害导致固有腺体的减少,伴或不伴纤维替代,肠腺化生和/或假幽门腺化生的一种慢性胃部疾病。在我国,CAG患者占受检人群总数的13.8%。1978年世界卫生组织将CAG列为胃癌前状态。目前,现代医学对于慢性萎缩性胃炎尚缺乏行之有效的治疗方法。患者一旦发病,难于治愈,大多终生带病,严重威胁着人类的身体生存质量。
CAG作为胃癌癌前疾病,是非常值得临床及科研工作者深入研究的。病理模型的评价则是疾病发病机制和新药研究的关键所在。现代研究多应用综合方法复制慢性萎缩性胃炎模型,摸拟与人类近似的病因、发病机制等特征,用于临床和药物研究中。但是,在模型复制中,缺乏有效的评价方式,主要体现在以下几点:
目前慢性萎缩性胃炎模型复制成功与否的判断主要根据病理组织学检查,胃组织形态的观察结果作为辅助。胃蛋白酶、胃泌素、胃酸、表皮生长因子、一氧化氮等机制相关检测指标也被大量研究者监测。另外,新的可视化技术还可对胃黏膜损伤面积进行评价,进而清晰地显示出胃黏膜受损情况。但长期以来的实验研究中,慢性萎缩性胃炎模型评价仍存在不足之处。①主观性:胃组织形态直接观察观察指标包括胃部大小、胃壁厚度、皱襞数量、黏膜色泽及出血等,这种评价方法采取主观人为评价,存在很大的主观性和不确定性。②片面性:通过慢性萎缩性胃炎相关调控因子评价模型存在一定的片面性,只能反映个别的生化功能,器官/组织的状态,缺乏整体的系统的评价标准。③耗费性:目前慢性萎缩性胃炎实验研究还处于探索阶段,普遍造模时间较长,病理检测是其目前唯一的金标准,但该方法操作繁琐且费用昂贵,费时费力。
发明内容
本发明的目的是解决现有慢性萎缩性胃炎模型的构建及评价方法存在精确性低、成本高和费时费力的技术问题,提供一种慢性萎缩性胃炎大鼠模型的构建及评价方法。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:
一种慢性萎缩性胃炎大鼠模型的构建方法,包括以下步骤:
用浓度为20mmo1/L的脱氧胆酸钠溶液和浓度为0.1%的氨水溶液单日双日交替自由喂养大鼠,并保证足量;同时结合饥饱失常法:两天足食,1天禁食,循环实施8周。
一种对上述方法构建的慢性萎缩性胃炎大鼠模型的评价方法,包括以下步骤:
1)在大鼠模型构建的第0周、第4周、第6周和第8周分别收集大鼠模型的尿液,首先对第0周、第4周、第6周和第8周收集大鼠模型的尿液分别进行核磁共振分析,得出大鼠模型的1HNMR谱图;然后对大鼠模型的1HNMR谱图积分数据矩阵进行多元统计分析,得出大鼠模型的轮廓图;进而对大鼠模型的轮廓图进行轮廓动态分析,得出大鼠模型的轮廓动态变化趋势图;
2)对第8周收集大鼠模型的尿液进行核磁共振分析得出大鼠模型的1HNMR图谱进行积分,得出18个生物标志物的含量变化;
3)首先分析步骤1)得出的轮廓动态变化趋势图,与第0周相比,在模型构建第8周时偏离程度最大;
然后,分析步骤2)得出18个生物标志物的含量变化,与第0周相比,在模型构建第8周时的18个生物标志物的含量变化如下:
模型大鼠尿液中Isoleucine、Malonate、Sarcosine、Betaine、Glycine、Guanidinoacetate和Allantoin含量显著下降,具体含量变化如下:
Isoleucine的积分面积均数从正常鼠的1.149±0.1303下降到0.8691±0.0519,p<0.01;
Malonate的积分面积均数从正常鼠的1.015±0.119下降0.7358±0.140,p<0.01;
Sarcosine的积分面积均数从正常鼠的1.127±0.309下降到0.8306±0.099,p<0.01;
Betaine的积分面积均数从正常鼠的2.053±0.890下降到1.034±0.253,p<0.05;
Glycine的积分面积均数从正常鼠的1.127±0.309下降到0.831±0.01,p<0.01;
Guanidinoacetate的积分面积均数从正常鼠的1.979±0.194下降到1.626±0.093,p<0.05;
Allantoin的积分面积均数从正常鼠的2.003±0.481下降到0.7908±0.295,p<0.01;
模型大鼠尿液中Valine、2-hydroxybutyrate、Acetate、Succinate、a-ketoglutarate、Dimethylamine、TMA、DMG、Hippurate、Fumarate和Trigonelline含量显著上调,具体含量变化如下:
Valine的积分面积均数从正常鼠的0.119±0.0849上升到0.215±0.03,p<0.01;
2-hydroxybutyrate的积分面积均数从正常鼠的0.597±0.0836上升到0.93±0.026,p<0.05;
Acetate的积分面积均数从正常鼠的0.386±0.194上升到0.612±0.029,p<0.01;
Succinate的积分面积均数从正常鼠的0.991±0.266上升到2.22±0.775,p<0.05;
a-ketoglutarate的积分面积均数从正常鼠的1.338±0.346上升到1.854±0.39,p<0.05;
Dimethylamine的积分面积均数从正常鼠的0.331±0.108上升到0.496±0.108,p<0.05;
TMA的积分面积均数从正常鼠的0.356±0.108上升到0.406±0.095,p<0.01;
DMG的积分面积均数从正常鼠的0.919±0.249上升到1.233±0.595,p<0.05;
Hippurate的积分面积均数从正常鼠的0.361±0.097上升到0.543±0.134,p<0.01;
Fumarate的积分面积均数从正常鼠的0.001±0.006上升到0.023265163±0.013,p<0.01;
Trigonelline的积分面积均数从正常鼠的0.0051±0.005上升到0.0214±0.009,p<0.01,
则表明慢性萎缩性胃炎大鼠模型在第8周时构建成功。
本发明采用以上技术方案,采用代谢组学的技术,通过分析造模前后机体终端产物尿液中内源性代谢产物的变化,获得代谢轮廓动态轨迹图谱。同时,使用MestReNova软件对所有的NMR谱进行处理得到积分数据,并结合18个生物标志物的含量统计学分析,发现造模前后尿液中的18个生物标记物积分均值的变化一定程度上反应了慢性萎缩性胃炎大鼠尿液代谢轨迹的变化趋势,从而针对性地评价慢性萎缩性胃炎的模型。代谢产物处于生物机体中的终端,上游基因和蛋白质的微小变化都会在代谢物上得到放大,从而可更加灵敏地表征生命现象,能忠实反映外界干预对机体代谢网络调控过程的微观变化。且迄今为止,未见代谢组学方法用于慢性萎缩性胃炎模型的评价。与以往的评价方法相比,该方法更全面灵敏、系统综合的体现造模前后机体的动态轮廓,综合地体现模型复制的合理性和科学性,可以为新药研发和药理研究提供一种可靠的慢性萎缩性胃炎模型的评价方法,具有高效、快速、无创伤、特异性强的优点。
为表明本发明具有以上优点,分别采用造模前后大鼠体重、生化指标及病理变化评价慢性萎缩性胃炎模型的方法(结果见图4、图5、图6和表1)和本发明所述方法评价慢性萎缩性胃炎模型的方法(结果见图1、图2和图3),
表1.造模前后各组大鼠的SOD、MDA及胃蛋白酶活力值变化情况(Mean±SD)
与正常对照组相比,*p<0.05,**p<0.01。
利用造模前后两组大鼠生化指标的变化评价模型的可靠性。结果表明,与正常对照组相比,模型组大鼠血浆SOD值显著下降,而MDA值显著升高,胃蛋白酶显著降低。生化分析结果表明慢性萎缩性胃炎模型造模成功。
通过对比可知,采用本发明所述评价方法能更加全面灵敏的监测慢性萎缩性胃炎模型的复制过程,具有高效、快速、无创伤、特异性强的优点。
附图说明
图1是模型构建期间大鼠模型尿液的PCA动态趋势图;
图2是大鼠模型尿液OPLS-DA分析得分图;
图3是大鼠模型尿液OPLS-DA分析载荷图;
图4是大鼠模型复制期间大鼠体重变化趋势图;
图5是正常大鼠胃组织病理图;
图6是大鼠模型胃组织病理图。
具体实施方式
一种慢性萎缩性胃炎大鼠模型的构建方法,包括以下步骤:
用浓度为20mmo1/L的脱氧胆酸钠溶液和浓度为0.1%的氨水溶液单日双日交替自由喂养大鼠,并保证足量;同时结合饥饱失常法:两天足食,1天禁食,循环实施8周。
一种对本实施例所述方法构建的慢性萎缩性胃炎大鼠模型的评价方法,包括以下步骤:
1)应用多元统计分析方法对代谢轮廓进行表征,采用主成分分析(PCA)对数据进行模式识别,考察各组数据轮廓的分离情况。具体方法是在大鼠模型构建的第0周、第4周、第6周和第8周分别收集大鼠模型的尿液,首先对第0周、第4周、第6周和第8周收集大鼠模型的尿液分别进行核磁共振分析,得出大鼠模型的1HNMR图谱;然后对大鼠模型的1HNMR谱图积分数据矩阵进行多元统计分析,得出大鼠模型的轮廓图;进而对大鼠模型的轮廓图进行轮廓动态分析,得出大鼠模型的轮廓动态变化趋势图,如图1(横坐标及纵坐标分别表征第一主成分和第二主成分。C:空白组;M1:第4周;M2:第6周;M3:第8周;M4:第10周)所示:在不同的时间点,模型组偏离正常对照组的程度不同,而在模型复制第8周时偏离程度最大,说明在第8周代谢调控网络发生显著变化,证明慢性萎缩性胃炎模型复制成功;
2)在PCA动态分析的基础上,利用正交偏最小二乘-判别分析法(OPLS-DA)对正常组和第8周模型尿液进一步分析,得到与正常组对第8周模型组尿液轮廓图,结果见图2(横坐标及纵坐标分别表征第一主成分和第二主成分)。从图2可以看出两组在主成分一轴上的分离效果明显。接着通过载荷图(见图3:(横坐标及纵坐标分别表征第一主成分和相关性系数,系数越大,对分组贡献越大。)对变量加载的结果进行描述,利用变量重要性(VIP)分析,并结合统计学(p<0.05)获得潜在的生物标志物,从对照组与模型组中找到含量变化差异显著的变量,这些变量所涉及到的代谢通路有可能导致慢性萎缩性胃炎模型的形成。
对第8周收集大鼠模型的尿液进行核磁共振分析得出大鼠模型的1HNMR图谱进行积分,得出18个生物标志物的含量变化;
3)首先分析步骤1)得出的轮廓动态变化趋势图,与第0周相比,在模型构建第8周时偏离程度最大;
然后,分析步骤2)得出18个生物标志物的含量变化,与第0周相比,在模型构建第8周时的18个生物标志物的含量变化如下:
模型大鼠尿液中Isoleucine、Malonate、Sarcosine、Betaine、Glycine、Guanidinoacetate和Allantoin含量显著下降,具体含量变化如下:
Isoleucine的积分面积均数从正常鼠的1.149±0.1303下降到0.8691±0.0519,p<0.01;
Malonate的积分面积均数从正常鼠的1.015±0.119下降0.7358±0.140,p<0.01;
Sarcosine的积分面积均数从正常鼠的1.127±0.309下降到0.8306±0.099,p<0.01;
Betaine的积分面积均数从正常鼠的2.053±0.890下降到1.034±0.253,p<0.05;
Glycine的积分面积均数从正常鼠的1.127±0.309下降到0.831±0.01,p<0.01;
Guanidinoacetate的积分面积均数从正常鼠的1.979±0.194下降到1.626±0.093,p<0.05;
Allantoin的积分面积均数从正常鼠的2.003±0.481下降到0.7908±0.295,p<0.01;
模型大鼠尿液中Valine、2-hydroxybutyrate、Acetate、Succinate、a-ketoglutarate、Dimethylamine、TMA、DMG、Hippurate、Fumarate和Trigonelline含量显著上调,具体含量变化如下:
Valine的积分面积均数从正常鼠的0.119±0.0849上升到0.215±0.03,p<0.01;
2-hydroxybutyrate的积分面积均数从正常鼠的0.597±0.0836上升到0.93±0.026,p<0.05;
Acetate的积分面积均数从正常鼠的0.386±0.194上升到0.612±0.029,p<0.01;
Succinate的积分面积均数从正常鼠的0.991±0.266上升到2.22±0.775,p<0.05;
a-ketoglutarate的积分面积均数从正常鼠的1.338±0.346上升到1.854±0.39,p<0.05;
Dimethylamine的积分面积均数从正常鼠的0.331±0.108上升到0.496±0.108,p<0.05;
TMA的积分面积均数从正常鼠的0.356±0.108上升到0.406±0.095,p<0.01;
DMG的积分面积均数从正常鼠的0.919±0.249上升到1.233±0.595,p<0.05;
Hippurate的积分面积均数从正常鼠的0.361±0.097上升到0.543±0.134,p<0.01;
Fumarate的积分面积均数从正常鼠的0.001±0.006上升到0.023265163±0.013,p<0.01;
Trigonelline的积分面积均数从正常鼠的0.0051±0.005上升到0.0214±0.009,p<0.01,
综合,若符合在第8周的代谢轮廓的偏离程度最大,且18个代谢物积分数据满足上述范围,则表明慢性萎缩性胃炎大鼠模型在第8周时构建成功。
Claims (2)
1.一种慢性萎缩性胃炎大鼠模型的构建方法,其特征在于:包括以下步骤:
用浓度为20mmo1/L的脱氧胆酸钠溶液和浓度为0.1%的氨水溶液单日双日交替自由喂养大鼠,并保证足量;同时结合饥饱失常法:两天足食,1天禁食,循环实施8周。
2.一种对权利要求1所述方法构建的慢性萎缩性胃炎大鼠模型的评价方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)在大鼠模型构建的第0周、第4周、第6周和第8周分别收集大鼠模型的尿液,首先对第0周、第4周、第6周和第8周收集大鼠模型的尿液分别进行核磁共振分析,得出大鼠模型的1HNMR谱图;然后对大鼠模型的1HNMR谱图积分数据矩阵进行多元统计分析,得出大鼠模型的轮廓图;进而对大鼠模型的轮廓图进行轮廓动态分析,得出大鼠模型的轮廓动态变化趋势图;
2)对第8周收集大鼠模型的尿液进行核磁共振分析得出大鼠模型的1HNMR图谱进行积分,得出18个生物标志物的含量变化;
3)首先分析步骤1)得出的轮廓动态变化趋势图,与第0周相比,在模型构建第8周时偏离程度最大;
然后,分析步骤2)得出18个生物标志物的含量变化,与第0周相比,在模型构建第8周时的18个生物标志物的含量变化如下:
模型大鼠尿液中Isoleucine、Malonate、Sarcosine、Betaine、Glycine、Guanidinoacetate和Allantoin含量显著下降,具体含量变化如下:
Isoleucine的积分面积均数从正常鼠的1.149±0.1303下降到0.8691±0.0519,p<0.01;
Malonate的积分面积均数从正常鼠的1.015±0.119下降0.7358±0.140,p<0.01;
Sarcosine的积分面积均数从正常鼠的1.127±0.309下降到0.8306±0.099,p<0.01;
Betaine的积分面积均数从正常鼠的2.053±0.890下降到1.034±0.253,p<0.05;
Glycine的积分面积均数从正常鼠的1.127±0.309下降到0.831±0.01,p<0.01;
Guanidinoacetate的积分面积均数从正常鼠的1.979±0.194下降到1.626±0.093,p<0.05;
Allantoin的积分面积均数从正常鼠的2.003±0.481下降到0.7908±0.295,p<0.01;
模型大鼠尿液中Valine、2-hydroxybutyrate、Acetate、Succinate、a-ketoglutarate、Dimethylamine、TMA、DMG、Hippurate、Fumarate和Trigonelline含量显著上调,具体含量变化如下:
Valine的积分面积均数从正常鼠的0.119±0.0849上升到0.215±0.03,p<0.01;
2-hydroxybutyrate的积分面积均数从正常鼠的0.597±0.0836上升到0.93±0.026,p<0.05;
Acetate的积分面积均数从正常鼠的0.386±0.194上升到0.612±0.029,p<0.01;
Succinate的积分面积均数从正常鼠的0.991±0.266上升到2.22±0.775,p<0.05;
a-ketoglutarate的积分面积均数从正常鼠的1.338±0.346上升到1.854±0.39,p<0.05;
Dimethylamine的积分面积均数从正常鼠的0.331±0.108上升到0.496±0.108,p<0.05;
TMA的积分面积均数从正常鼠的0.356±0.108上升到0.406±0.095,p<0.01;
DMG的积分面积均数从正常鼠的0.919±0.249上升到1.233±0.595,p<0.05;
Hippurate的积分面积均数从正常鼠的0.361±0.097上升到0.543±0.134,p<0.01;
Fumarate的积分面积均数从正常鼠的0.001±0.006上升到0.023265163±0.013,p<0.01;
Trigonelline的积分面积均数从正常鼠的0.0051±0.005上升到0.0214±0.009,p<0.01,
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