CN105624199A - 一种根霉菌胞内生理活性诱导物质的萃取方法及应用 - Google Patents
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Abstract
一种根霉菌胞内生理活性诱导物质的萃取方法及应用，包括菌体的培养、菌体的冲洗、菌体的纯化、菌体的破壁及生理活性诱导物质的萃取、纯化、冷冻喷雾干燥等，并应用于人体及动物产乳、肉、蛋的效益提升；菌体的培养，是将根霉菌培养于改良式液体的培养基中，置放于30℃恒温箱内回转振荡培养5日后，取菌液涂抹在一改良式固体培养基中，静置于30℃恒温箱中，再培养5日后，刮取白色菌落，并置入无菌磷酸缓冲溶液中，成悬浮液。本发明可诱导促进人及动物内分泌腺分泌多量内分泌素的生理活性诱导物质，以促使儿童的成长及成人的健康幸福及取代目前使用添加瘦肉精或合成贺尔蒙来增加乳、肉、蛋产量危害人类健康的新产品，以造福人类。
Description
技术领域
本发明是于一种根霉菌(RhizopusSPP)胞内生理活性诱导物质(Bio-activeInducematter：BAIM)的萃取方法及应用，其是将根霉菌(RhizopusSPP)培养于改良式液体(SabouraudDextroseAgar)的培养基中，置放于30℃恒温箱内回转振荡培养5日后，取0.2ml菌液涂抹在一改良式固体(SabouraudDextroseAgar)培养基中，静置于30℃恒温箱中培养5日，在未出现黑色菌落前刮取白色菌落，并置放于无菌磷酸缓冲溶液(PhosphateBufferSolution：PBS)10ml中，即成悬浮液后再进行根霉菌胞内萃取。其萃取是以根霉菌悬浮液10000xg转数进行离心分离10分钟(4℃)后再取其菌体沉淀物，再加入无菌磷酸缓冲溶液10ml再成悬浮液，再进行离心分离连续重复三次后，再将完成冲洗的菌体沉淀物以重量1∶9(菌体沉淀物：PBS缓冲溶液)比例再成悬浮，连续进行三次冷冻(-80℃)及解冻(37℃水浴)的处理程序，再以超音波细胞击碎器进行破壁(在水浴下每间隔5分钟破壁一次，连续进行五次)。后再将破壁完成的悬浮菌液再以10000xg转数的离心分离10分钟(4℃以下)后，取其上清液以0.45μm滤膜过滤，其最后滤液即含有根霉菌体胞内生理活性诱导物质(BAIM)，经喷雾干燥即得本发明产品：BAIM(生理活性诱导分泌物质)。
背景技术
孩童的成长、发育及女性的不育、月事的不调、男性的秃发、不举等异常现象及经济动物的产肉、产蛋、产乳及繁殖效率的良否等均受制于脑下垂体前叶(Anteriorpituitaryparsdistalis)所支配于周边腺体分泌特定激素(Hormones)的功能所致。而此特定的激素包括：生长激素(FSH)、黄体生成素(LH)及泌乳素(LactationH)三者，而脑下垂体控制周边腺体分泌特定激素的功用，则受制于下视丘(Hypothalamus)分泌特定激素所致。而下视丘分泌特定激素，可藉由生理活性物质(Bio-avtiveInducematter)来诱导刺激而得。
1970年(44年前)日本牛越郁夫取得「应用于动物的生理活性物质」发明专利(昭45-12754号：间脑是を经由レて下垂体を刺激する物质多量含有する物质の制造法)，其生理活性物质取得制程是以Rhizopus属(RhizopusSPP.)菌体培养及发酵产物的取得是采液态发酵低温干燥的制程，其培养过程繁杂，含不纯物高达8％，且浓缩干燥产品吸湿性强，保存不易，致效果不稳定。
2014年中国台湾发明证号：1434932号(根霉菌RhizopusSPP及其培养方法与应用)，其制程中培养菌体流程虽已简化且仅简易加工后，用于生医资材，因成本昂贵效果不彰未见推广，显见其制程技术犹有瑕疵、未臻完善。
中国台湾发明专利公开号TW201343172A：是应用少孢根霉菌(RhizopusOligosporus)的发酵产物，以作为生产降血压活性成分的用途医药组合物及其食品添加物，其是以牛乳的培养基得到一发酵产物，其含有血管收缩素转化酶抑制剂(抑制ACE活性功能)，作为降血压剂，以牛乳作为培养基的营养源，其发酵产物的成分目前被公认其成分最为不稳定，虽有小白鼠动物试验，但其临床试验未经确定。且目前治疗高血压的化学合成药剂因专利期已过，致成本非常便宜，且经无数临床试验效果确定。
今地球人口已逾七十亿，且日益严重地球的暖化现象，气候激变，不是大涝即大旱，导致人类的粮食日渐匮乏，尤其是对健康关系颇大的动物性蛋白质(乳、肉及蛋)的需求更为迫切，经济动物的生产因饲养方式、营养及饲养的气候影响导致内分泌激素(Hormones)的分泌异常，而造成产肉、产蛋、产乳等产量的低下及繁殖上的障碍，致如何解决孩童的成长及成人贺尔蒙的失调及提升乳、肉及蛋的生产为目前重要研究探讨课题。
今发明人经多年来的深入探讨及研究，终于研发一种制程严谨、质量稳定及效果佳，可诱导促进人及动物内分泌腺分泌多量内分泌素(如生长激素(GH)及激性腺素如：FSH、LH&LactationH等)的生理活性诱导物质(Bio-activeInducematter)简称BAIM，以促使人类的健康幸福及取代目前使用添加瘦肉精或合成贺尔蒙来增加乳、肉、蛋产量危害人类健康的替代方案以造福人类。
发明内容
本发明所要解决的主要技术问题在于，克服现有技术存在的上述缺陷，而提供一种根霉菌胞内生理活性诱导物质的萃取方法及应用，供诱导促进人及动物体内分泌腺分泌多量内分泌素，如生长激素(GH)及激性腺素(FSH，LH&LactationH等)的生理活性诱导物质(BAIM)以促进人类的健康及取代目前使用添加瘦肉精或合成荷尔蒙来增加乳、肉、蛋产量危害人类健康的替代方案，并造福人群。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种根霉菌胞内生理活性诱导物质的萃取方法及应用，包括：
根霉菌的培养。
马铃薯萃取液及培养基制备。
马铃薯萃取液制备。
将马铃薯以自来水洗净及削皮后，将每粒马铃薯粗切成8块，再以蒸馏水与马铃薯重量混合(2∶1)。放入蒸煮锅中100℃加热60分钟，使其总重量剩为2公斤。
经不锈钢细网目过滤及取滤液，将滤液经6，000xg离心分离15分钟，取其上清液。
前述步骤上清液经0.45μm过滤膜过滤，其滤液分装置放于-20℃冰柜保存备用。
改良式固体SabouraudDextroseAgar培养基配制：
50g/LDextrose、15g/LPeptone、15g/LBactoagar、10％马铃薯萃取液、10g/Lyeastextractpower及2％脱脂奶粉等充份搅拌混合。
经高压蒸汽灭菌釜灭菌121℃、15磅压力、15分钟。
液化培养基在50℃水浴后分装于90X15mm培养皿中使其固化。
改良式液体SabouraudDextroseAgar培养基配制：
50g/LDextrose、15g/LPeptone、10％马铃薯萃取液、10g/Lyeastextractpower及2％脱脂奶粉等充份搅拌混合。
经高压蒸汽灭菌釜灭菌121℃、15磅压力、15分钟。
液化培养基灭菌完成后放置于4℃冷藏保存。
培养技术。
将根霉菌培养于改良式液体SabouraudDextroseAgar培养基中，放置在恒温箱30℃回转式振荡培养5日。
取0.2mL菌液涂抹在一改良式固体SabouraudDextroseAgar培养基中，静置在30℃恒温箱培养5日。
未出现黑色菌落前，刮取白色菌落并放置于无菌磷酸缓冲溶液中(phosphatebuffersolution，PBS)，每5个培养皿刮下菌落于50mLPBS缓冲溶液中再悬浮。
根霉菌菌体胞内生理活性诱导物质萃取技术。
将根霉菌悬浮液以10,000xg转数离心机离心10分钟(4℃下)，取其菌体沉淀物，再取悬浮菌体沉淀物进行离心，连续进行重复三次。
将完成冲洗的菌体沉淀物以重量1∶9(菌体沉淀物：PBS缓冲溶液)比例再悬浮，连续进行三次冷冻(-80℃)及解冻(37℃水浴)的处理程序。
以超音波细胞击碎器进行破壁，在冰浴下每5分钟间隔一次，连续破壁五次(肉眼上观察不到菌体颗粒团块的均匀悬浮液)。
将破壁完成的悬浮菌液再以10，000xg转数的离心机进行离心10分钟(4℃下)，取其上清液。
将上清液经0.45μm过滤膜过滤，取其滤液即为根霉菌菌体胞内生理活性诱导物质萃取物。
浓缩喷雾干燥。
上述萃取液经喷雾干燥，即得本发明产品(BAIM)粉末体。
本发明的有益效果是，供诱导促进人及动物体内分泌腺分泌多量内分泌素，如生长激素(GH)及激性腺素(FSH，LH&LactationH等)的生理活性诱导物质(BAIM)以促进人类的健康及取代目前使用添加瘦肉精或合成荷尔蒙来增加乳、肉、蛋产量危害人类健康的替代方案，并造福人群。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为本发明的根霉菌萃取生理活性诱导物质(BAIM)的制造流程图。
图2为本发明的较佳实施生产及应用示意图。
图3为生理活性诱导物质(BAIM)的作用机转。
图中标号说明：
1培养基制备
2接种根霉菌(RhizopusSPP)于培养基中培养
3取出白色菌落，置入PBS缓冲液中而呈悬浮液
4萃取菌体进行破壁将胞内多醣体的酵素及BAIM等释出
5纯化生理活性诱导物质(BAIM)
6萃取物经喷雾干燥而得BAIM粉末体
7应用于人体或动物促进内分泌腺分泌
具体实施方式
请参阅图1、图2所示，为本发明的根霉菌萃取生理活性诱导物质(BAIM)的制造流程图及较佳实施生产及应用示意图，本发明的一种根霉菌(RhizopusSPP)培养及萃取胞内生理活性诱导物质(Bio-activeInducematter：BAIM)的制程改良制作流程，如图1所示，其依序为培养基制备1、接种根霉菌(RhizopusSPP)于培养基中培养2、取出白色菌落，置入PBS缓冲液中而呈悬浮液3、萃取菌体进行破壁将胞内多醣体的酵素及BAIM等释出4、纯化生理活性诱导物质(BAIM)5、萃取物经喷雾干燥而得BAIM粉末体6、应用于人体或动物促进内分泌腺分泌7，其主要是以：
根霉菌的培养。
马铃薯萃取液及培养基制备。
马铃薯萃取液制备。
将马铃薯以自来水洗净及削皮后，将每粒马铃薯粗切成8块，再以蒸馏水与马铃薯重量混合(2∶1)。放入蒸煮锅中100℃加热60分钟，使其总重量剩为2公斤。
经不锈钢细网目过滤及取滤液，将滤液经6，000xg离心15分钟，取其上清液。
前述步骤上清液经0.45μm过滤膜过滤，其滤液分装保存于-20℃冰柜保存备用。
改良式固体SabouraudDextroseAgar培养基配制：
50g/LDextrose、15g/LPeptone、15g/LBactoagar、10％马铃薯萃取液、10g/Lyeastextractpower及2％脱脂奶粉等充份搅拌混合。
经高压蒸汽灭菌釜灭菌121℃、15磅压力、15分钟。
液化培养基在50℃水浴后分装于90X15mm培养皿中使其固化。
改良式液体SabouraudDextroseAgar培养基配制：
50g/LDextrose、15g/LPeptone、10％马铃薯萃取液、10g/Lyeastextractpower及2％脱脂奶粉等充份搅拌混合。
经高压蒸汽灭菌釜灭菌121℃、15磅压力、15分钟。
液化培养基灭菌完成后放置于4℃冷藏保存。
培养技术。
将根霉菌培养于改良式液体SabouraudDextroseAgar培养基中，放置在恒温箱30℃回转式振荡培养5日。
取0.2mL菌液涂抹在一改良式固体SabouraudDextroseAgar培养基中，静置在30℃恒温箱培养5日。
未出现黑色菌落前，刮取白色菌落并放置于无菌磷酸缓冲溶液中(phosphatebuffersolution：PBS)，每5个培养皿刮下菌落于50mLPBS缓冲溶液中再悬浮。
根霉菌菌体胞内生理活性诱导物质萃取(请配合参阅图2所示)。
将根霉菌悬浮液以10,000xg转数离心机离心10分钟(4℃下)，取其菌体沉淀物，再加缓冲液(PBS)成悬浮菌体沉淀物进行离心，连续重复进行三次。
将完成冲洗的菌体沉淀物以重量1∶9(菌体沉淀物：PBS缓冲溶液)比例再悬浮，连续进行三次冷冻(-80℃)及解冻(37℃水浴)的处理程序。
以超音波细胞击碎器进行破壁，在冰浴下每5分钟间隔破壁一次，连续破壁五次。
将破壁完成的悬浮菌液再以10,000xg转数的离心机进行离心10分钟(4℃下)，取其上清液。
将上清液经0.45μm过滤膜过滤，取其滤液即为根霉菌菌体胞内生理活性诱导物质萃取物。
喷雾干燥。
上述萃取液经冷冻喷雾干燥，即得本发明产品(BAIM)粉末体。
本发明(BAIM)的成份分析(请参阅表一、表二、表三)，至于，生理活性诱导物质(BAIM)的作用机转，请参阅图3所示。
试验成绩
(一)对实验动物的生殖效益评估：
以30日龄的小白鼠30只(每组10只)探讨其生理活性诱导物质(BAIM)诱导分泌雄性激素的效能。
(二)本发明(BAIM)对儿童成长的效益评估
儿童成长试验各组体重增重成绩(增加4.1％)
| 组别/体重(kg) | 对照组 | 试验组 |
| 试验前平均体重 | 26.0 | 25.9 |
| 一个月平均体重 | 26.1 | 26.1 |
| 二个月平均体重 | 26.3 | 26.3 |
| 三个月平均体重 | 26.4 | 26.6 |
| 四个月平均体重 | 26.6 | 26.8 |
| 五个月平均体重 | 26.7 | 27.2 |
| 六个月平均体重 | 26.9 | 27.7 |
| 平均增重 | 27.0 | 28.1 |
| 指数％ | 100 | 104.1 |
| 增重％ | 4.1％ |
注：(1)试验学童20名，每组10名(10-12岁学龄儿童)。
(2)试验期间六个月。
(3)每个月测体重一次。
(三)本发明(BAIM)对男性性功能的效益评估
对男性勃起功用效益为2.36倍
注：(1)本试验自9月15日起四周于10月12日止。
(2)每试验组15人(45-54岁，55-64岁及65岁以上三级各五人)。
(3)反应者人数以0-5表示的。
(四)本发明(BAIM)对经济动物生产的效益评估
1.对母猪泌乳及繁殖性能试验
(1)试验方法
A.取二品种(Y♂×L♀)杂交一代母猪20头(平均3.5胎次)，逢机区分为二组，每组10头，每头一栏。
B.各组喂予基础饲料外，另添加市贩产品及本发明产品各0.05％。
C.试验期间：共十个月
(2)试验结果
A.哺育仔猪成绩
哺育仔猪成绩比较
B.母猪繁殖成绩
母猪离乳至再发情与发情至配种间距成绩比较
2.对乳牛泌乳及乳房炎发生率的试验
(1)试验方法
A.选取分娩后100日以内，且试验前一星期平均泌乳量20公斤左右的荷兰母牛40头，依乳量、产次、产期，逢机分配至二个处理组，每组5头，每头一栏(试验单位)，试验前七天为适应期，牛只舍饲于个别夹栏，试验饲粮采任饲，饮水以水槽充分供应，每日榨乳二次(05：30及17：30)并记录乳量，每月固定采生乳样品一次，早晚各取乳样品125ml。
B.试验期间除给予完全混合日粮外，每组饲予市贩产品与本发明产品纯末为每头每日100公克(g)。
C.试验期间分二季，每季试验四个月，夏季为6月1日至9月30日，冬季为10月31日至2月28日。
(2)试验结果
A.泌乳成绩及乳成份
泌乳成绩比较(100g/头/日)
乳成份比较(100g/头/日)
(B)体细胞数含量
体细胞数含量的比较(103/m1)(100g/头/日)
(C)乳房炎发生率
乳房炎发生率比较(％)(100g/头/日)
本发明使用萃取菌体进行破壁制程，将胞内多醣体酵素及生理活性诱导分泌物质(BAIM`)完全释出，并以冷冻喷雾干燥方式，生产纯粉末成品，已具进步性及与产业上的利用性，且由其试验成绩得知可提升经济动物(牛、猪、鸡)的产卵应用及产乳的生产效率，且本发明的相关文献尚未曾公开发表，复具有新颖性，均已符合发明专利诸要件的规定，爰依法提出发明专利申请，恳请惠予审查并早日赐准专利，实感德便。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
综上所述，本发明在结构设计、使用实用性及成本效益上，完全符合产业发展所需，且所揭示的结构亦是具有前所未有的创新构造，具有新颖性、创造性、实用性，符合有关发明专利要件的规定，故依法提起申请。
BAIM特殊成份分析表(一)
表一
BAIM胺基酸组成分析表(二)
单位(mg/100g)
表二
BAIM脂肪酸组成分析表(三)
单位(g/100g)
低于方法侦测极限的测定值以「未检出」表示，并于备注栏注明其方法侦测极限(MDL)
表三
Claims (6)
1.一种根霉菌胞内生理活性诱导物质的萃取方法及应用，其特征在于：包括菌体的培养、菌体的冲洗、菌体的纯化、菌体的破壁及生理活性诱导物质的萃取、纯化、冷冻喷雾干燥等，并应用于人体及动物产乳、肉、蛋的效益提升。
2.根据权利要求1所述的一种根霉菌胞内生理活性诱导物质的萃取方法及应用，其特征在于，所述菌体的培养，是将根霉菌培养于改良式液体的培养基中，置放于30℃恒温箱内回转振荡培养5日后，取菌液涂抹在一改良式固体培养基中，静置于30℃恒温箱中，再培养5日后，刮取白色菌落，并置入无菌磷酸缓冲溶液中，成悬浮液。
3.根据权利要求1所述的一种根霉菌胞内生理活性诱导物质的萃取方法及应用，其特征在于，所述菌体胞内生理活性诱导物质的萃取是将根霉菌悬浮液10000xg转数离心机进行4℃以下的离心10分钟，后再取其菌体沉淀物，再连续进行离心分离重复三次后，再将完成冲洗的菌体沉淀物以重量1∶9(菌体沉淀物：PBS缓冲溶液)比例再成悬浮，连续进行三次冷冻(-80℃)及解冻(37℃水浴)的处理。
4.根据权利要求1所述的一种根霉菌胞内生理活性诱导物质的萃取方法及应用，其特征在于，所述萃取的菌体以超音波细胞击碎器进行破壁是在水浴下每5分钟间隔进行破壁一次，连续进行五次。
5.根据权利要求1所述的一种根霉菌胞内生理活性诱导物质的萃取方法及应用，其特征在于，所述菌体破壁后，将上清液经0.45μm滤膜过滤，其滤液即为生理活性诱导物质萃取纯化物，经冷冻喷雾干燥即得生理活性诱导物质的纯粉末体。
6.根据权利要求1所述的一种根霉菌胞内生理活性诱导物质的萃取方法及应用，其特征在于，可应用于促使儿童的成长，成人性激素分泌的调理及应用于提升经济动物的产卵、产肉与产蛋的效率。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160601 |