CN105646418A - 一种丹参丹酚酸b的制备方法及其在视网膜疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丹参丹酚酸B的制备方法及其在视网膜疾病中的应用。通过有机混合溶剂提取去除杂质成分，然后再经常规提取、大孔树脂分离及干燥工艺处理，以超过2%的得率（丹参生药计）得到含量大于90%的丹参丹酚酸B产品，更优的，含量大于95%。在此基础上，开展药效学研究发现丹参丹酚酸B可以通过升高HO-1，降低cleaved？Caspase3蛋白的表达，提高自由基清除剂SOD活性，降低脂质过氧化物MDA的含量及抑制视网膜神经节细胞的凋亡发挥对慢性高眼压视网膜发挥视神经保护作用。

Description

一种丹参丹酚酸B的制备方法及其在视网膜疾病中的应用

技术领域

本发明涉及中药产品的制备方法和用途，特别涉及丹参提取物丹参丹酚酸B的制备及其在治疗和预防视网膜疾病中的应用。

背景技术

视网膜疾病是一类容易引起视力障碍甚至失明的周围神经疾病，主要包括视网膜血管阻塞病，新生血管年龄相关性黄斑变性，增生性糖尿病视网膜病和青光眼等。大量的研究表明，该类疾病的发病机制主要与视网膜缺血再灌注损伤导致的氧化应激，炎症与免疫反应，神经元细胞凋亡坏死及胶质细胞活化等因素相关；此外，高眼压状态下导致的视网膜神经节细胞凋亡也是该类疾病发病的重要机制。

目前，临床上用于治疗视网膜疾病的药物主要有维生素类如VB1，改善微循环类如羟苯磺酸钙，抗胆碱酯酶类新斯的明，β-受体阻滞剂类如贝特舒，α₂-受体激动剂类阿普可乐定，以及前列腺素类苏为坦等。然而，这些针对单一靶点的强效药物在治疗这类由多种疾病网络机制共同调控的复杂性视网膜疾病过程中，并没有取得令人满意的临床效果。不过值得关注的是，近年来，中药在复杂性疾病的治疗过程中取得了较好的治疗效果，显现出了巨大应用价值。有籍于此，越来越多的药物研究工作者意识到，从传统名优中药中二次开发具有与多种致病机制相关的药物将是未来治疗视网膜疾病发展的方向。

丹参注射液，是经典传统活血化瘀中药丹参的水溶性药用部位，临床上除被用于治疗冠心病，脑血栓，神经衰弱和心绞痛等疾病之外，在视网膜疾病的治疗过程中也显示出了良好的治疗效果。药理学研究表明，在鼠视网膜缺血-再灌注动物实验模型中，丹参注射液不但能在形态学上减轻细胞结构的损伤，而且在功能上也有助于视网膜电图b波的恢复，减少视网膜自由基的含量，显示出较强的视网膜神经细胞的保护效应（李岱，易明望，管志华.复方丹参对缺血再灌注损伤鼠视网膜的保护作用.现代中西医结合杂志,2004，13(4):444-446）。然而，进一步药效物质基础研究发现，丹参注射液的主要成分之一丹参素钠在兔视网膜缺血-再灌注中的神经保护作用并不显著，仅在治疗晚期显示出较弱的抑制VEGF生成作用（丁建光，姜德咏，吴荣瀚，李文生.丹参素钠对兔视网膜缺血-再灌注VEGF表达的影响.眼科新进展，2006，26(5)：357-360）。明显的，丹参素钠不能有效阐明丹参注射液防治视网膜疾病的作用。

值得注意的是，丹参丹酚酸B，约占药材总量的4%，不仅是丹参最主要的水溶性成分，而且是丹参发挥抗炎、抗氧化、抗肝脏损伤、抗心肌缺血、抗脑缺血、抗血栓、抗血小板聚集及抗动脉粥样硬化等作用的最重要的药效物质基础。此外，它也是丹参注射液的有效成分之一。鉴于上述丹酚酸B广泛的药理作用及在丹参制剂中的质量标准要求，可以设想，丹酚酸B可能是丹参注射液产生防治视网膜疾病作用的根本药效物质基础。此外，虽然丹参丹酚酸B的含量较高（约占药材总量的4%），但到目前为止，已报道的具有工业化价值的技术方法制备的高含量丹参丹酚酸B的技术方法或多或少存在丹参丹酚酸B得率和含量不能兼顾，工艺操作繁杂，以及产业化成本较高等问题。例如，中国专利CN101759672A公开了一种丹参水溶性提取物、其制剂及用途，需经聚酰胺和大孔树脂连续分离才能得到的含量为90%以上丹参丹酚酸B；再如，中国专利CN101638401A公开了丹参水溶性提取物、其制剂及用途，通过微生物发酵去除迷迭香酸，再经反相树脂分离，得到纯度>99%丹参丹酚酸B。明显的，上述方法或多或少存在延长生产周期、生产控制较难以及生产成本较高的缺点，难以有效满足丹参丹酚酸B作为新型制剂（90%）的产业化开发应用。因此，开发简单、有效且成本低的具有工业化价值的制备高含量丹参丹酚酸B的技术方法具有重要研究价值。

基于上述分析，本发明人通过大量的劳动，发现了一种高含量丹参丹酚酸B的制备方法，并在此基础上开展药理学研究，发现丹酚酸B可以通过升高HO-1（血红素氧化酶-1）和降低cleavedcasepase-3的过表达对视网膜-缺血再灌注损伤发挥神经保护作用；同时，还可以通过提高自由基清除剂SOD（超氧化物歧化酶）活性，降低脂质过氧化物MDA（丙二醛）的含量及抑制视网膜神经节细胞的凋亡发挥对慢性高眼压视网膜发挥视神经保护作用。因此，丹参丹酚酸B对视网膜疾病有治疗和预防的作用。

发明内容

本发明提供了一种丹参丹酚酸B的制备方法和其新用途，可在防治视网膜疾病中应用。如，视网膜血管阻塞病，新生血管年龄相关性黄斑变性，增生性糖尿病视网膜病和青光眼等。

本发明提供一种丹参丹酚酸B的制备方法其在视网膜疾病中的应用，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)去脂丹参生药制备：取粉碎丹参生药，用体积量为3～6倍原料重量的单一或混合有机溶媒提取2～4次，每次1～3小时，分离提取液，得去脂丹参生药；

(2)去脂丹参生药提取：将去脂丹参生药再用体积量为3～7倍原料重量的醇水溶液提取2～3次，每次1～12小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味；

(3)丹参丹酚酸B分离：将上述提取浓缩液，用大孔树脂、聚酰胺树脂等反相填料分离，经0～80%(V/V)C₁～C₂溶液梯度洗脱，收集含丹参酚酸B部分；

(4)丹参丹酚酸B干燥：将含丹参丹酚酸B的洗脱液减压浓缩，干燥，得到丹参丹酚酸B提取物。

优选的，制备方法步骤(1)中有机提取溶液选自乙醚、乙酸丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、甲基叔丁基醚、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇和水中的一种或几种混合有机溶液。

优选的，制备方法步骤(1)中提取所用的时间为1～6小时，共提取3次。

优选的，制备方法步骤(2)中的提取方法选自冷浸、渗漉、回流提取及超声提取中的一种或几种。

优选的，制备方法步骤(2)中的去脂丹参生药回流及超声提取丹参酚酸B所用的时间为1～4小时，提取2次。

优选的，制备方法步骤(2)中的去脂丹参生药回流及超声提取丹参酚酸B所用的醇水溶液为浓度60～80%的C₁～C₂醇水溶液。

优选的，制备方法步骤(2)中的去脂丹参生药冷浸及渗漉提取所用的时间为12小时，提取2次。

优选的，制备方法步骤(2)中的去脂丹参生药冷浸及渗漉提取丹参酚酸B所用的醇水溶液为浓度0～5%的C₁～C₂醇水溶液。

优选的，制备方法步骤(3)中的大孔树脂包含但不限于下列树脂中的一种或几种。如：HP-20、H103、HPD-80、HPD-100、HPD-100B、HPD-200A、HPD-300、HPD-450、HPD-722、HPD-826、HP-20、ADS-8、ADS-21、D101、AB-8等。

优选的，制备方法步骤(3)中所用的0～80%(V/V)的C₁～C₂醇水梯度洗脱方法为：0～20%（V/V）C₁～C₂醇水洗脱4～8个填料容积量的柱体积去掉紫草酸等杂质，20～50%(V/V)C₁～C₂醇水洗脱6～8个填料容积量的柱体积，得到丹参丹酚酸B。

优选的，制备方法中干燥所用的方法选自减压干燥、冷冻干燥、真空干燥、及喷雾干燥中的一种或几种。

优选的，制备方法得到的丹参丹酚酸B的含量大于等于90%，更优的大于等于95%。

优选的，制备方法所得丹参丹酚酸B可制备成药物制剂组合物并用于预防和治疗人类视网膜疾病。

优选的，丹参丹酚酸B可以通过升高HO-1（血红素氧化酶-1），cleavedcasepase-3的表达对视网膜-缺血再灌注损伤发挥神经保护作用。

优选的，丹参丹酚酸B可以通过提高自由基清除剂SOD（超氧化物歧化酶）活性，降低脂质过氧化物MDA（丙二醛）的含量及抑制视网膜神经节细胞的凋亡发挥对慢性高眼压视网膜发挥视神经保护作用。

本发明所述丹酚酸B，可根据现有技术制备，符合药用标准即可。优选丹酚酸B纯度﹥70%，更优选纯度﹥90%，最优选纯度﹥98%。

本发明技术特点在于：

第一，本发明首次报道丹参生药材首先通过有机及其混合溶剂提取，不但可以去掉脂溶性成分丹参酮类化合物，而且可以有效去掉丹参总酚酸中的部分游离酸，如咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸等，从而为得到含量超过90%的丹参酚酸B提供了重要保证。与我们之前公开的专利CN104130226A相比，具有生产操作简单，不会产生萃取可能存在的乳化现象等优点，更具工业化生产价值。

第二，本发明得到的去脂及部分游离酸的丹参醇水提取物，再经简单的大孔树脂分离，便以约3%的得率（丹参生药计）得到含量超过90%的丹参丹酚酸B产品。本工艺简单、高效、经济，体现出显著的新颖性和创造性。

第三，本发明首次发现丹参丹酚酸B可以通过升高HO-1（血红素氧化酶-1），降低cleavedCaspase3蛋白的表达，提高自由基清除剂SOD（超氧化物歧化酶）活性，降低脂质过氧化物MDA（丙二醛）的含量及抑制视网膜神经节细胞的凋亡发挥对慢性高眼压视网膜发挥视神经保护作用。体现出显著的创造性和新颖性。

以下通过实验数据证明本发明的有益效果：

第一、丹参丹酚酸B提取溶剂确认

具体实验方法：

对照实验：取100克丹参药材，按照已有专利CN101721467A中所述制备方法得到丹参总酚酸，通过高效液相色谱测定紫草酸、迷迭香酸及丹参酚酸B含量，并计算丹参酚酸B提取率。其中，丹参多酚酸类化合物含量测定方法按照专利CN104130226A所述方法进行测定。实验结果见表1。

实验1～12：取丹参药材100克，每次加600毫升有机溶剂溶液，在回流条件下提取2小时，共提取三次，分离提取液；然后将经有机溶剂提取后的丹参药材再经75%乙醇水溶液600毫升回流提取，每次2小时，共提取三次，合并提取液，通过高效液相色谱HPLC测定紫草酸、迷迭香酸及丹参丹酚酸B面积归一法纯度，并计算丹参丹酚酸B提取率。实验结果见表1。

如表1实验结果显示，（1）与传统丹参总酚酸的提取工艺CN101721467A相比，丹参药材通过丙酮、甲醇及乙醇等有机溶剂提取后，再经醇水溶液提取所得丹参总酚酸中迷迭香酸杂质含量显著降低（实验5～12），即有机溶剂及其混合溶剂提取，不但可以将丹参酮等脂溶性的成分分离，还可以去掉那些游离酸酚酸类成分，如迷迭香酸等。（2）比较有机溶剂提取效果发现，以所得丹参总酚酸中迷迭香酸的含量和丹参丹酚酸B提取率为考察标准，其中混合有机溶剂如丙酮-乙醇的提取效果较好（实验10）。

第二、丹参酚酸B提取方法的选择

具体实验方法：取粉碎的丹参药材800克，每次加5升乙酸乙酯-乙醇（9:1，体积比）溶液，在回流条件下提取2小时，共提取三次，分离提取液，然后将经有机溶剂提取后的丹参药材平均分成8份，待下一步提取。其中，丹参多酚酸类化合物含量测定方法按照专利CN104130226A所述方法进行测定。

回流提取实验1～3：取经有机溶剂提取后的丹参生药材，然后用不同浓度的乙醇水溶液600毫升回流提取，共提取三次，合并提取液，通过高效液相色谱测定紫草酸、迷迭香酸及丹参丹酚酸B含量，并计算丹参丹酚酸B提取率。实验结果见表2。

渗漉提取实验4～5：取经有机溶剂提取后的丹参生药材，然后用不同浓度的乙醇水溶液800毫升浸泡过夜，然后用1000毫升乙醇水溶液渗漉，流速控制在10mL/min，通过高效液相色谱测定紫草酸、迷迭香酸及丹参丹酚酸B含量，并计算丹参丹酚酸B提取率。实验结果见表2。

冷浸提取实验6～7：取经有机溶剂提取后的丹参生药材，然后用不同浓度的乙醇水溶液600毫升浸泡，每次6小时，共提取三次，合并提取液，通过高效液相色谱测定紫草酸、迷迭香酸及丹参丹酚酸B含量，并计算丹参丹酚酸B提取率。实验结果见表2。

超声提取实验8～9：取经有机溶剂提取后的丹参生药材，然后用不同浓度的乙醇水溶液600毫升超声提取，每次2小时，共提取三次，合并提取液，通过高效液相色谱测定紫草酸、迷迭香酸及丹参丹酚酸B含量），并计算丹参丹酚酸B提取率。实验结果见表2。

对照实验：取丹参生药材100克，参照已有专利CN101721467A方法，用70%醇水溶液600毫升回流提取，每次2小时，共提取三次，合并提取液，通过高效液相色谱测定紫草酸、迷迭香酸及丹参丹酚酸B含量，并计算丹参酚酸B提取率。实验结果见表2。

上述实验结果表明，（1）采用浓度为70%乙醇水溶液回流提取时，所得丹参酚酸B的提取率最高（实验1），而低浓度的20%乙醇水在回流提取时，导致大量丹参酚酸B降解，这可能是温度过高所致（实验2）；（2）其次，不同浓度的乙醇水溶液在室温下渗漉、冷浸及超声提取时，其丹参酚酸B的提取效果相近（实验4～6，实验7～10）；（3）此外，比较实验1和3可知，在相近的提取效果下，去脂丹参生药比丹参生药所用的提取时间更短，即去脂丹参生药提取丹参酚酸B效率更高；这一结果在渗漉提取实验5和6中也得到进一步证明。（4）综上可知，去脂丹参生药在回流、渗漉、冷浸及超声几种提取条件下，其有效成分丹参酚酸B的提取效率都有显著提高。

附图说明

图1是实施例1去脂丹参生药提取丹参酚酸B高效液相色谱图。

图2是实施例1所得丹参酚酸B高效液相色谱图。

图3是大鼠视网膜缺血再灌注损伤后不同时间点MDA含量变化曲线。

图4是大鼠视网膜缺血再灌注损伤后不同时间点SOD含量变化曲线。

图5是大鼠视网膜缺血再灌注损伤后HO-1蛋白表达变化。

具体实施例

下面给出实施例阐明本发明，以供进一步理解该发明，而不是为了限制本发明的使用范围。

实施例1含量大于95%的丹参丹酚酸B的制备

将粉碎后的1公斤丹参药材依次用7升、6升和5升的丙酮-甲醇（8:1，V/V）溶液在回流条件下提取3次，每次2小时，分离提取液；将剩余的去脂丹参生药用8升浓度为75%的乙醇水溶液回流提取3次，合并3次提取液，并于45℃水浴温度下减压浓缩至无醇味，得丹参总酚酸浓缩液。将上述含丹参酚酸B的浓缩液于室温下（25℃），经3升大孔树脂D101层析（批号：110405，沧州宝恩树脂），分别用0、20%甲醇水溶液各洗脱6和4个树脂柱体积，然后用40%甲醇水洗脱6个树脂体积，流速为80mL/min，HPLC检测，收集丹参丹酚酸B含量超过95%的洗脱液，减压浓缩至干，再经喷雾干燥，得到丹参丹酚酸B含量为96.2%的固体24.2g，丹参酚酸B以生药计得率为2.33%。

实施例2含量大于90%的丹参丹酚酸B的制备

将粉碎后的1公斤丹参药材依次用7升、6升和6升的丙酮-95%乙醇（9:1，V/V）溶液在回流条件下提取3次，每次2小时，分离提取液；将剩余的去脂丹参生药于室温下（25℃），依次用6升的水溶液浸泡3次，每次8小时，合并提取液；所得提取液于室温下（25℃），经2升大孔树脂HP20层析（批号：081104,日本三菱化学公司），分别用0、12%乙醇水溶液各洗脱8和2个树脂体积，然后用25%乙醇水洗脱6个树脂体积，流速为100mL/min，HPLC检测，收集丹参酚酸B含量超过90%的洗脱液，减压浓缩至无醇味；用1moL/L盐酸调节pH至2，乙酸乙酯（2升）萃取三次，合并乙酸乙酯层，并减压浓缩至干，加入30mL去离子水溶解并冷冻干燥，得到丹参酚酸B含量为91.6%的固体28.4g，丹参酚酸B以生药计得率为2.60%。

实施例3丹参丹酚酸B对大鼠视网膜缺血再灌注损伤失的保护作用

本研究通过升高大鼠眼内压造成视网膜缺血后，再恢复正常眼内压而建立大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型。通过研究假手术组、缺血对照组、丹参丹酚酸B治疗组在再灌注后不同时间段视网膜神经节细胞凋亡情况、cleavedCaspase3蛋白表达水平、视网膜组织MDA含量、SOD活性水平变化，以及HO-1含量的差异，评价丹参丹酚酸B对视网膜缺血再灌注损伤的保护作用及其作用机制。

材料和方法

动物

6-8周龄正常雄性Wistar大鼠（200～250g），大连医科大学实验动物中心提供，外眼及眼底检查均正常，室温环境饲养。

试剂

丹参丹酚酸B（SAB）来自制备实施例1所得产品。盐酸丙美卡因购自南京瑞年百思特制药有限公司。复方托吡卡胺滴眼液购自沈阳圣元药业有限公司。大鼠cleavedcasepase-3，HO-1抗体购自santacruz。TUNEL凋亡细胞检测试剂盒（默克QIA39）。免疫组化化学检测试剂盒购自北京中杉生物工程有限公司。浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉生物工程有限公司。SOD试剂盒和MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。其他试剂如柠檬酸钠，戊巴比妥钠，PBS缓冲液（NaCl4.0g，KCl0.1g,Na₂HPO₄0.72g，KH₂PO₄0.12g，用水定容至500mL，pH7.4），4%多聚甲醛等均按照市售最高级别并根据实验需要分别配制。

高眼压诱导视网膜缺血模型的制备：

对照组：将20g·L^-1的戊巴比妥钠溶液，按40mg·kg^-1体质量剂量腹腔注射作全身麻醉Wistar大鼠，实验中追加量为15mg·kg^-1体质量。将Wistar大鼠固定于立体定位仪上，复方托吡卡胺滴眼液散瞳后（随机选择造模眼睛），盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，将连接0.9%生理盐水的4号头皮针沿耳前方角巩膜缘内刺入前房，打开静脉注射装置并升高生理盐水瓶150cm高度至产生110mmHg压迫，造成并维持缺血时间60min，此时外观可见眼球结膜苍白。60min后将输液瓶高度缓慢降低至动物眼球水平，关闭输液器，拔出灌注针头，观察到缺血一侧的眼球在针头拔出时瞬间充血恢复血色。实验过程中利用室内空调，维持动物体温36.5℃～37.0℃。

治疗组：Wistar大鼠麻醉生效后，于尾静脉注射丹参酚酸B。30分钟后同对照组方法制备视网膜缺血-再灌注模型，并于再灌注开始注射相同剂量的丹参酚酸B一次。

假手术组（低压灌注组）：麻醉模型同对照组，所不同的为灌注产生20mmHg（生理盐水瓶高度27cm）眼内压迫。

分组与给药

取Wistar大鼠100只，随机分为4组。A组：空白对照组，10只（8眼）不做任何处理；B组：假手术组，低压灌注组30只；C组：溶剂对照组，视网膜缺血-再灌注组30只；D组：治疗组，丹参酚酸B组30只。通过尾静脉注射的方式给药，在诱导Wistar大鼠高压视网膜缺血再灌注之前30分钟给予C组溶剂和D组丹参丹酚酸B（按质量10.0mg/Kg给药SAB）。

标本制备

视网膜组织切片的制备：根据各组不同再灌注时间，分别于恢复再灌注后0h、6h、24h、48h和72h处死B、C、D组各3只鼠（注射20g·L^-1戊巴比妥钠过量麻醉致死），同时取正常大鼠2只作为正常对照，无菌操作摘除眼球（10眼），置于冰生理盐水中，剪开角巩膜缘，置于4%多聚甲醛溶液中固定24h。流动自来水冲洗，于显微镜下平行于视神经纵行剖开，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。矢状面眼球连续切片，片厚4μm，贴于预先用多聚赖氨酸处理好的载玻片上，60℃温箱烤片过夜。切片分采用TUNEL（即脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）染色计数凋亡阳性细胞，计数cleavedCaspase-3的蛋白表达阳性细胞。

视网膜组织匀浆上清液的制备：根据各组不同再灌注时间，分别于恢复再灌注后0h、6h、12h、24h和72h处死B、C、D组各3只鼠（过量麻醉致死），摘除眼球（6眼），分别置于冰生理盐水中，剪开角巩膜缘，弃去眼前节及玻璃体，钝性剥离视网膜，称量视网膜湿重，分成两份，按1:50比重一份加入蛋白裂解液，一份加入生理盐水，组织匀浆，台式离心机（effendorf公司）4℃，10000g，离心10min，收集上清液于试管中，-20℃冰箱（中国海尔公司）中储存。

视网膜节细胞凋亡的检测

采用TUNEL试剂盒并按照试剂盒说明进行检测。具体操作简述如下：石蜡切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢溶液处理，蒸馏水洗涤；所得切片加TBS1:200新鲜稀释蛋白酶K于37℃消化15min，TBS洗涤；滴加标记缓冲液（LabelingBuffer），15μl/片，按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl，加入15μl标记缓冲液中，混匀。甩去多余液体后加标记液，15μl/片。放入湿盒中，37℃标记2h。TBS洗涤，加封闭液20μl/片，室温30min后甩掉封闭液。用浓度1:100封闭液稀释生物素化抗地高辛抗体，20μl/片，加至标本片上，置入湿盒中，37℃反应30min。TBS洗涤，TBS1:100稀释SABC，DAB显色30min左右，蒸馏水洗终止。苏木素轻度复染，TBS洗，蒸馏水洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，OLYMPUS光学显微镜（日本Olympus公司）下观察，每只眼球取一张切片，连续计数5个视野（面积为0.2mm×0.2mm），用图像分析计数系统对凋亡神经节细胞切片进行图像分析，计数视野中200个细胞并记录各组不同时间的细胞凋亡平均发生数，计算出凋亡指数（apoptoticindex，AI），AI=细胞凋亡数/细胞总数×100﹪，阳性细胞以胞膜或胞浆中出现棕黄色或棕褐色颗粒为准。

免疫组化检测cleavedCaspase3蛋白的表达

采用SP免疫组织化学染色法测定。具体操作按照试剂盒说明并简述如下：石蜡切片常规脱蜡复水，微波修复抗原，3%过氧化氢浸泡灭活内源性过氧化物酶，柠檬酸缓冲液（0.01mol/LPBS）热修复，滴加正常山羊血清封闭后加适当浓度稀释的一抗（cleavedCaspase3抗体浓度为1:100），置于4℃冰箱过夜，次日依次加二抗孵育1h，HRP（辣根过氧化物酶）标记的链酶卵白素孵育1h，清洗后光学显微镜下观察显色情况，蒸馏水终止显色，苏木素复染，分化，返蓝半小时以上，常规脱水，透明，中性树胶封片观察（阴性对照：以PBS代替一抗，其余不变）。图像分析系统对切片进行图像分析，测算其平均光密度，胞膜或胞浆中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。

脂质过氧化物丙二醛（MDA）含量测定

采用硫代巴比妥酸法（TBA）测量MDA含量，具体操作简述如下：取待测生理盐水组织匀浆上清液样品0.1mL作检测。分别在标准管、标准空白管、测定管中加入TBA或样品，用旋涡混匀器充分混匀，100℃水浴40min，流水冷却至室温，台式低温离心机3500r/min离心10min，取200μl上清液倒入1cm光径比色杯中，蒸馏水调零，721-分光光度仪于532nm波长下比色测定各管A值，按公式计算组织中MDA含量。

超氧化物歧化酶（SOD）含量测定

采用黄嘌呤氧化酶法（XOD）测量SOD含量，具体操作简述如下：取待测生理盐水组织匀浆上清液样品50μl作检测。分别在测定管及对照管加入试剂或样品，用旋涡混匀器充分混匀，置37℃水浴40min,然后加入显色剂2mL混匀，室温放置10min后倒入1cm光径比色杯中，蒸馏水调零，721-分光光度仪于532nm波长下比色测定各管A值，按公式计算组织中的SOD含量。

检测和血红色氧化酶-1（HO-1）蛋白表达

用WesternBlotting检测血红色氧化酶-1（HO-1）蛋白表达，具体操作简述如下：制备10%SDS-PAGE胶，将样品与适量加样缓冲液混合后，100℃变性10min，冷却后上样。以80V的电压进行电泳，20min后，把电压提高到120V，电泳至所需位置。取出凝胶切成适当大小的长方形，转膜。将PVDF膜在甲醇中平衡5min，然后将海绵、滤纸、PVDF及凝胶依次放好，调整电流到350mA，转膜2h。将膜取出，转移至塑料自封袋中，加入10mL封闭液，1h。将封闭液倒出，将5mL一抗溶液加入至自封袋中。4℃下，在水平摇床上孵育过夜。室温下，将膜在PBST缓冲液中漂洗3次，每次15min。同一抗操作，加入5mL二抗溶液,室温孵育1h。将膜在PBST缓冲液中漂洗3次，每次15min。使用ECL发光液，然后暗室曝光。表达指数（expressionindex，EI）EI=条带灰度值_目的蛋白/条带灰度值_beta-Actin。

统计学处理

应用Spss17.0统计软件进行处理。数据计数资料采用均数±标准差（±s）表示，两组样本均数差别的比较用t检验，方差分析同一组内不同时间点数据差异。P﹤0.05表示差异有统计学意义。

实验结果：

TUNEL法检测视网膜节细胞凋亡表达

实验结果如表3所示：A组（空白对照）和B组（假手术阴性对照）仅有少量细胞凋亡，凋亡指数小于2%；C组（对照组）视网膜缺血再灌注6h可见少量凋亡细胞表达，在再灌注24h时凋亡指数达高峰的32.56%，48h表达逐渐减少，72h时阳性表达仍可见。D组（治疗组）与C组相比，在各个时间点上凋亡细胞数均有一定程度的减少，两组各时点凋亡指数比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3.大鼠视网膜缺血再灌注损伤后不同时间点细胞凋亡指数（AI）

组别	再灌注0 h	再灌注6 h	再灌注24 h	再灌注48 h	再灌注72 h
						A（空白对照组）	1.10±0.07	-	-	-	-
B（假手术组）	1.62±0.09	2.12±0.15	2.03±0.13	2.33±0.16	2.25±0.14
						B（溶剂对照组）	1.84±0.11	5.74 ±0.43	32.56±2.82	16.43±0.91	7.23 ±0.69
D（治疗组）	1.81±0.10	4.07±0.34	17.26±1.25	9.27±0.72	3.35±1.02

﹡B与C组、B组与D组、C组与D组间存在统计学显著性（P<0.05）。

免疫组化检测cleavedCaspase-3蛋白表达

实验结果如表4所示：A组（空白对照）和B组（假手术阴性对照）仅有少量cleavedCaspase-3阳性表达，且B组各时间点cleavedCaspase-3阳性表达结果无显著性差异（P>0.05）；C组（溶剂对照组）在视网膜缺血再灌注6h可见大量cleavedCaspase-3蛋白表达，且在24～72h期间时cleavedCaspase-3蛋白阳性表达仍处于高位表达，与B组及C组相比有显著性差异（P<0.01）；D组（治疗组）与C组相比，其光密度平均值在对应的各个时间段有较大程度的降低，且至72h时接近基线水平。

表4.大鼠视网膜缺血再灌注损伤后cleavedcaspase-3蛋白表达水平（x±s）

组别	再灌注0 h	再灌注6 h	再灌注24 h	再灌注48 h	再灌注72 h
						A（空白对照组）	0.26±0.013	-	-	-	-
B（假手术组）	0.26±0.015	0.25±0.023	0.28±0.028	0.26±0.015	0.27±0.018
						C（对照组）	0.28±0.019	0.43±0.037	0.42±0.034	0.41±0.045	0.40±0.015
D（治疗组）	0.27±0.026	0.37±0.019	0.34±0.023	0.33±0.021	0.31±0.025

﹡B与C组、B组与D组、C组与D组间存在统计学显著性（P<0.05）

TBA法检测视网膜组织MDA含量表达

实验结果如表5及图3所示：缺血再灌注0h，A组（空白对照）、B组（假手术阴性对照）、C组（对照组）、D组（治疗组）视网膜组织MDA含量表达无明显差异（P>0.05）；C组（溶剂对照组）在视网膜缺血再灌注6h可见大量MDA表达，且在24～72h期间MDA含量持续高于B组；D组（治疗组）再灌注6～24h后MDA含量较正常对照组高，再灌注0h和72h的MDA含量较B组无显著性差异（P>0.05）。C组和D组再灌注6～72h均有显著性差异（P<0.05）。

表5.大鼠视网膜缺血再灌注损伤后不同时间点MDA含量（nmol/mgprot)

组别	再灌注0 h	再灌注6 h	再灌注24 h	再灌注48 h	再灌注72 h
						A（空白对照组）	5.06±0.23	-	-	-	-
B（假手术组）	5.14±0.24	5.25±0.28	5.23±0.37	5.16±0.19	5.20±0.23
						C（对照组）	5.27±0.39	9.43±0.82	11.52±0.53	8.81±0.49	6.67±0.42
D（治疗组）	5.12±0.26	7.37±0.59	8.34±0.43	7.01±0.41	5.18±0.35

﹡B与C组、B组与D组、C组与D组间存在统计学显著性（P<0.05）

XOD法检测视网膜组织SOD含量表达

实验结果如表6及图4所示：缺血再灌注0h，A组（空白对照）、B组（假手术组）、C组（溶剂对照组）及D组（治疗组）视网膜组织SOD含量表达无明显差异（P>0.05）；C组（溶剂对照组）在视网膜缺血再灌注6h可见SOD表达降低，且在24～72h期间SOD含量持续低于B组；D组（治疗组）再灌注6～72h后SOD含量较溶剂对照组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表6.大鼠视网膜缺血再灌注损伤后不同时间点SOD含量表达（U/mgprot)

组别	再灌注0 h	再灌注6 h	再灌注24 h	再灌注48 h	再灌注72 h
						A（空白对照组）	163.23±7.23	-	-	-	-
B（假手术组）	163.14±6.24	162.25±7.28	164.19±6.37	161.56±6.19	162.20±6.23
						C（对照组）	160.47±7.39	148.43±6.32	130.71±5.53	123.88±5.49	116.76±4.42
D（治疗组）	162.91±7.26	157.33±7.59	152.32±6.43	147.11±6.41	142.18±5.35

﹡B与C组、B组与D组、C组与D组间存在统计学显著性（P<0.05）

Western检测HO-1蛋白表达

实验结果如表7及图5所示：A组（空白对照）和B组（假手术阴性对照）仅有少量HO-1阳性表达，且B组各时间点HO-1阳性表达结果无显著性差异（P>0.05）；C组（溶剂对照组）在视网膜缺血再灌注6h可见HO-1蛋白表达量有所增加，24h表达逐渐增多，48～72h时HO-1阳性表达趋于平缓接近基线水平，但与A组及B组相比仍有显著性差异（P＜0.05）；D组（治疗组）与C组相比，其HO-1表达变化趋势类似，但在各个时间点上HO-1蛋白表达均有一定程度的增加，且至72h时仍未达到基线水平，且两组各时点除0h外蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.05）。

表7.大鼠视网膜缺血再灌注损伤后HO-1蛋白表达变化（x±s,x=条带灰度值_HO-1/条带灰度值_beta-Actin）

组别	再灌注0 h	再灌注6 h	再灌注24 h	再灌注48 h	再灌注72 h
						A（空白对照组）	0.657±0.023	-	-	-	-
B（假手术组）	0.676±0.034	0.737±0.041	0.768±0.034	0.748±0.032	0.698±0.025
						C（对照组）	0.692±0.031	0.840±0.045	0.943±0.043	0.711±0.045	0.706±0.038
D（治疗组）	0.682±0.042	1.079±0.051	1.152±0.036	0.962±0.051	0.946±0.041

﹡B与C组、B组与D组、C组与D组间存在统计学显著性（P<0.05）

综上，本实施例通过升高大鼠眼内压造成视网膜缺血后，再恢复正常眼内压建立了大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型。在此基础上，设置假手术组、缺血对照组、丹参丹酚酸B治疗组，并系统研究它们在视网膜缺血再灌注后不同时间段的主要指标的表达情况，结果发现丹参丹酚酸B可以通过升高HO-1（血红素氧化酶-1），降低cleavedCaspase3蛋白的表达，提高自由基清除剂SOD（超氧化物歧化酶）活性，降低脂质过氧化物MDA（丙二醛）的含量及抑制视网膜神经节细胞的凋亡发挥对慢性高眼压视网膜发挥视神经保护作用。

Claims (10)

1.一种丹参丹酚酸B的制备方法及其在视网膜疾病中的应用，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)去脂丹参生药制备：取粉碎丹参生药，用体积量为3～6倍原料重量的单一或混合有机溶媒提取2～4次，每次1～3小时，分离提取液，得去脂丹参生药；

(2)去脂丹参生药提取：将去脂丹参生药再用体积量为3～7倍原料重量的醇水溶液提取2～3次，每次1～12小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味；

(3)丹参丹酚酸B分离：将上述提取浓缩液，用大孔树脂、聚酰胺树脂等反相填料分离，经0～80%(V/V)C₁～C₂溶液梯度洗脱，收集含丹参酚酸B部分；

(4)丹参丹酚酸B干燥：将含丹参丹酚酸B的洗脱液减压浓缩，干燥，得到丹参丹酚酸B提取物。

2.根据权利要求1所述，其特征在于，制备方法步骤（1）中有机提取溶液选自乙醚、乙酸丙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酮、甲基叔丁基醚、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、水以及它们两两的混合溶液。

3.根据权利要求1所述，其特征在于，制备方法步骤（2）中的提取方法选自冷浸、渗漉、回流及超声提取中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述，其特征在于，制备方法步骤（3）中所用的0～80%（V/V）的C₁～C₂醇水梯度洗脱树脂的方法为：0～20%（V/V）C₁～C₂醇水洗脱4～8个填料容积量的柱体积去掉紫草酸等杂质，20～50%（V/V）C₁～C₂醇水洗脱6～8个填料容积量的柱体积，得到丹参丹酚酸B。

5.根据权利要求1所述，其特征在于，制备方法步骤（4）中干燥所用的方法选自减压干燥、冷冻干燥、真空干燥、及喷雾干燥中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述，其特征在于，所得丹参丹酚酸B的含量为90%及以上，更优的大于等于95%且小于100%。

7.根据权利要求1所述，其特征在于，制备方法所得丹参丹酚酸B在制备一种治疗和预防视网膜疾病中的应用。

8.根据权利要求7所述，其特征在于，所述丹参丹酚酸B对慢性高眼压视网膜发挥视神经保护作用。

9.根据权利要求7所述，其特征在于，所述丹参丹酚酸B被制成重量百分比0.1～99.9%的药物制剂组合物用于人类视网膜疾病。

10.根据权利要求9所述，其特征在于，所述丹参丹酚酸B药物制剂组合物的剂型包括：片剂、颗粒剂、口服剂、微丸剂、滴丸剂、粉针剂、水针剂、输液剂、胶囊剂及其他药物制剂。