CN105648035A - 一种α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒 - Google Patents

一种α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒。本发明所述试剂盒包括固定液、α-醋酸萘酚酯溶液、偶氮染料溶液、缓冲液及漂洗液，所述偶氮染料溶液为碱性蓝54水溶液。本发明试剂盒以碱性蓝54替代现有α-NAE染色方法中的坚固蓝B盐、固紫盐等重氮染料，将染色时间缩短到20分钟左右，染色后即可通过镜检区分单核细胞和未成熟及成熟粒细胞、淋巴细胞、红细胞，省去细胞核复染步骤，且无需NaF抑制试验辅助即可快速诊断出单核细胞白血病和粒细胞白血病，相比现有方法更加简便、快捷。

Description

一种α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)染色液(化学染色法)，即一种α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒。
背景技术
细胞化学染色技术是结合细胞学和化学，以形态学为基础，通过化学染色处理，在显微镜下对细胞内的酶类、脂类、糖类、蛋白质、核酸等成分进行定性、定量、定位分析的一种技术。该技术应用于血液和骨髓涂片及淋巴结组织切片，在血细胞的识别、血液病诊断和鉴别诊断中发挥重要的作用。目前，常用的与血液系统疾病有关的细胞化学染色有过氧化物酶染色、糖原染色、酯酶染色、碱性磷酸酶染色、酸性磷酸酶染色及铁染色等。
单核细胞来源于骨髓中的造血干细胞，前髓细胞是单核细胞的前体。单核细胞作为血液中的清道夫细胞，具有活跃的吞噬或卷入外来物如细菌等，并将其清除的作用。单核细胞数量的增多见于血液紊乱(如急性或慢性感染)、热带疾病(如梅毒、锥虫病、肺结核)、骨髓增生异常疾病及单核细胞系白血病等。
与其他血细胞比较，单核细胞内含有更多的非特异性酯酶。非特异性酯酶是血细胞中作用于短链脂肪酸的酯酶。根据酯酶水解的底物不同，血细胞中常见酯酶包括α-醋酸萘酚酯酶(α-naphtholacetateesterace,α-NAE)、乙酸AS-D萘酚酯酶、醋酸AS萘酚酯酶、氯化醋酸AS-D萘酚酯酶等。非特异性酯酶α-NAE主要存在于单核系细胞中，被称之为单核细胞型酯酶，其活性测定及氟化钠(NaF)抑制试验主要用于急性单核细胞白血病与急性粒细胞白血病的鉴别，对诊断单核细胞相关疾病具有重要作用。
采用化学染色法对血细胞中α-醋酸萘酚酯酶进行染色测定，其原理是α-NAE能将基质液中的α-醋酸萘酚水解，产生α-萘酚，再与重氮染料偶联，形成不溶性的有色沉淀，定位于胞质内酶活性处，沉淀物显色的深浅与α-NAE活性呈正比。因所用的重氮盐不同，阳性反应的沉淀可分灰黑色或棕黑色。α-NAE在正常单核-吞噬细胞系统中含量较高，可呈阳性或强阳性反应，且可被NaF抑制。正常粒细胞部分呈弱阳性或阳性反应，但不被NaF所抑制。正常幼红细胞、巨核细胞、部分淋巴细胞均能见到弱阳性。在白血病细胞的FAB亚型分型中，依据阳性反应及NaF抑制率可鉴定M1-M5可能性。
在现有的血细胞α-NAE染色中，重氮染料常使用坚固蓝B盐、固紫盐等，使用甲基绿或苏木素进行复染，单核细胞的α-NAE活性表现为强阳性，而未成熟粒细胞如myelocytes和metamyelocytes也能显示阳性反应，早幼粒细胞白血病(M3)阳性强度可比急性单核细胞白血病(M5)、急性粒-单核细胞白血病(M4)更高。现有染色方法可以观察α-NAE活性强弱，但在急性白血病分型时，现有染色方法难以直接区分单核细胞和早幼粒细胞，需要通过NaF抑制试验来区分单核细胞系和粒细胞系白血病，而NaF抑制率大小的判断受人为主观因素影响较大，常给白血病分型和鉴别带来一定困扰。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供α-醋酸萘酚酯酶(α-NAE)染色液(化学染色法)，即α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒，使所述试剂盒应用于检测时能够根据细胞核染后的颜色区分出单核细胞和早幼粒细胞，无需经NaF抑制试验即可快速辅助诊断出单核细胞白血病和粒细胞白血病。
本发明的另一个目的在于提供一种α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒，使所述试剂盒应用于检测时缩短染色时间，提高检测效率。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒，包括固定液、α-醋酸萘酚酯溶液、偶氮染料溶液、缓冲液及漂洗液，所述偶氮染料溶液为碱性蓝54水溶液。
针对现有α-NAE染色法无法区分单核细胞和早幼粒细胞，需要额外借助NaF抑制试验诊断单核细胞白血病和粒细胞白血病以及检测过程中染色时间过长的缺陷，本发明选择碱性蓝54作为本发明试剂盒的偶氮染料，碱性蓝54具有如下化学结构：
在现有方法中，重氮染料常使用坚固蓝B盐、固紫盐等，最后还采用甲基绿或苏木素复染，本发明采用水溶性季偶氮染料碱性蓝54，不仅能与细胞内酯酶水解产物α-萘酚产生黑色沉淀，还可以将单核细胞的细胞核染成红紫色，而其他细胞如粒细胞、淋巴细胞等的细胞核为棕色或深棕色，从而能够更直观、更准确地显示、鉴别出单核细胞，并消除粒细胞对单核细胞系鉴别的干扰影响，同时无需进行复染程序。
在本发明所述试剂盒中，所述固定液可以采用同类方法或试剂盒中常用的固定液，例如甲醛类的固定液，而本发明给出了采用甲醛-丙酮磷酸盐缓冲液作为固定液优选方案，其pH值范围为6.0-7.0，在本发明的具体实施方式中该pH值可以具体选择为6.6。更为优选地，所述固定液中的磷酸盐缓冲液以Na2HPO4·12H2O、KH2PO4来配制，继而再和甲醛、丙酮混合配制。更为优选地，固定液中甲醛和丙酮的体积比为5:9。
本发明试剂盒中的α-醋酸萘酚酯溶液优选采用α-醋酸萘酚酯的丙酮水溶液，其中α-醋酸萘酚酯质量体积百分比浓度为0.5-1.5％(α-醋酸萘酚酯质量/α-醋酸萘酚酯溶液体积的百分比)，丙酮体积百分比浓度为40％-60％(丙酮体积/α-醋酸萘酚酯溶液体积的百分比)。在本发明具体的实施方式中，α-醋酸萘酚酯质量体积百分比浓度为1.0％，例如100mgα-醋酸萘酚酯溶于10mL丙酮水溶液中即为1.0％浓度，其他类似的描述方式均可换算成α-醋酸萘酚酯质量体积百分比浓度；而丙酮体积百分比浓度在具体实施方式中为50％。
本发明所述碱性蓝54水溶液中碱性蓝54质量体积百分比浓度为0.5-5.0％(碱性蓝54质量/碱性蓝54水溶液体积的百分比)。在本发明的具体实施方式中碱性蓝54质量体积百分比浓度为3.0％，例如300mg碱性蓝54溶于10ml蒸馏水即为3.0％浓度，其他类似的描述方式均可换算成碱性蓝54质量体积百分比浓度。
本发明所述缓冲液也叫基础液，优选采用磷酸盐缓冲液，摩尔浓度为0.04-0.08M，pH值为7.0-8.0。在本发明的具体实施方式中，所述缓冲液为pH7.6的0.067M磷酸盐缓冲液，以Na2HPO4·12H2O、KH2PO4来配制。
本发明所述漂洗液优选酸性缓冲液，可选自醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中的一种，摩尔浓度可选择为0.05M-0.15M，pH值范围为2.0～6.0。在本发明的具体实施方式中，所述漂洗液为pH3.6的0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液。
以本发明提供的试剂盒进行α-NAE染色时的步骤可参照如下：
步骤1：取干燥的新鲜血涂片标本，滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，(4℃)30s，水洗；
步骤2：将试剂盒中α-醋酸萘酚酯溶液、偶氮染料溶液置入缓冲液中，混匀后即为基质液，将涂片置入基质液中，37℃染色20min后，吸水纸吸掉多余的染料；
步骤3：染色的血涂片置入漂洗液2s后，立即用吸水纸吸干漂洗液，血涂片用水漂洗3次，待干后即可进行镜检。
上述步骤2中所述基质液中α-醋酸萘酚酯的参考浓度为0.1-0.5mg/mL，碱性蓝54与α-醋酸萘酚酯的参考摩尔浓度比为1:1～4:1，但不仅限于上述所述参考浓度和比例，可视具体检测环境调整。
以本发明提供的试剂盒检测急性单核细胞白血病(M5)和急性早幼粒细胞白血病(M3)患者血细胞，镜检结果显示M5型白血病血细胞中单核细胞系细胞核为亮红紫色，细胞质为红紫色，且单核细胞内α-醋酸萘酚酯酶处形成黑色颗粒沉淀；M3型白血病血细胞中早幼粒细胞系细胞核为棕色或深棕色，胞质内α-醋酸萘酚酯酶处形成黑色颗粒沉淀。检测结果表明本发明试剂盒染色后镜检可以直接区分单核细胞和早幼粒细胞。
而采用现有的α-NAE染色方法时，M5型白血病血细胞中单核细胞系细胞核为绿色，单核细胞内α-醋酸萘酚酯酶处形成黑色沉淀；M3型白血病血细胞中早幼粒细胞系细胞核为绿色，胞质内α-醋酸萘酚酯酶处形成黑色颗粒沉淀。检测结果表明现有的方法无法直接区分单核细胞和早幼粒细胞，需要借助NaF抑制试验进一步区分。
同时，现有的α-NAE染色通常需要1小时左右，复染需要5分钟左右，而采用本发明试剂盒仅需一次染色，染色时间为20分钟左右，显著缩短了检测时间，提高了检测效率。
由以上技术方案可知，本发明试剂盒以碱性蓝54替代现有α-NAE染色方法中的坚固蓝B盐、固紫盐等重氮染料，将染色时间缩短到20分钟左右，而且染色后镜检可直接区分单核细胞和未成熟及成熟粒细胞、淋巴细胞、红细胞，省去细胞核复染步骤，无需NaF抑制试验辅助即可快速诊断出单核细胞白血病和粒细胞白血病，相比现有方法更加简便、快捷。
附图说明
图1所示为用本发明试剂盒染色的M5型白血病患者的血细胞涂片；
图2所示为用本发明试剂盒染色的M3型白血病患者的血细胞涂片；
图3所示为用现有常规方法染色的M5型白血病患者的血细胞涂片；
图4所示为用现有常规方法染色的M3型白血病患者的血细胞涂片。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒进行详细说明。
实施例1：本发明试剂盒及染色方法
1、本发明试剂盒的组成及制备方法
固定液：称取20mgNa2HPO4·12H2O、100mgKH2PO4，加入蒸馏水30ml，溶解后加入45ml丙酮和25ml甲醛，混匀后调节pH值为6.6。
α-醋酸萘酚酯溶液：称取100mgα-醋酸萘酚酯溶于10ml50％丙酮水溶液。
偶氮染料溶液：称取300mg碱性蓝54溶于10ml蒸馏水，颜色为深红色。
缓冲液(基础液)：pH7.6的0.067M磷酸盐缓冲液。
配制方法：A液：称取2.388gNa2HPO4·12H2O加蒸馏水溶解定容至100ml；B液：称取0.908gKH2PO4加蒸馏水溶解定容至100ml。取A液87ml、B液13ml混匀，即得。
漂洗液：pH3.6的0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液。
配制方法：A液：取3.0ml冰醋酸溶于497ml蒸馏水，配制成0.1M冰醋酸溶液；B液：称取1.36g三水合乙酸钠溶于80ml蒸馏水，溶解后蒸馏水定容至100ml，配制成0.1M醋酸钠。取A液185ml、B液15ml混匀后，即得。
2、本发明染色试剂盒的染色方法
(1)取干燥的新鲜血涂片标本，滴加固定液5～8滴，盖满血膜即可，(4℃)30s，水洗。
(2)将实施例1所得1mLα-醋酸萘酚酯溶液和1mL偶氮染料溶液置于28mL缓冲液中，混匀后即为α-NAE基质液。将混匀的α-NAE基质液转移至染缸内，将涂片置入染缸中，37℃染色20min后，吸水纸吸掉多余的染料。
(3)染色的血涂片置入漂洗液2s后，立即用吸水纸吸干漂洗液。血涂片用水漂洗3次，待干后即可进行镜检。
实施例2：现有常规α-NAE染色方法
1、常规染色试剂的组成及制备方法
作用液：0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.6)50ml，α-醋酸萘酚酯100mg溶解于1ml50％丙酮水溶液，充分振荡，直至最初产生的混浊物大部分消失为止，加重氮盐(坚固蓝B)50mg振荡，过滤后使用。
复染液：10g/L甲基绿水溶液。
2、染色方法
(1)固定：新鲜涂片置甲醛蒸汽熏5～10分钟。
(2)水流冲洗5分钟。
(3)入作用液(37℃)1小时，水洗。
(4)10g/L甲基绿水溶液复染5分钟。
(5)水洗、干后镜检。
实施例3：本发明试剂盒染色与现有常规染色方法的比较
采用本发明实施例1试剂盒以及按照实施例2的现有常规染色方法对急性单核细胞白血病(M5)和急性早幼粒细胞白血病(M3)患者血细胞进行染色，结果见图1-图4。
本发明染色结果，M5型白血病血细胞中单核细胞系细胞核为亮红紫色，细胞质为红紫色，且单核细胞内α-醋酸萘酚酯酶处形成黑色颗粒沉淀；M3型白血病血细胞中早幼粒细胞系细胞核为棕色或深棕色，胞质内α-醋酸萘酚酯酶处形成黑色颗粒沉淀。
现有方法染色结果，M5型白血病血细胞中单核细胞系细胞核为绿色，单核细胞内α-醋酸萘酚酯酶处形成黑色沉淀；M3型白血病血细胞中早幼粒细胞系细胞核为绿色，胞质内α-醋酸萘酚酯酶处形成黑色颗粒沉淀。
综合上述两种染色结果可知，M3和M5白血病患者的血细胞用常规方法染色，难以从染色涂片区分出单核细胞和早幼粒细胞，对白血病进行分型，需要通过平行NaF抑制实验来区分，M5单核细胞中阳性NaF抑制率较高，M3早幼粒细胞的NaF阳性抑制率较低。而采用本发明染色试剂盒染色，在不需做平行NaF抑制实验下，根据细胞核染后的颜色能区分出单核细胞和早幼粒细胞，从而可以快速辅助诊断出单核细胞白血病和粒细胞白血病，且染色时间只需20min就可完成染色，整个操作染色时间缩短。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种α-醋酸萘酚酯酶染色试剂盒，其特征在于，包括固定液、α-醋酸萘酚酯溶液、偶氮染料溶液、缓冲液及漂洗液，所述偶氮染料溶液为碱性蓝54水溶液。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述固定液为甲醛-丙酮磷酸盐缓冲液，pH值范围为6.0-7.0。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述甲醛和丙酮的体积比为5:9。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述α-醋酸萘酚酯溶液为α-醋酸萘酚酯的丙酮水溶液。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述α-醋酸萘酚酯溶液中α-醋酸萘酚酯质量体积百分比浓度为0.5-1.5％，丙酮体积百分比浓度为40％-60％。
6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述碱性蓝54水溶液中碱性蓝54质量体积百分比浓度为0.5-5.0％。
7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，摩尔浓度为0.04-0.08M，pH值为7.0-8.0。
8.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述漂洗液为酸性缓冲液。
9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述酸性缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中的一种。
10.根据权利要求8或9所述试剂盒，其特征在于，所述酸性缓冲液摩尔浓度为0.05M-0.15M，pH值范围为2.0～6.0。
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