CN105628784A

CN105628784A - 大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法

Info

Publication number: CN105628784A
Application number: CN201610168260.9A
Authority: CN
Inventors: 吴正治; 曹美群; 孙珂焕; 黄飞娟; 谢梦洲; 贺佐梅
Original assignee: Shenzhen Institute of Gerontology
Current assignee: Shenzhen Institute of Gerontology
Priority date: 2016-03-23
Filing date: 2016-03-23
Publication date: 2016-06-01
Anticipated expiration: 2036-03-23
Also published as: CN105628784B

Abstract

本发明公开了一种大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，包括以下步骤：样品收集；纳米磁珠预处理；样品预处理；唾液样品洗脱上样；质谱分析；数据采集；数据分析；建立诊断模型。本发明将WCX与MALDI-TOF-MS技术相结合，进一步探索肠癌患者唾液差异表达蛋白，发现了312个肠癌差异蛋白质峰，其中有37个差异蛋白质峰有统计学意义。选取m/z为2501.26、4779.95、3140.39建立肠癌组与正常对照组的判别模型，该模型的灵敏度和特异度均高，采用十字交叉验证，灵敏度和特异度分别为85％、88％，可见该模型对肠癌的诊断具有一定的价值。

Description

大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法

技术领域

本发明属于蛋白质谱应用技术领域，具体地说，涉及一种大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法。

背景技术

结直肠癌(CRC)是世界范围内男性和女性第三个常见的癌症，是胃肠道常见的恶性肿瘤，以41-65岁发病率最高。肠癌如果早期发现5年生存率可达90％，而有转移的进展期大肠癌其5年生存率低于10％。

内窥镜检查仍然是大肠癌诊断的金标准，虽然内镜设备得到了一次次升级变革，从传统的全结肠电子内镜到放大内镜及染色内镜、窄带内镜(NBI)、自发荧光内镜(AFE)、共聚焦激光显微内镜(CEM)、超声内镜(EUS)、结肠胶囊内镜(CCE)等各项先进技术在内镜中的应用，提高了分辨率，但仍然价格昂贵而又对人体伤害较大，这严重限制了大肠癌的早期诊断。而新近发展起来的大肠癌肿瘤标志物检测，单项指标检测准确率低，多项指标联合检验虽可一定程度上提高检测的准确性，但结果的准确性(＜70％)仍不能满足临床诊断肠癌需要，且血液检测亦为有创检测。目前为止还没有一个快速、准确而又适合于大规模筛查的大肠癌早期诊断方法，因此，寻求一个简便、快速、准确率高的无创伤检查新方法势在必行。

随着质谱仪的发展和蛋白质组学研究的而深入，产生了蛋白质指纹图谱的诊断新技术，该技术是通过质谱分析不同疾病血清中有许多潜在的生物标志物，通过质谱定量和定性分析这些生物标志物可用于疾病的诊断。该方法已经成功的用于研究SARS、癌症等诊断标志物。

目前蛋白指纹图谱技术在肠癌的研究主要有：大肠癌(CRC)与正常人的鉴别诊断、大肠癌无转移(CRC)与大肠癌肝转移(同时性肝转移(SLM)/异时性肝转移(MLM))的鉴别、大肠良性病变与大肠癌鉴别，以及大肠癌预后模型等。采用蛋白质组学技术进行大肠癌研究，各研究者均得到敏感性、特异性、准确性较高的分子诊断模型，然而，各研究者所筛选得到的差异蛋白质峰差异很大。CRC与正常对照组的差异蛋白对比研究，柳俊刚等发现M/Z为3223.43、7971.57、11493.00；崔丹瑜等发现M/Z为5909、5341、2685、2811、3928、6635、8933；林建军等发现M/Z为2870.7、3084.0、9180.5、13748.8；张巍等发现为2974、3282、5948、2957、2982、5920、6647、6661；LiaoCC等发现1800-16000Da范围内的73个峰；XuW发现15个差异蛋白(2900-9000Da)；周智勇等发现26个下调蛋白、52个上调蛋白，范围在4000Da-1110Da。CRC无转移与CRC肝转移的差异蛋白对比研究，柳俊刚等发现M/Z为3223.43、3511.88、8894.49；崔丹瑜等发现在肝转移组M/Z为7570、7795、7939、8137、8925、9196、11814、7837低表达，而M/Z为5813蛋白点高表达。肠良性病变与CRC差异蛋白对比研究，XuW等发现M/Z为3570、3101、4869在腺瘤组高表达，在CRC组低表达；张巍等发现M/Z为3016、66172个蛋白点在两组比较中差异显著。李小琼等对正常组、良性病变组以及CRC(术前)组三者的差异蛋白研究发现7个差异点，M/Z分别为4955、5325、5890、6615、7739、8109、8575.于新哲等发现，结直肠癌无转移(CRC)对比结直肠癌异时性肝转移组(MLM)，得到0个差异蛋白峰，无统计学差异(P>0.05)；MLM对比SLM，得到1个差异蛋白峰，M/Z＝4355.26(P＜0.05)；由此可见，实验可重复性不足，可能与实验中样品的预处理方法(芯片的种类、厂家、批号等)、试验操作者技能水平、研究者所采取的质谱方法(MALDI、SELDI或其他)、数据分析方法(SVM、留一法等)等不一致有关。

现有研究多针对肠癌患者血液标本或者组织标本的有创检测，受试者依从性差，不利于反复采样、实时动态监测以及人群盲筛推广，具有一定的限制性，不能广泛应用。

因此，提供一种诊断模型简便、快速、标本用量少，灵敏度高，特异性好的大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型的建立方法，就成为该技术领域急需解决的技术难题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决现有肠癌检测技术对受试者依从性差，检查方法复杂，灵敏度低的问题，提供了一种大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，包括以下步骤：

(1)样品收集；

(2)纳米磁珠预处理；

(3)样品预处理：取出冷冻保存的唾液样品，冰上解冻，所有唾液样品均1次冻融，取5μl唾液加入10μl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μl的WashBuffer稀释(唾液最终上样量为2.5μl)；

(4)唾液样品洗脱上样：③向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入100μl预处理后的唾液样品，混匀，置于室温孵育30min，将PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；④每管加入100μl的WashBuffer洗脱5min，然后将PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；再重复步骤④操作一次，以洗脱更干净，获得较纯的目的蛋白；⑤在PCR管中加入10μl的ElutionBuffer洗脱5min，将PCR管置于磁铁上孵育1min，取5μl上清液移至另一个PCR管中；⑥将装有5μl上清液的PCR管中加入5μl的CHCA饱和溶液，充分混匀，至样品颜色发灰，而没有明显的沉淀时，取2μl混合溶液，加样到Au/Steel芯片上，晾干后放入仪器读取；

(5)质谱分析：采用质谱仪读所述Au/Steel取芯片信息，设置激光强度为190，灵敏度为5；

(6)数据采集；

(7)数据分析；

(8)建立诊断模型：用BiomarkerPatternSoftware5.0.2采用决策树算法计算出多个变量变化对两样本的判别价值，确定最佳的诊断模型。

进一步的，所述步骤(1)样品收集方法为：肠癌组和正常对照组在取材前一天晚上临睡前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天晨起后漱口前采用非刺激性唾液采集方式空腹取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，收集到的唾液置于冰浴中的15ml唾液离心管内，4℃静置1h后，3000r/min、4℃离心10min，冰浴上分装在1ml的EP管中，每管200μl，于-80℃冰箱冷冻保存备用。

进一步的，所述步骤(2)纳米磁珠预处理方法为：①取WCX纳米磁珠50μl加入到200μl的PCR管中，置于磁铁上孵育1min，去除上清液；②再加入100μl的WashBuffer洗脱5min，在磁铁上孵育1min，去除上清液；再重复步骤②操作一次，这样洗脱更干净，质谱检测受到干扰的可能性会更少。

进一步的，所述步骤(6)数据采集方法为：用CiphergenProteinchipSoftware3.2.1软件采集数据，纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比，收集数据的质荷比范围为2000～25000m/z，信号收集位置40～60，平均每点收集20次，收集总点为100次，已知多肽标准芯片标准，激光离子流0.5。

进一步的，所述步骤(7)数据分析方法为：对位于2000～25000m/z峰值，用BiomarkerWizard软件过滤噪音；设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，以10％为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，采用t检验比较肠癌组和正常对照组唾液蛋白质质谱数据，找出肠癌组和正常对照组之间具有统计学意义的差异表达蛋白质峰。

进一步的，步骤(7)中，设置P＜0.05，并选取肠癌组和正常对照组比值比率＞3的差异蛋白，所述肠癌组和正常对照组之间具有统计学意义的差异表达蛋白质峰有37个，其中有30个差异蛋白质峰表达下调，7个差异蛋白质峰表达上调，所述37个差异表达蛋白质峰具体如下：

进一步的，步骤(6)所述荷质比范围为2000～15000m/z。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明将WCX与MALDI-TOF-MS技术相结合，进一步探索肠癌患者唾液差异表达蛋白，发现了312个肠癌差异蛋白质峰(P＜0.05)，两组比值大于3(肠癌/正常对照＞3，或者正常对照/肠癌＞3)，其中有37个差异蛋白质峰有统计学意义，其中有7个差异蛋白质峰肠癌表达上调，28个差异蛋白质峰肠癌表达下调，有35个差异蛋白质峰有显著差异(P＜0.01)。

2)本发明选取m/z为2501.26、4779.95、3140.39建立肠癌组与正常正常对照组的判别模型，该模型的灵敏度(88％)和特异度(98％)均高，采用十字交叉验证，灵敏度和特异度分别为85％、88％，可见该模型对肠癌的诊断具有一定的价值。

3)本发明的技术方案已显示出良好的应用前景，值得进一步深入研究并在临床推广转化。

当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例中肠癌与正常对照组MALDI质谱峰图(m/z＝2501)；

图2为本发明实施例中肠癌与正常对照组MALDI质谱峰图(m/z＝3140)；

图3为本发明实施例中肠癌与正常对照组MALDI质谱峰图(m/z＝4779)(局部放大图)；

图4为本发明实施例中2501.26、4779.95和3140.39三个差异峰组成的诊断模型；

图5为本发明实施例中建立的诊断模型十字交叉验证ROC曲线。

具体实施方式

以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例

1病例选择

1.1诊断标准

符合内科学对大肠癌的诊断标准。

1.2纳入标准

(1)符合诊断标准而且未经手术和放化疗；

(2)年龄在20-75岁之间；

(3)自愿且能够配合参加的受试对象。

以上3项必须全部符合才能纳入。

1.3排除标准

(1)不符合上述诊断标准者；

(2)年龄＜20或＞75岁者；

(3)患有口腔局部及唾液腺的炎症、消化道溃疡、肿瘤及先天性疾病；患有舍格伦综合征、囊性纤维病；患有其他系统严重并发疾病。

1.4质量控制

(1)采用统一诊断标准、统一调查表格、统一调查方法；

(2)调查者在调查时严格按照“标准化”执行，减少调查者偏倚，确保资料的一致性和真实性；

(3)电子胃镜及病理结果均由1月内三级甲等医院诊断。

2纳入病例基本资料

本研究共纳入2014年12月-2015年04月在湖南省肿瘤医院肠癌患者34例，直肠癌20例，直肠癌13例，结直肠癌1例，男22例、女13例；年龄26-74岁，中位年龄58岁；正常对照组45例，男28例、女17例；年龄23-72岁，中位年龄52岁，均来自于湖南中医药大学附属第一医院体检科健康自愿者。所有病例均按照纳入标准进行纳入。

3研究分组

34例肠癌患者为肠癌组，45例健康志愿者为正常对照组。

4实验方法

4.1主要仪器和试剂

蛋白指纹图谱(液体芯片)试剂盒(WCX磁珠、WashBuffer、ElutionBuffer、U9裂解液)及MALDI-TIF-MS(蛋白指纹图谱仪I型)，均为湖州赛尔迪生物医药科技有限公司产品，试剂盒批号为K20150501；dH₂O(HPLC级)、CHCA为Sigma公司产品。

4.2样品收集

按照本课题专用临床观察表进行临床观察记录。取材前一天晚上临睡前清水漱口三次(不再进任何食物和药物)，采用非刺激性唾液采集方式，第二天晨起后漱口前空腹取材。由经过培训的课题组专人取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，患者将已经过消毒的无菌小圆柱形棉花含入口中，口腔唾液积聚至一定量后，将该棉花吐入置于冰浴中的15ml唾液离心管内，4℃下静置1h后，3000r/min、4℃下离心10min，冰浴上分装在1ml的EP管中，每管200μl，于-80℃冰箱冷冻保存。实验时取出样本，冰上解冻，所有检测唾液样本均1次冻融。取5μl唾液加入10μl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μl的WashBuffer稀释(唾液最终上样量为2.5μl)。

4.3纳米磁珠预处理

①取WCX纳米磁珠50μl加入到200μl的PCR管，置于磁铁上孵育1min(注意避免由于孵育时间过长导致磁珠结块)，去除上清液；②再依次加入100μl的WashBuffer洗脱5min，在磁铁上孵育1min，去除上清液；再重复步骤②操作一次。

4.4唾液样品洗脱上样

①向每个装有纳米磁珠的PCR管中加入100μl处理好的唾液样品，混匀后，置于室温孵育30min，将PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；②每管加入100μl的WashBuffer洗脱5min，然后将PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；再重复步骤②操作一次。③在PCR管中加入10μl的ElutionBuffer洗脱5min(不能少于5min)，将PCR管置于磁铁上孵育1min，取5μl上清液移至另一个PCR管中；④装有5μl上清液的PCR管中加入5μl的CHCA(基质)饱和溶液，充分混匀(混合到样品颜色发灰，而没有明显的沉淀并及时上样)，取2μl混合溶液(1μl唾液样品+1μl基质)加样到Au/Steel芯片上，待干后放入仪器读取。

4.5芯片检测、数据采集和参数设置

采用蛋白指纹图谱仪I型(湖州赛尔迪生物医药科技有限公司)质谱仪读取芯片信息。设置激光强度为190，灵敏度为5，收集数据的质荷比(m/z)范围为2000～25000m/z，优化范围为2000～15000m/z，信号收集位置40～60，平均每点收集20次，收集总点为100次。已知多肽标准芯片标准(all-in-one)，激光离子流0.5。用CiphergenProteinchipSoftware3.2.1软件自动采集数据，纵坐标为峰强度(蛋白相对含量)，横坐标为蛋白质质荷比(m/z)。

4.6数据分析

对位于2000～25000m/z峰值，用BiomarkerWizard软件过滤噪音。设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，以10％为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，采用t检验比较2组唾液蛋白质质谱数据(由BiomarkerWizard软件完成)，找出2组之间具有统计学意义的差异表达蛋白质峰。用BiomarkerPatternSoftware5.0.2采用决策树算法计算出多个变量(m/z蛋白质质谱峰)变化对两样本的判别价值，确定最佳的筛选模型(即诊断模型)。

5结果

5.1数据分析及建立诊断模型

肠癌组、正常对照组两组共79份唾液标本，经过标准化后，在相对分子质量为2000～25000M/Z范围内共检测到312个蛋白质峰(P＜0.05)，选取其中两组比值大于3(肠癌/正常对照＞3，或者正常对照/肠癌＞3)的37个差异蛋白质峰(见表1)，28个差异蛋白质峰表达下调(典型下调对比图谱，如图1、图2)，其中有7个差异蛋白质峰表达上调(典型上调对比图谱，如图3)，有35个差异蛋白质峰有显著差异(P＜0.01)。

表1肠癌与正常对照组之间差异有统计学意义的蛋白质峰

图1-3为不同m/z的肠癌与正常对照组MALDI质谱峰图，图中纵坐标为峰强度(蛋白相对含量)，横坐标为蛋白质质荷比(m/z)。图1中m/z为2501的峰，上第1、2幅图为肠癌组，下第3、4幅图为正常对照组。与正常对照组相比，肠癌组表达下调。图2中m/z为3140的峰，上第1、2幅图为肠癌组，下第3、4幅图为正常对照组。与正常对照组相比，肠癌组表达下调。图3中m/z为4779的峰，上第1、2幅图为肠癌组，下第3、4幅图为正常对照组。与正常对照组相比，肠癌组表达上调。

用BiomarkerPatternSoftware5.0.2采用决策树算法计算出多个变量(m/z蛋白质质谱峰)变化对两样本的判别价值，确定最佳的筛选模型(图4)，最终选定m/z为2501.26、4779.95、3140.39建立大肠癌与正常对照组的判别模型，该模型的灵敏度和特异度分别为88％(30/34)和98％(44/45)(见表2)。

表2所建诊断模型对肠癌的诊断效率(临床回代检验结果)

如图4所示，当满足条件以下条件之一者：①2501.26m/z≤14.31且4779.95m/z＞8.82；②2501.26m/z≤14.31且4779.95m/z≤8.82、3140.39m/z≤3.09，提示为大肠癌标本；当满足条件以下条件之一者：①2501.26m/z＞14.31；②2501.26m/z≤14.31且4779.95m/z≤8.82、3140.39m/z＞3.09，提示为正常标本。M：质谱峰相对强度。

5.2诊断模型十字交叉验证

对所建立的大肠癌诊断模型采用十字交叉法进行验证，结果该模型的灵敏度和特异度分别85％(29/34)和88％(37/45)(见表3)。

表3所建诊断模型对肠癌的诊断效率(十字交叉验证结果)

图5为肠癌与正常对照组的鉴别诊断模型十字交叉验证的ROC曲线，其中横轴坐标为假阳性率(1-特异度)，纵坐标为真阳性率(灵敏度)。ROC曲线下面积越大，其诊断价值越高。图5中十字交叉验证的ROC曲线下面积为0.958，进一步的分析验证了所建立模型的诊断价值。

发明人从无创角度，采用唾液样本进行肠癌的诊断研究，拟取得肠癌早期、无创诊断新方法。本发明将WCX与MALDI-TOF-MS技术相结合，进一步探索肠癌患者唾液差异表达蛋白，发现了312个肠癌差异蛋白质峰(P＜0.05)，两组比值大于3(肠癌/正常对照＞3，或者正常对照/肠癌＞3)，有37个差异蛋白质峰，其中有7个差异蛋白质峰肠癌表达上调，28个差异蛋白质峰肠癌表达下调，有35个差异蛋白质峰有显著差异(P＜0.01)。选取m/z为2501.26、4779.95、3140.39建立肠癌组与正常对照组的判别模型，该模型的灵敏度(88％)和特异度(98％)均高，采用十字交叉验证，灵敏度和特异度分别为85％、88％，可见，该模型对肠癌的诊断具有一定的价值。该研究已显示出良好的应用前景，值得进一步深入研究并在临床推广转化。

如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。

上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品收集；

(2)纳米磁珠预处理；

(3)样品预处理：取出冷冻保存的唾液样品，冰上解冻，所有唾液样品均1次冻融，取5μl所述唾液样品加入10μl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μl的WashBuffer稀释；

(4)唾液样品洗脱上样：③向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入100μl预处理后的所述唾液样品，混匀，置于室温孵育30min，将所述PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；④每管加入100μl的WashBuffer洗脱5min，然后将所述PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；再重复步骤④操作一次；⑤在所述PCR管中加入10μl的ElutionBuffer洗脱5min，将所述PCR管置于磁铁上孵育1min，取5μl上清液移至另一个PCR管中；⑥将装有5μl上清液的PCR管中加入5μl的CHCA饱和溶液，充分混匀，至样品颜色发灰，而没有明显的沉淀时，取2μl混合溶液，加样到Au/Steel芯片上，晾干后放入仪器读取；

(5)质谱分析：采用质谱仪读取所述Au/Steel芯片信息，设置激光强度为190，灵敏度为5；

(6)数据采集；

(7)数据分析；

2.如权利要求1所述的大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，所述步骤(1)样品收集方法为：肠癌组和正常对照组在取材前一天晚上临睡前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天晨起后漱口前采用非刺激性唾液采集方式空腹取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，收集到的唾液置于冰浴中的15ml唾液离心管内，4℃静置1h后，3000r/min、4℃离心10min，冰浴上分装在1ml的EP管中，每管200μl，于-80℃冰箱冷冻保存备用。

3.如权利要求2所述的大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，所述步骤(2)纳米磁珠预处理方法为：①取WCX纳米磁珠50μl加入到200μl的PCR管中，置于磁铁上孵育1min，去除上清液；②再加入100μl的WashBuffer洗脱5min，在磁铁上孵育1min，去除上清液；再重复步骤②操作一次。

4.如权利要求3所述的大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，所述步骤(6)数据采集方法为：用CiphergenProteinchipSoftware3.2.1软件采集数据，纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比，收集数据的质荷比范围为2000～25000m/z，信号收集位置40～60，平均每点收集20次，收集总点为100次，已知多肽标准芯片标准，激光离子流0.5。

5.如权利要求4所述的大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，所述步骤(7)数据分析方法为：对位于2000～25000m/z峰值，用BiomarkerWizard软件过滤噪音；设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，以10％为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，采用t检验比较所述肠癌组和所述正常对照组唾液蛋白质质谱数据，找出所述肠癌组和所述正常对照组之间具有统计学意义的差异表达蛋白质峰。

6.如权利要求5所述的大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，步骤(7)中，设置P＜0.05，并选取所述肠癌组和所述正常对照组比值比率＞3的差异蛋白，所述肠癌组和所述正常对照组之间具有统计学意义的差异表达蛋白质峰有37个，其中有30个差异蛋白质峰表达下调，7个差异蛋白质峰表达上调，所述37个差异表达蛋白质峰具体如下：

7.如权利要求6所述的大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，步骤(6)所述荷质比范围为2000～15000m/z。