CN105624156B - 含有反向sineb2重复序列的人工非编码rna及其在增强靶蛋白翻译中的用途 - Google Patents
含有反向sineb2重复序列的人工非编码rna及其在增强靶蛋白翻译中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及含有反向SINEB2重复序列的人工非编码RNA及其在增强靶蛋白翻译中的用途。具体地，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子为：(1)由以下元件构成的RNA分子：与目的mRNA互补的配对区，倒置的SINEB2序列，任选的poly(A)信号区，以及任选的调控元件；或者(2)能够转录该RNA分子的DNA分子。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及含有反向SINEB2重复序列的人工非编码RNA及其在增强靶蛋白翻译中的用途。
背景技术
非编码的RNA转录本广泛存在于细胞里，但是大多数的功能却不得而知。有些被发现在转录水平调节基因表达。2012年Carrieri等(Carrieri et al.,Long non-codingantisense RNA controls Uchl1 translation through an embedded SINEB2repeat；Nature.2012；491(7424):454-7)报道了一类具有新功能的长链非编码RNA(lncRNA)，它通过一段重叠反义序列靶向mRNA(信使RNA)5’端，从而在转录后水平上提高相应蛋白UCHL1的翻译，原因可能是这种lncRNA能与mRNA互补配对并且促进核糖体招募。这个发现拓展了我们在非编码RNA对蛋白表达调节方面的认识。这个研究小组通过生物信息学方法在鼠的基因组里发现了10,000多条带有SINEB2区域的lncRNAs，其中1条通过与mRNA的反义互补配对在不增加mRNA水平的前提下促进了mRNA的翻译水平。相似功能的反义-正义RNA配对在水稻里也有发现，但是这些反义RNA里促进翻译的功能性序列还不清楚。
有人提出这种反义的非编码RNA可以针对所选择的mRNA进行工程化设计，用来提高目的mRNA的翻译量。Carrieri(Carrieri et al.,Long non-coding antisense RNAcontrols Uchl1 translation through an embedded SINEB2 repeat；Nature.2012；491(7424):454-7)等人报道的原型uchl1非编码RNA包含两个必要部分，一个是mRNA的5’配对区，一个是反向的SINEB2元件。配对区长为72个核苷酸，与其对应的mRNA序列在翻译起始密码子AUG附近完全互补配对，而且感应的反义RNA转录本头对头的配对明显提高了招募核糖体的效率，促进了翻译。反向的SINEB2元件在翻译促进中是必需的，但是其机制还没有被阐明。
各种天然的反义RNA被发现在不同水平上调节相应基因的表达，比如在转录水平，在mRNA的稳定性上，在mRNA的翻译水平。但是除了microRNA和siRNA，还没有其它的基于RNA的机制广泛用作基因表达调节的工具。在此研究里，我们旨在证明一段具有反义序列和反向的SINEB2元件的人工RNA能够广泛地被用作促进哺乳动物蛋白翻译的分子工具，我们称之为RNAe(即RNA enhancement)。此研究在RNAe的普遍性和优化上做了很多努力，目的在于在不同条件下达到更好效果。
发明内容
本发明一方面提供了一种核酸分子，该核酸分子为：(1)由以下元件构成的RNA分子：与目的mRNA互补的配对区，倒置的SINEB2序列，任选的poly(A)信号区，以及任选的调控元件；或者(2)能够转录该RNA分子的DNA分子。
在一个实施方案中，所述RNA分子由以下元件构成：与目的mRNA互补的配对区，倒置的SINEB2序列，以及poly(A)信号区。
在另一个实施方案中，所述RNA分子由以下元件构成：与目的mRNA互补的配对区，以及倒置的SINEB2序列。
在一些实施方案中，所述配对区的总长度不超过600nt。具体地，所述配对区可以与目的mRNA的-100nt到+Xnt的区域配对，其中X为正整数，例如1,5,10,20,30,50,100,200,300,400等。
具体地，所述调控元件可以为ALU等，例如文献Carrieri et al.,Long non-coding antisense RNA controls Uchl1 translation through an embeddedSINEB2repeat；Nature.2012；491(7424):454-7中所提到的ALU序列。
本发明一方面提供了一种促进目的蛋白表达的方法，包括：将针对所述目的蛋白的本发明所提供的核酸分子转染至表达所述目的蛋白的细胞中。
所述目的蛋白可以为分泌型蛋白或抗体，或者内源蛋白。所述细胞可以为人源细胞系、中国仓鼠细胞系或大鼠源细胞系。
所述核酸分子可以以质粒、慢病毒载体或体外RNA转录本形式存在。
优选地，所述目的蛋白基因与所述RNA分子可以位于同一表达载体上。
在本发明的优选实施方案中，所述目的蛋白选自一组具有相同5’端的多个蛋白。
本发明另一方面提供了一种表达载体，包括：载体骨架，固定标签及固定标签之后的多克隆位点序列，与所述固定标签及所述载体骨架上的固定5‘非翻译区配对的本发明的核酸分子。
具体地，所述固定标签可以选自由HA、EGFP、His、Myc和Flag标签构成的组。
本发明另一方面提供了一种高通量基因筛选的方法，其特征在于：将针对所述基因的本发明提供的核酸分子转染至表达所述基因的细胞中，并依据所述基因的影响进行筛选。
具体地，所述基因的影响可以为对细胞增殖的影响，并使用所述细胞增殖速率作为筛选条件。所述细胞可以为HeLa或HEK293T细胞。具体地，所述基因可以为抑制细胞增殖的基因，例如gsk3β、p21、e2f1、bid、c-myb、bax、c-myc或p53。
附图说明
图1显示了AT-RNAe的加尾示意图及确认其加尾模式。(A)RNAe序列加尾区域示意图(B)RNAe加尾倾向的测量(使用qRT-PCR测量)，证明RNAe倾向于进行短的加尾方式(即生成AT-RNAe而非FL-RNAe)(C)RNAe存在可变加尾验证(使用3‘RACE测量)，胶图上可以看出RNAe存在两条明确条带，证明有两种加尾模式。(D)AT-RNAe对EGFP的影响，其中测量了EGFP荧光强度(使用流式细胞术测量)及EGFP的mRNA表达量(使用qRT-PCR测量)，证明AT-RNAe在不影响mRNA表达量的情况下促进EGFP蛋白的表达。
图2显示了通过截短筛选出了RNAe发挥功能的必要条件。(A)RNAe不同截短示意图，最下行为minRNAe的示意图。(B)RNAe截断对其功能的影响(使用流式细胞术测量)，不同截短的RNAe包括minRNAe都能显著促进EGFP荧光蛋白的表达。
图3显示了RNAe与目的mRNA不同的配对长度对其促进效率的影响。(A)与目的mRNA在5‘翻译区与5’非翻译区位置配对的缺失对RNAe功能的影响(使用流式细胞术测量)，证明5‘翻译区截除后RNAe几乎无效果，5‘非翻译区截除后RNAe还具有一定的效果。(B)延长RNAe与目的mRNA配对长度对RNAe功能的影响(使用流式细胞术测量)，证明RNAe总长度大于等于600nt时几乎无效果。(C)几种针对HIV单克隆抗体10E8不同长度配对区的AT-RNAe与minRNAe对促进抗体表达功能的影响(使用ELISA测量)，证明了不同配对长度的RNAe都可以起到促进抗体蛋白表达的作用，且不同长度与不同种类的RNAe之间促进效果不完全一致。
图4显示了RNAe促进作用的专一性：(A)pAT-RNAe-egfpc1对细胞内蛋白表达的影响(使用质谱测量)。(B)pminRNAe-egfpc1对细胞内蛋白表达的影响(使用质谱测量)。二者均显示红色三角代表的显著差异蛋白几乎不存在，证明RNAe的专一性十分高。
图5显示了不同细胞系中pRNAe-egfpc1对pEGFP-C1荧光表达促进作用(使用流式细胞术测量)，证明RNAe在人源(HEK293T，HEK293A，HeLa)细胞及中国仓鼠源(CHO-K1)细胞中均能发挥功能。
图6显示了RNAe对内源蛋白SOX9蛋白的促进作用。(A)RNAe-sox9作用下SOX9蛋白的表达促进(使用Western Blot测量)，证明SOX9蛋白在RNAe的作用下表达提升(B)SOX9蛋白过表达对软骨外基质的影响(使用阿利新蓝染色测量)，证明RNAe过表达的SOX9蛋白与SOX9基因直接过表达后都可以同样促进软骨细胞外基质的分泌。
图7显示了AT-RNAe与minRNAe对分泌性荧光素酶的促进作用(使用LuciferaseAssay测量)，证明两种RNAe都可以促进该分泌性蛋白的表达。
图8显示了AT-RNAe与minRNAe通过不同形式转入细胞都可以起到促进作用。(A)两种RNAe通过慢病毒稳定转染细胞后对荧光的促进作用(使用流式细胞术测量)，证明RNAe可以通过慢病毒的形式发挥功能。(B)体外转录的形式对RNAe功能的影响(使用CCK8 assay测量)，证明体外转录与质粒表达的RNAe都具有功能。(C)有无5’帽结构的体外转录的形式对RNAe功能的影响(使用CCK8 assay测量)，证明经由体外转录的无论是否具有5’帽结构的RNAe都具有功能。
图9显示了RNAe对增殖相关基因的筛选。(A)HEK293T细胞中的基因筛选(使用CCK8assay测量)，(B)HEK293T细胞饥饿条件下的基因筛选(使用CCK8 assay测量)(C)Hela细胞中的基因筛选(使用CCK8 assay测量)，(D)Hela细胞饥饿条件下的基因筛选(使用CCK8assay测量)。该图证明RNAe可以应用于大范围基因的功能筛选中。
图10显示了RNAe与RNAi方法的比较。(A)RNAe与RNAi在促进增殖基因筛选上的比较(使用CCK8 assay测量)，证明在选用的促进增殖相关基因的筛选上两种方法都有效。(B)RNAe与RNAi在抑制增殖基因筛选上的比较(使用CCK8assay测量).证明在选用的抑制增殖相关基因的筛选上，RNAe方法相比RNAi更有效。
图11显示了同种RNAe可以针对5’非翻译区后40nt与翻译区前32nt相同的蛋白同样起促进功能。(A)RNAe对EGFP-BBCK和EGFP-βB2-crystallin蛋白的促进作用(使用流式细胞术测量)。(B)RNAe对EGFP-BBCK蛋白的促进作用(使用Western Blot测量)。(C)RNAe对EGFP-βB2-crystallin蛋白的促进作用(使用Western Blot测量)，都证明一种RNAe可以对该两种不同蛋白起促进功能。
图12显示了pRNAe-Plus载体的构建。(A)pRNAe-Plus载体示意图，(B)pRNAe-Plus-EGFP质粒的验证(使用流式细胞术测量)，证明pRNAe-Plus-EGFP可以促进EGFP表达。(C)pRNAe-Plus-HA-EGFP质粒的验证(使用流式细胞术测量)，证明pRNAe-Plus-HA-EGFP可以促进HA-EGFP表达。。
具体实施方式
本文中所用的术语“SINEB2”是指本领域已知的SINEB2家族成员。本发明一种优选的“SINEB2序列”是文献Carrieri et al.,Long non-coding antisense RNA controlsUchl1translation through an embedded SINEB2repeat；Nature.2012；491(7424):454-7中所提到的SINEB2序列。
本文中所用的术语“RNAe”是RNA enhancement的简称，一方面指基于与目的mRNA互补的配对区和倒置的SINEB2家族序列的长非编码RNA在翻译前水平促进蛋白表达的技术或方法，另一方面，也指代该条具有翻译前促进功能的非编码RNA分子或表达该RNA分子的DNA分子。
本文中所用的术语“poly(A)信号区”指mRNA 3’端上控制多聚腺苷酸poly(A)加尾的RNA序列或表达该段序列的DNA序列。
本文中所用的术语“ALU”是指本领域已知的ALU家族成员。本发明一种优选的“ALU”是文献Carrieri et al.,Long non-coding antisense RNA controlsUchl1translation through an embedded SINEB2 repeat；Nature.2012；491(7424):454-7中所提到的ALU序列。
本文中所用的术语“外源基因”指生物体内或细胞中原来没有的外来基因，可以通过基因操作获得。
本文中所用的术语“蛋白标签”指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。
本文中所用的术语“慢病毒载体”以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的外源基因转入载体。
本文所用的术语“任选”(optional)表示“可有可无”、“非必需”的含义。例如，“任选的poly(A)信号区”是指可以含有该poly(A)信号区，也可以不含有该poly(A)信号区，这可以由本领域技术人员根据情况进行选择。
本文所用的术语“调控元件”是指分子生物学领域常用的调控元件，例如启动子、增强子、信号肽等。
实施例1 内源天然RNAe的转录具有可变的加尾方式，并以此构建人工AT-RNAe
主要的实验技术如下：
(1)细胞转染：将生长汇合的HEK293T细胞用0.05％胰酶-EDTA(Gibco，USA)消化后，接种在含有10％胎牛血清(FBS，Gibco，USA)，100units/mL penicillin青霉素(Biodee,China)，0.1mg/mL链霉素(Biodee,China)的DMEM培养液(Gibco，USA)的12孔的细胞培养板中，37℃，5％CO2条件下培养至汇合达70％～90％后，使用LipofectamineTM3000试剂(Invitrogen公司，USA)，按每孔0.3μg表达目的蛋白的质粒(如在图1D中所用的pEGFP-C1)，每孔1.2μg含相应RNAe的质粒的量，将质粒转染入细胞，培养48h后进行检测。
(2)qRT-PCR：将细胞去培养基后使用裂解液裂解，使用细胞细菌总RNA提取试剂盒(DP430，天根生化科技有限公司)提取总RNA后，使用Quant cDNA第一链合成试剂盒(KR103，天根生化科技有限公司)将RNA反转录为cDNA，然后使用SuperReal PreMix(SYBR Green)(FP204，天根生化科技有限公司)荧光染料及EGFP引物，通过7500Fast实时荧光定量PCR仪进行qRT-PCR操作，以检测EGFP mRNA的表达量。
表1 本专利所使用引物序列
(3)流式细胞术：将细胞去培养基后用0.05％胰酶-EDTA消化并终止后，转移入1.5mL EP管中，1000rpm离心5min后弃上清，用200μL磷酸盐缓冲液PBS重悬细胞后通过流式细胞分析仪(BD Calibur,BD company,USA)检测EGFP荧光。
(4)RNAe的序列及构建：若无特殊说明，一般RNAe的命名方式如下，以pRNAe-egfpc1为例，首字母小写的“p”表示该分子是表达RNAe的质粒DNA分子，无p表示该RNAe并非通过质粒的方式在细胞中表达，或该为某一RNAe质粒在细胞中的表达产物RNA分子；“RNAe”代表其类型，有RNAe(即原长RNAe)，AT-RNAe与minRNAe三种；横线后小写的“egfpc1”代表该RNAe的配对蛋白，以蛋白名称的小写命名。原始pRNAe-egfpc1质粒中，下述RNAe序列由CMV启动子启动，其后含有一段polyA信号序列，该二者未列出在以下序列中。表达RNAe的DNA序列如下：
ccggtgaacagctcctcgcccttgctcaccatggtggcgaccggtagcgctagcggatctgacggttc actagatgcggccgccactgtgctggatatctgcagaattcgcccttcagtgctagaggaggtcagaagagggcattggatcccccagaactggagttatacggtaacctcgtggtggttgtgaaccaccatgtggatggatattgagttccaaacactggtcctgtgcaagagcatccagtgctcttaagtgctgagccatctctttagctccagtctcttaaaaaacaaacaaacgaacgaacagcaagggagctgggtatgacaacacatactataattctagtactcaggatgctgaaacaggaggattgcctgactgggagatataaggagaatctgttgtcacccccacccctccccataaaggcagaataaaagaacgtcctataaacaaataaacaaacaacccAATAAAacaaaaccaagatctctccaccttttctttgctttttcagactttgtaataaggccctttggagtgcaggatattcggcaggacaagcagagagggagaccatcagttctttctttgatcaagaagactatgttccttagcaaactggtgtgtattatctcttatgcaatgagcctggaaagagggcacagccaccgaggatggtacagcatggatggatggtacgctacagagactcgggagcccaactgtgagtggctgactggcatggtaggttcagggaagaattggcctgtgaagaaaatgttcttgaaaagtgaacaaggtgcaggaggtaggagtgggtcctgggcaaagcagggggtgcatcccagcctcagggaatagcacagcagaggtctgttgatgcatgcgagtgcatgacctgcttgccaatagacgatcaagaatgggcaaagcatcatgggtgatgagtgggagaggggatgagacattcctttctccctgctgagacttccattgaaccgatgagttctgaatagaagatgcccccccacccccccaccagtgtagaatctgaagggaggcatatattaccctatattactctgtgttggcggcgagctatctgacagccaaccttcccatacatttcattgggcatacactaatgacaggaagttccttttgcttgtatgcaagagatggctcacacgatggagaatttaatcttg
其中下划线为配对部分，后文所述将某序列替换配对区即为替换该部分(在三种RNAe中均如此)。粗体部分为倒置的SINEB2保守序列，该序列在所有RNAe与minRNAe中保守，为RNAe发挥功能所必须。其余斜体为尾端部分，为全长RNAe，AT-RNAe与minRNAe所不同的。pAT-RNAe-egfpc1序列为：
ccggtgaacagctcctcgcccttgctcaccatggtggcgaccggtagcgctagcggatctgacggttc actagatgcggccgccactgtgctggatatctgcagaattcgcccttcagtgctagaggaggtcagaagagggcattggatcccccagaactggagttatacggtaacctcgtggtggttgtgaaccaccatgtggatggatattgagttccaaacactggtcctgtgcaagagcatccagtgctcttaagtgctgagccatctctttagctccagtctcttaaaaaacaaacaaacgaacgaacagcaagggagctgggtatgacaacacatactataattctagtactcaggatgctgaaacaggaggattgcctgactgggagatataaggagaatctgttgtcacccccacccctccccataaaggcagaataaaagaacgtcctataaacaaataaacaaacaaccc
pminRNAe-egfpc1序列为：
ccggtgaacagctcctcgcccttgctcaccatggtggcgaccggtagcgctagcggatctgacggttc actagatgcggccgccactgtgctggatatctgcagaattcgcccttcagtgctagaggaggtcagaagagggcattggatcccccagaactggagttatacggtaacctcgtggtggttgtgaaccaccatgtggatggatattgagttccaaacactggtcctgtgcaagagcatccagtgctcttaagtgctgagccatctctttagctcc
通过对内源天然的AS Uchl1(Carrieri et al.,Long non-coding antisenseRNA controls Uchl1translation through an embedded SINEB2repeat；Nature.2012；491(7424):454-7)进行序列研究，发现在部分ALU序列后存在三个可能的AAUAAA加尾信号(图1A)，说明原始RNAe可能在ALU后存在可变的加尾方式。我们将pRNAe-egfpc1(序列见上文)如上述方式转染入HEK293T中，48h后提取细胞总RNA，并通过qRT-PCR分别对预测的可变加尾信号之前(引物见表1upstream-f与upstream-r)和之后(引物见表1downstream-f与downstream-r)的序列的表达量进行检测。我们将未经转染的pRNAe-egfpc1质粒的检测结果作为对照(因为质粒并未表达，上游序列与下游序列一定是相等的关系，不存在可变加尾现象)，结果显示细胞内表达的RNAe分子的可变加尾信号前后的序列的表达比例与对照组质粒的不同，上游序列相对表达量高于下游(图1B示标准曲线与实际试验中上下游所得出示数的相对差值)，说明原始RNAe具有可变加尾的现象。对RNAe进行3’RACE【Takara Bio公司的3'-Full RACE Core Set(6121)】的检测结果证明了poly(A)外的可变加尾具体发生在第480位的加尾信号上(图1C)。
图1B中，对照组pRNAe-egfpc1质粒测得的Ct下游-Ct上游≈1(平均值)(约等式一)，实验组中细胞内转录的RNAe-egfpc1的Ct下游-Ct上游≈-1(平均值)(约等式二)，因为上游引物区不存在可变加尾，故质粒和细胞内的Ct上游相等，将约等式二减去约等式一，得细胞内的Ct下游-质粒的Ct下游≈-2，即细胞内的下游引物检测结果为质粒的下游引物检测结果的2-(-2)＝4倍，所以RNAe前端与尾端比为4:1，由于存在尾端的全长RNAe也会存在等量的前端，所以RNAe约有1/4在poly(A)加尾，约有3/4在ALU之后poly(A)之前进行了可变加尾，所以只有前端的AT-RNAe与全长RNAe比例为3:1。进一步的测序实验证明RNAe分子在第480位(上文pRNAe-egfpc1序列中斜体并大写的AATAAA位置)进行加尾，故RNAe更倾向于在poly(A)之前提前加尾。这一结果也暗示了该加尾点之后的序列对RNAe的功能可能是非必须的。
在此研究基础上，我们将pRNAe-egfpc1质粒截去该加尾点之后的序列获得pAT-RNAe-egfpc1(序列见上文)，将其按上述方式转染入293T细胞并检测EGFP荧光，如图1D所示，相比对照组，加入RNAe的实验组在mRNA表达水平上与对照组并无显著差异(黑色柱组)，而EGFP荧光的表达高出超过900％(灰色柱组)，故AT-RNAe能在不改变EGFP mRNA的情况下，增强EGFP的表达。截去原始RNAe中上述加尾点之后的序列获得AT-RNAe仍具有较强的促进蛋白表达的能力，故证明了原始RNAe中加尾点之后序列的不必要性。AT-RNAe(RNAe got byalternative tailing)包括72nt(nucleotides,核苷酸)配对区，167nt倒置的SINEB2区，一些其余调控序列及poly(A)信号区，除在体内自发加尾后得到的poly(A)尾以外，序列共480nt，是一条与原始全长RNAe增强翻译效率相似但序列较短结构更简单的RNAe。
实施例2 与目的mRNA的配对区及倒置的SINEB2序列是RNAe发挥功能的充分条件，并以此构建人工minRNAe
Carrieri等(Carrieri et al.,Long non-coding antisense RNA controlsUchl1translation through an embedded SINEB2 repeat；Nature.2012；491(7424):454-7)证明了倒置的SINEB2序列对AS Uchl1的必要性，在此基础上我们证明了倒置的SINEB2序列是配对区外RNAe分子发挥功能的充分条件，并以此构建了人工minRNAe。
我们分别截去了pRNAe-egfpc1的RNAe序列中SINEB2之后的部分序列(见实施例1中pRNAe-egfpc1序列的斜体的尾端部分)：SINEB2之后，ALU之后，及尾端全长为827nt序列的的第227,427,627位之后的序列(但保留poly(A))，克隆得到了pminRNAe-egfpc1(无尾端部分)，pRNAe-egfpc1-Δ827(尾端部分序列为agtctcttaaaaaacaaacaaacgaacgaacagcaagggagctgggtatgacaacacatactataattctagtactcaggatgctgaaacaggaggattgcctgactggga)，pRNAe-egfpc1-Δ600(尾端部分序列为agtctcttaaaaaacaaacaaacgaacgaacagcaagggagctgggtatgacaacacatactataattctagtactcaggatgctgaaacaggaggattgcctgactgggagatataaggagaatctgttgtcacccccacccctccccataaaggcagaataaaagaacgtcctataaacaaataaacaaacaacccAATAAAacaaaaccaagatctctccaccttttctttgctttttcagactttgtaataaggccctttggagtgcaggatattcggcaggacaagcagagagggagaccatcagttctttctttgatcaagaagactatgtt)，pRNAe-egfpc1-Δ400(尾端部分序列为agtctcttaaaaaacaaacaaacgaacgaacagcaagggagctgggtatgacaacacatactataattctagtactcaggatgctgaaacaggaggattgcctgactgggagatataaggagaatctgttgtcacccccacccctccccataaaggcagaataaaagaacgtcctataaacaaataaacaaacaacccAATAAAacaaaaccaagatctctccaccttttctttgctttttcagactttgtaataaggccctttggagtgcaggatattcggcaggacaagcagagagggagaccatcagttctttctttgatcaagaagactatgttccttagcaaactggtgtgtattatctcttatgcaatgagcctggaaagagggcacagccaccgaggatggtacagcatggatggatggtacgctacagagactcgggagcccaactgtgagtggctgactggcatggtaggttcagggaagaattggcctgtgaagaaaatgttcttgaaaagtgaacaaggtgcaggag)，pRNAe-egfpc1-Δ200(尾端部分序列为agtctcttaaaaaacaaacaaacgaacgaacagcaagggagctgggtatgacaacacatactataattctagtactcaggatgctgaaacaggaggattgcctgactgggagatataaggagaatctgttgtcacccccacccctccccataaaggcagaataaaagaacgtcctataaacaaataaacaaacaacccAATAAAacaaaaccaagatctctccaccttttctttgctttttcagactttgtaataaggccctttggagtgcaggatattcggcaggacaagcagagagggagaccatcagttctttctttgatcaagaagactatgttccttagcaaactggtgtgtattatctcttatgcaatgagcctggaaagagggcacagccaccgaggatggtacagcatggatggatggtacgctacagagactcgggagcccaactgtgagtggctgactggcatggtaggttcagggaagaattggcctgtgaagaaaatgttcttgaaaagtgaacaaggtgcaggaggtaggagtgggtcctgggcaaagcagggggtgcatcccagcctcagggaatagcacagcagaggtctgttgatgcatgcgagtgcatgacctgcttgccaatagacgatcaagaatgggcaaagcatcatgggtgatgagtgggagaggggatgagacattcctttctccctgctgagacttccattgaaccgatgagtt)(该部分由于是过渡序列，命名方式不符合之前RNAe命名规律)(分别对应图2A中的minRNAe，Δ827，Δ600，Δ400，Δ200)。将含这些RNAes的质粒按实施例1的方式转染HEK293T细胞并进行验证，结果发现，不同截断的RNAe都具有不亚于全长RNAe的促进EGFP表达的能力(图2B)。特别是pminRNAe-egfpc1(图2A中示意为minRNAe)，是其中具有最强作用的RNAe(约450％增强)，我们将这条最短的RNAe命名为minRNAe，它仅包括72nt配对区，167nt SINEB2区及poly(A)信号区，除在体内自发加尾后得到的poly(A)尾以外，其余序列共282nt，是一条经优化的最短且功能较强的RNAe。
实施例3 对RNAe配对区的优化可以提高其翻译增强效率
我们首先研究了RNAe分子与目的mRNA的配对区，发现与5’-TR(翻译区)配对的部分比5’-UTR(非翻译区)配对的部分对RNAe分子功能更加重要。且对配对区的优化可以提高RNAe分子的翻译促进效率。
我们构建了含有只与pEGFP-N1质粒(Clonetech公司产品)中EGFP mRNA5’-UTR配对的RNAe(40:0，100:0)(pRNAe-egfpn1-40:0(配对部分序列为GGTGGCGACCGGTGGATCCCGGGCCCGCGGTACCGTCGAC)，pRNAe-egfpn1-100:0(配对序列为GGTGGCGACCGGTGGATCCCGGGCCCGCGGTACCGTCGACTGCAGAATTCGAAGCTTGAGCTCGAGATCTGAGTCCGGTAGCGCTAGCGGATCTGACGGT))，和只与pEGFP-N1质粒中EGFP mRNA5’-TR配对的RNAe(0:32,0:100,0:200)(pRNAe-egfpn1-0:32(配对序列为为CCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCAT)，pRNAe-egfpn1-0:100(配对序列为CCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCAT)，pRNAe-egfpn1-0:200(配对序列为TAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCAT))。以含原始长度配对区的pRNAe-egfpn1(配对序列为CCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGACCGGTGGATCCCGGGCCCGCGGTACCGTCGAC)作为对照(图3中40:32组)，不含与EGFP mRNA配对的pRNAe-negative(无配对区序列)作为空对照(图3中0:0组)，将0.3μg pEGFP-N1质粒与1.2μg各RNAe质粒按实施例1中的方式转染入HEK293T细胞中，48h后用流式细胞仪测量细胞的平均荧光强度。结果如图3A所示，与空对照0:0组相比，40:0与100:0组不能增强EGFP的荧光，说明只与EGFP mRNA5’-UTR配对的RNAe几乎无法促进EGFP表达，即证明了5’-UTR配对区对RNAe功能的不充分性及5’-TR配对区对RNAe功能的必要性；与空对照0:0组相比，0:32，0:100，0:200组都能增强EGFP的表达，说明只与EGFP mRNA5’-TR配对的RNAe可以促进EGFP的表达，且0:200组对EGFP的增强也证明了当配对长度超过100nt后也可与原始配对长度一样促进蛋白表达(图3A)，即5’-TR配对区足以行使配对的功能及5’-UTR配对区对RNAe功能的不必要性。这些结果证明了RNAe中与目的mRNA5’-TR的配对区对RNAe功能具有必要性，且5’-TR对整个配对区的充分性；5’-UTR配对区对RNAe促进蛋白表达的功能既非充分也非必要性。
原始RNAe与目的mRNA序列的-40nt到+32nt(40:32，以ATG中的A作为第1个核苷酸)配对，为研究配对区长度对RNAe功能的影响，因为与5’-TR配对区的重要性更强，我们改变了5’-TR配对区的长度，设计了与pEGFP-C1质粒中EGFP序列对应的RNAe(图3B中40:360组，40:560组，40:760组)(pRNAe-egfpc1-40:360(配对区为CAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCTGACGGTTCACTA)，pRNAe-egfpc1-40:560(配对区为GTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCTGACGGTTCACTA)，pRNAe-egfpc1-40:760(配对区为CGACTGCAGAATTCGAAGCTTGAGCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCTGACGGTTCACTA))进行实验。以含原始长度配对区的pRNAe-egfpc1作为对照(图3B中40:32组)，不含与目的mRNA配对的pRNAe-negative作为空对照(图3B中0:0组)，将0.3μg pEGFP-C1质粒与1.2μg各RNAe质粒按实施例1方式转染入HEK293T细胞中，48h后用流式细胞仪测量细胞的平均荧光强度。结果如图3B所示，40:32及40:360组能显著增强EGFP的荧光，达一倍以上的增加量。而40:560和40:760组则没有促进荧光的效果，甚至40:760组还能降低荧光。这些结果证明，延长RNAe中与5’-TR的配对长度具有一定的局限，当配对总长度小于400nt时可以起到促进目的蛋白表达的作用，但当总长度超过600nt时反而会抑制目的蛋白的表达，这种抑制作用可能源于长反义RNA对相应mRNA的抑制翻译或降解的作用。
此外，我们用改变配对区长度后的RNAe来检验其对HIV单克隆抗体10E8(Yu,Y.,Tong,P.,Li,Y.,Lu,Z.&Chen,Y.10E8-like neutralizing antibodies against HIV-1induced using a precisely designed conformational peptide as a vaccineprime.Sci China C Life Sci57,117-127(2014))表达促进的影响。我们构建了pminRNAe-Ab-40:32-uni(针对抗体轻重链的公用minRNAe(与轻重链的相同分泌信号序列配对)，配对序列为ACTAGAAAAAGGATGATACATGACCATCCCATGGTGGAATTCAATCGATAGAACCGAGGTGCAGTTGGACCT)，pminRNAe-Ab-40:100-10e8h(针对抗体重链的minRNAe，配对序列为CAGGCTTCACCAAGCCTCCCCCAGACTCCACCAGCTGCACCTCAGAATGTACACCGGTTGCAGTTGCTACTAGAAAAAGGATGATACATGACCATCCCATGGTGGAATTCAATCGATAGAACCGAGGTGCAGTTGGACCT)，pminRNAe-Ab-40:100-10e8l(针对抗体轻链的minRNAe，部分序列为CCAGGGCCACAGAGACACCAGTCTCCTGTGTCAGCTCATAGGAGGTCACAGAACCGGTTGCAGTTGCTACTAGAAAAAGGATGATACATGACCATCCCATGGTGGAATTCAATCGATAGAACCGAGGTGCAGTTGGACCT)，pminRNAe-Ab-100:32-uni(针对抗体轻重链的公用minRNAe，配对序列为ACTAGAAAAAGGATGATACATGACCATCCCATGGTGGAATTCAATCGATAGAACCGAGGTGCAGTTGGACCTGGGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAAGTGGATGTTATTCTAT)，pminRNAe-Ab-100:200-10e8h(针对抗体重链的minRNAe，配对序列为ACCCATTCGAGGCCCTTCCCTGGAGGCTGGCGGACCCAAGTCATCCAGGCGTTATCGAAGTCGAAACCAGAGGCTGAACATGAGAGTCTAAGGGATCCTCCAGGCTTCACCAAGCCTCCCCCAGACTCCACCAGCTGCACCTCAGAATGTACACCGGTTGCAGTTGCTACTAGAAAAAGGATGATACATGACCATCCCATGGTGGAATTCAATCGATAGAACCGAGGTGCAGTTGGACCTGGGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAAGTGGATGTTATTCTAT)，pminRNAe-Ab-100:200-10e8l(针对抗体轻链的minRNAe，配对序列为TAGAAGAGAAGTATAGGGGCCTGTCCTGGCTTCTTTTGGTACCAACTTGCATAATGACTTCTGAGGCTGTCTCCCCGGCACGTGATTGTGACTGTCCGTCCCAGGGCCACAGAGACACCAGTCTCCTGTGTCAGCTCATAGGAGGTCACAGAACCGGTTGCAGTTGCTACTAGAAAAAGGATGATACATGACCATCCCATGGTGGAATTCAATCGATAGAACCGAGGTGCAGTTGGACCTGGGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAAGTGGATGTTATTCTAT)，pminRNAe-Ab-200:48-uni(针对抗体轻重链的公用minRNAe，配对序列为ACCGGTTGCAGTTGCTACTAGAAAAAGGATGATACATGACCATCCCATGGTGGAATTCAATCGATAGAACCGAGGTGCAGTTGGACCTGGGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAAGTGGATGTTATTCTATAGTGTCACCTAAATCGTATGTGTATGATACATAAGGTTATGTATTAATTGTAGCCGCGTTCTAACGAAGCCAAGGGGGTGGGCCTATAGACTCTATAGGCGGTACTTACGTCA)及pAT-RNAe-Ab-40:32-uni(针对抗体轻重链的公用AT-RNAe，配对序列为ACTAGAAAAAGGATGATACATGACCATCCCATGGTGGAATTCAATCGATAGAACCGAGGTGCAGTTGGACCT)，pAT-RNAe-Ab-40:100-10e8h(针对抗体重链的AT-RNAe，配对部分序列为CAGGCTTCACCAAGCCTCCCCCAGACTCCACCAGCTGCACCTCAGAATGTACACCGGTTGCAGTTGCTACTAGAAAAAGGATGATACATGACCATCCCATGGTGGAATTCAATCGATAGAACCGAGGTGCAGTTGGACCT)，pAT-RNAe-Ab-40:100-10e8l(针对抗体轻链的AT-RNAe，配对序列为CCAGGGCCACAGAGACACCAGTCTCCTGTGTCAGCTCATAGGAGGTCACAGAACCGGTTGCAGTTGCTACTAGAAAAAGGATGATACATGACCATCCCATGGTGGAATTCAATCGATAGAACCGAGGTGCAGTTGGACCT)，pAT-RNAe-Ab-100:32-uni(针对抗体轻重链的公用AT-RNAe，配对序列为ACTAGAAAAAGGATGATACATGACCATCCCATGGTGGAATTCAATCGATAGAACCGAGGTGCAGTTGGACCTGGGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAAGTGGATGTTATTCTAT)，pAT-RNAe-Ab-100:200-10e8h(针对抗体重链的AT-RNAe，配对部分序列为ACCCATTCGAGGCCCTTCCCTGGAGGCTGGCGGACCCAAGTCATCCAGGCGTTATCGAAGTCGAAACCAGAGGCTGAACATGAGAGTCTAAGGGATCCTCCAGGCTTCACCAAGCCTCCCCCAGACTCCACCAGCTGCACCTCAGAATGTACACCGGTTGCAGTTGCTACTAGAAAAAGGATGATACATGACCATCCCATGGTGGAATTCAATCGATAGAACCGAGGTGCAGTTGGACCTGGGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAAGTGGATGTTATTCTAT)，pAT-RNAe-Ab-100:200-10e8l(针对抗体轻链的AT-RNAe，配对序列为TAGAAGAGAAGTATAGGGGCCTGTCCTGGCTTCTTTTGGTACCAACTTGCATAATGACTTCTGAGGCTGTCTCCCCGGCACGTGATTGTGACTGTCCGTCCCAGGGCCACAGAGACACCAGTCTCCTGTGTCAGCTCATAGGAGGTCACAGAACCGGTTGCAGTTGCTACTAGAAAAAGGATGATACATGACCATCCCATGGTGGAATTCAATCGATAGAACCGAGGTGCAGTTGGACCTGGGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAAGTGGATGTTATTCTAT)，pAT-RNAe-Ab-200:48-uni(针对抗体轻重链的公用AT-RNAe，配对序列为ACCGGTTGCAGTTGCTACTAGAAAAAGGATGATACATGACCATCCCATGGTGGAATTCAATCGATAGAACCGAGGTGCAGTTGGACCTGGGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAAGTGGATGTTATTCTATAGTGTCACCTAAATCGTATGTGTATGATACATAAGGTTATGTATTAATTGTAGCCGCGTTCTAACGAAGCCAAGGGGGTGGGCCTATAGACTCTATAGGCGGTACTTACGTCA)(因为抗体表达需要表达轻重链两个单独的蛋白，对应于HIV单克隆抗体10E8两条链我们分别称之为10E8H(heavychain，重链)与10E8L(light chain，轻链)，设计RNAe时就会产生两条RNAe分别对应这两个蛋白(即一些RNAe中标的10e8h与10e8l)，但有时两种RNAe序列一致，即作为同一条RNAe(即命名中加入-uni))(图3C中分别为40:32，40:100,100:32,100:200,200:48)。ELISA(酶联免疫吸附实验)结果显示，这些不同配对长度的AT-RNAe和minRNAe对10E8的表达都有显著性的提高，增加均超过50％，而改变RNAe与抗体的配对方式(40:100,100:32,100:200,200:48)后，其促进作用与原长(40:32)相比并没有显著性的差异(图3C)。
这些结果证明了RNAe中不同长度的配对区对其促进翻译功能的强弱有一定的影响，在使用RNAe时可以针对不同的蛋白进行优化选择，同时也说明了原始的配对长度(40:32)的RNAe已具有相对较优的促进翻译效果。在具体的使用过程中如只需要一定程度的蛋白表达提高可以直接使用构建方便的原始配对长度的RNAe，但如果在生产中需要针对性的对某一特定蛋白进行最优RNAe筛选，则需要考虑通过对其与目的mRNA的配对区的长度进行一定程度的优化。
该结果及图1，图2中结果同样证明了原长RNAe形式，AT-RNAe形式，minRNAe形式三者对于蛋白的促进作用虽然效果可能具有强弱之分，但对于某一特定蛋白均同样有促进效果，可以推之，若某一种RNAe形式对于某一蛋白具有促进效果，则相应的另两种RNAe形式依同种方式设计也同样会具有促进效果。
实施例4 RNAe具有高度专一性
在序列分析时我们认为RNAe方法具有十分强的专一性，该专一性可能由RNAe上与目的mRNA的配对区(通常情况下是与40nt的5’-UTR(非翻译区)和32nt的5’-TR(翻译区)配对)保证。为了进一步证明该推断，我们在人的基因中选用了23个基因(见实施例10)并设计相应的RNAe，使用NCBI的Blast打分功能对这23个RNAe序列与人的全转录组进行比对，发现每种RNAe只存在一个高评分对应基因，就是设计中该RNAe本身可促进的基因，其余可能来源于错配的评分均十分低下(表2)，分值高低在Blast的打分功能中代表其配对性的强弱，证明预测中RNAe可能倾向于只结合一个明确的其对应的基因。
我们使用蛋白组学分析验证了RNAe方法增强蛋白表达的靶标专一性。我们在稳定转染EGFP蛋白的HEK293T细胞系(将pEGFP-C1的从CMV启动子至poly(A)序列(编码EGFP蛋白部分，启动子及3‘UTR部分)进行克隆与慢病毒包装，再侵染HEK293T细胞，由唯尚立德生物科技有限公司提供)中依据实施例1中的方式转染入pRNAe-Mock(没有RNAe序列的空载体，来源于下述文献中(文献中命名为pN1)Yao,Y.,He,Y.,Guan,Q.&Wu,Q.A tetracyclineexpression system in combination with Sox9 for cartilage tissueengineering.Biomaterials35,1898-1906(2014))，pAT-RNAe-egfpc1(无配对区的RNAe)或pminRNAe-egfpc1，并进行全蛋白质谱分析(Guo,Q.et al.Dissecting the in vivoassembly of the30S ribosomal subunit reveals the role of RimM and generalfeatures of the assembly process.Nucleic Acids Res41,2609-2620(2013).)。以pRNAe-Mock转染组作为对照，另两组分别与之相比。质谱结果如图4所示，每一点代表一个蛋白，蓝色菱形代表该蛋白在对照组与实验组中表达差距在2倍以内(实验组在1/2-2倍对照组之间)，或对照组与实验组表达量变化无显著性差异，或其中一种蛋白在另一组内未检出；而红色三角代表有超过2倍表达差距且有显著性意义的蛋白。表达变化大的蛋白(红色)特别少(10/4440于图4A中，5/4440于图4B中)，表明这三组之间几乎没有显著差异的EGFP外的蛋白，即RNAe分子在细胞内只影响了目的mRNA的表达，而不影响其他蛋白的表达，故验证了RNAe方法促进蛋白表达的专一性。
表2 应用NCBI数据库Blast功能对RNAe的专一性进行评估
实施例5 RNAe方法可以在多种物种的细胞中起作用
作为一种蛋白调控技术，RNAe方法适用性广泛，可以作用于多种物种的细胞中，它能在人源的HEK293T，HEK293A，HeLa细胞，中国仓鼠细胞系CHO-K1，大鼠源细胞系C5.18和原代软骨细胞(具体见实施例6)中起作用，具体如下。
我们在几种广泛用于科研及生产真核蛋白的细胞系中，如人细胞系HEK293T，HEK293A，HeLa，和中国仓鼠细胞系CHO-K1，检测了RNAe对pEGFP-C1中EGFP表达的影响。按实施例1的方式，我们将pEGFP-C1质粒与pminRNAe-egfpc1质粒共转染入上述四种细胞系，同样以pRNAe-Mock(无RNAe序列的空载体)作为对照。流式分析结果(图5)显示在所有被检测的细胞系中，HEK293T与HEK293A细胞中RNAe的促进荧光强度约200％，HeLa细胞中RNAe的促进荧光强度约150％，CHO-K1细胞中RNAe的促进荧光强度约40％，虽然其具体促进倍数不同但RNAe-egfpc1都能显著增强EGFP的表达。同理可以推出AT-RNAe和原长RNAe在这些种类的细胞中均有效果。
实施例6 RNAe可以促进内源蛋白的表达
以上实施例中我们采用RNAe方法对外源基因的表达进行促进，如果证明RNAe能够增强细胞内源基因的表达并不影响其生理功能，则可以扩展其应用。这里我们选取了SRY(sex determining region Y)-box9(SOX9)为例，它是软骨发育中的一个能够转录下游基质蛋白(如II型胶原(Col2a))的重要转录因子。我们构建了pRNAe-sox9质粒(配对序列为GTCATCTTCATGAAGGGGTCCAGGAGATTCATACGCGAGCCCGGGGCAGGGGGCGGGTGGCCGGGAAAGGAG)，并使用Lipofectamine3000试剂(Invitrogen，USA)将其依说明书的方式以1μg每个12孔板的孔的量转染入大鼠前软骨细胞系C5.18中。如图6A中Western blot(Lin X.,Wu L.,ZhangZ.M.,Yang R.H.,Guan Q.,Hou X.F.,Wu Q.*,MiR-335-5p Promotes Chondrogenesis inMouse Mesenchymal Stem Cells and is Regulated Through Two Positive FeedbackLoops.Journal of Bone and Mineral Research)所示，相比左列对照组，右列转染了pRNAe-sox9质粒的实验组内标蛋白glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)灰度相同而SOX9蛋白的灰度明显增加，表明pRNAe-sox9能够促进SOX9蛋白的表达。
为进一步验证通过pRNAe-sox9增加表达的SOX9蛋白具有生理活性(促进软骨分化)，我们通过阿利新蓝对软骨特异性基质蛋白糖胺多糖染色的方式(Yao Y,He Y,Guan Q,et al.A tetracycline expression system in combination with Sox9for cartilagetissue engineering[J].Biomaterials,2014,35(6):1898-1906.)验证其是否发挥生理功能。我们以空载体pRNA-Mock作为阴性对照组，以过表达SOX9基因(使用pC-S9质粒过表达的方法，来源文献Yao Y.,He Y.,Guan Q.,Wu Q.*,A tetracycline expression system incombination with Sox9 for cartilage tissue engineering.Biomaterials,2014,35:1898-1906.)作为阳性对照组，转染pRNAe-sox9质粒作为实验组，将它们转染入C5.18和大鼠原代软骨细胞中。染色结果(图6B)显示阳性对照组(最右列)比阴性对照组(最左列)蓝色深，即糖胺多糖多，证明Sox9蛋白增多能导致糖胺多糖表达增多。对于实验组(中列)，可以看到相比阴性对照组蓝色更深，同理可表明这些由pRNAe-sox9所促进的SOX9蛋白能促进糖胺多糖的表达，即具有正常的生理功能。同理可以推出AT-RNAe和minRNAe两种RNAe形式也可促进内源基因表达。
实施例7 RNAe可以促进分泌型蛋白的表达
之前的实施例中我们验证了RNAe方法可以促进多种胞内的非分泌型蛋白表达，进一步我们验证RNAe方法可以应用于对分泌型蛋白的促进。首先我们选择了一种分泌型的报告基因：分泌性荧光素酶蛋白(相对于该蛋白我们构建了pAT-RNAe-metluciferase(AT-RNAe，配对序列为AACACCAGGGTGAACACCACCTTGATGTCCATGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCTGACGGTTCACTA)与pminRNAe-metluciferase(minRNAe，配对序列为AACACCAGGGTGAACACCACCTTGATGTCCATGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCTGACGGTTCACTA))我们同样使用表达分泌性荧光素酶蛋白的质粒(Clonetech公司购买其质粒克隆该基因至pEGFP-C1载体中)与依照上述方式设计构建的RNAe质粒按实施例1中的转染方式对HEK293T细胞进行转染，并收集细胞上清液进行检测。对分泌性荧光素酶的蛋白检测使用【普洛麦格生物技术有限公司的
双萤光素酶报告基因检测系统(E1910)】，通过对照组将相对荧光强度归一后，可以看出pAT-RNAe-metluciferase对分泌性荧光素酶蛋白在酶促反应中的荧光强度具有超过100％的显著促进作用，pminRNAe-metluciferase对分泌性荧光素酶蛋白在酶促反应中的荧光强度具有超过50％的显著促进作用，这证明了细胞上清液中分泌型荧光素酶蛋白中表达量都具有显著提升，证明两种RNAe对细胞中分泌型荧光素酶蛋白的表达提升并最终带来了其分泌量的提升(图7)。
实施例8 RNAe可以促进抗体的表达，具有工业生产应用的潜能
抗体在科研及医学应用中具有重要的价值，促进抗体的表达与生产具有重大的意义；同时抗体具有四聚体(两个重链两个轻链)结构，且需要进行糖基化等修饰分泌到细胞外起作用，是一种比较特殊的蛋白，RNAe在其中的应用也进一步证明了它的适用性广泛。
由于抗体的轻重链共享同一信号肽，我们针对抗体质粒构建了单一的(40:32)的两种RNAe(pminRNAe-Ab-UNI-40:32及pAT-RNAe-Ab-UNI-40:32，序列见实施例3)来促进单克隆抗体10E8(Yu,Y.,Tong,P.,Li,Y.,Lu,Z.&Chen,Y.10E8-like neutralizingantibodies against HIV-1induced using a precisely designed conformationalpeptide as a vaccine prime.Sci China C Life Sci57,117-127(2014))的表达，对照组是无配对区的pRNAe-negative质粒。我们将抗体轻重链质粒及对应的单一RNAe质粒pminRNAe-Ab-UNI-40:32及pAT-RNAe-Ab-UNI-40:32依实施例1的转染方式转入HEK293T细胞中，对使用其对应的抗原MPER(序列为RRRNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIRRRR，由中肽生化有限公司进行合成)进行ELISA检测(Yu Y,Tong P,Li Y,et al.10E8-likeneutralizing antibodies against HIV-1induced using a precisely designedconformational peptide as a vaccine prime[J].Science China Life Sciences,2014,57(1):117-127.)。通过对照组将ELISA实验结果归一后，可以看出两种RNAe对ELISA实验发光强度都有超过100％的促进作用(图3C中40：32组)，这证明了细胞上清液中10E8增多，证明RNAe对细胞中10E8的表达提升并最终带来了其分泌量的提升。
实施例9 RNAe可以通过多种形式载入细胞中起作用
RNAe方法作为一种蛋白调控技术，可以通过质粒或慢病毒载体进入细胞核后转录发挥作用，也可先在体外转录获得转录本RNA然后再转染入细胞质直接发挥功能，这大大拓宽了它的应用范围。
(1)由以上实施例可以证明RNAe方法可用质粒载体转染进入细胞发挥功能。
(2)RNAe可以通过如慢病毒等稳定转染的方式转染进入细胞发挥功能。因此可以通过构建稳定转染的细胞系从而得到对某种蛋白持续表达提升的细胞系，这可以方便RNAe在实际生产时的应用。我们将pAT-RNAe-egfpc1与pminRNAe-egfpc1的RNAe序列包装入慢病毒载体内，并侵染HEK293T细胞得到表达该二者的稳定转染细胞系。再通过将其中转染pEGFP-C1质粒并测量其荧光从而检测其功能。由图8A中可以看出，稳定转染两种RNAe的细胞系相比对照组普通HEK293T细胞的荧光表达均提升超过100％，这证明稳定转染的RNAe也同样具有生理功能。
(3)RNAe可先通过体外转录然后转染入细胞发挥功能，且没有5’加帽的RNAe降低了体外加帽的成本。因质粒转染细胞后需进入细胞核才能转录发挥功能，而质粒进入细胞核又是其发挥功能过程的限制步骤，与之相比，转染的RNA无需进入细胞核进行转录，可以直接在细胞质内发挥功能，所以其转染的最终效率会更高，所适用的细胞种类会更多。我们将体外转录得到的具有5’加帽和没有5’加帽的RNAe转染细胞确定了两种RNA形式的RNAe同样能够促进蛋白表达，进而发挥其生理功能。没有5’加帽的RNAe的成功降低了体外加帽的成本。
我们使用T7RNA高效合成试剂盒(#E2040S，NEB(北京)有限公司)将pminRNAe-egfpc1质粒进行体外转录(以下实验的质粒具体构建见实施例10)，RNA的加帽通过加入帽类似物m7G(5′)ppp(5′)G(#S1404S，NEB(北京)有限公司)来实现。然后如实施例1的方式按每孔1μg RNA的剂量将之转染入HEK293T细胞，48h后通过Cell Counting Kit(CCK8)CCK-8/WST-8试剂盒(40203ES6，上海翊圣生物科技有限公司)检测细胞增殖速率。如图8B，经加帽的体外转录的minRNAe-bax，minRNAe-bid(Bax，Bid抑制细胞增殖)能使细胞增殖率变小，证明了体外转录的RNAe能够成功的在细胞内发挥功能。另外，如图8C所示，未加帽的体外转录得到的minRNAe-bax，minRNAe-p21，minRNAe-gsk3β，minRNAe-bid，minRNAe-e2f1也能降低细胞的增值率，说明不加帽的RNAe也能在细胞内发挥功能。综上所述，加帽及不加帽的体外转录的RNAe均能在细胞内起作用。此实验也验证了RNAe发挥功能并不需要其RNA上存在5’帽子结构及poly(A)尾。体外转录的成功与不需加帽的发挥功能可以方便RNAe适用于更多难转染体系。
实施例10 RNAe方法可以进行大规模的基因筛选，具有高通量基因筛选的潜能
基于RNAe方法的高度专一性(实施例4)，广泛的适用性(实施例5)，适用于内源蛋白(实施例6)，及作用方式多样性(实施例9)，RNAe方法具有高通量基因筛选的应用前景。
此外，构建针对某一个特定的基因的RNAe需要大概550CNY与7天时间，这种构建成本和时间与RNAi方法(应用RNAi方法进行高通量基因筛选是目前较为通用的方式)类似，其成本与时间周期适合进行高通量基因筛选。我们从文献报道中选取了23个与细胞增殖相关的基因(见表3)，通过对这些基因功能是否与文献报道相符进行了一次验证过程，由于该验证是对于大规模的基因以同样的方式进行验证，与高通量筛选模式相同，因而若该筛选成功则说明RNAe方法具有用于高通量基因筛选应用的潜能。(图9)。在该筛选中，我们以对细胞增殖的影响为筛选现象，首先选择了23种相关的内源基因(表3)，并构建了对应基因的RNAe(pRNAe-gsk3β(配对序列为GCAAAGGAGGTGGTTCTGGGCCGCCCTGACATGATCACTCTCTTCGCGAATCACCTTTTCCTTCCTTCCTCC)，pRNAe-p21(配对序列为TTCTGACGGACATCCCCAGCCGGTTCTGACATGGCGCCTCCTCTGAGTGCCTCGGTGCCTCGGCGAATCCGC)，pRNAe-e2f1(配对序列为GGGCCGCCCGCAGGGGCCCCGGCCAAGGCCATGACGCTCACGGCCCGCGCGGCCCGGGTGACAGGCGGCGGC)，pRNAe-cxcr4(配对序列为TATATCTGCAAAAGAGGCAAAGGAATGGACATTCACTTCCAATTCAGCAAGCATTAACCCAGTTAAAAAAAA)，pRNAe-eif5a2(配对序列为TCTCCAGTAGTGAAATCAATTTCGTCTGCCATGGTGGGCAGGGGAGATGGTAGTTTTTCCGTGGGAACTTTC)，pRNAe-hsp70(配对序列为TGGAAGCCCAGGTCTATGCCCACCACCGACATGGCGCCGGCTACTGCTCGGGCTCGGGCCCGGGTCCGGCCA)，pRNAe-smad3(配对序列为ATCGGGGGAGTGAAAGGCAGGATGGACGACATGGCTGGGGAGGGCGCGCGGGCGGCGAGGAGCGCCCCCGGC)，pRNAe-c-fos(配对序列为TCGTAGTCTGCGTTGAAGCCCGAGAACATCATCGTGGCGGTTAGGCAAAGCCGGGCGAGGGGCCGAGGGGCG)，pRNAe-ccne1(配对序列为TTCGCATCCCGCTCCCTGCGCTCCCTCGGCATGATGGGGCTGCTCCGGCCTGAGGCCAGGGTCTTGTCCGCG)，pRNAe-bid(配对序列为CGAGCCATCATGACCCCAGCACCGCTGCACATTCGTATTTGTTGAATGAATGAATGAACCCTTGCCAGCCCA)，pRNAe-k-ras(配对序列为GCTCCAACTACCACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGCCTCTCTCCCGCACCTGGGAGCCGCTGAGC)，pRNAe-c-myb(配对序列为CTATATATGCTGTGCCGGGGTCTTCGGGCCATGGCGCGGCGGGCGGCGGGGCTCCGCCGAGAGCCGCGGGGA)，pRNAe-erbb2(配对序列为AGCCCCCAGCGGCACAAGGCCGCCAGCTCCATGGTGCTCACTGCGGCTCCGGCCCCATGGCTCCGGCTGGAC)，pRNAe-bcl-xL(配对序列为TCAACCACCAGCTCCCGGTTGCTCTGAGACATTTTTATAATAGGGATGGGCTCAACCAGTCCATTGTCCAAA)，pRNAe-bcl-2(配对序列为TTATCGTACCCTGTTCTCCCAGCGTGCGCCATCCTTCCCAGAGGAAAAGCAACGGGGGCCAACGGCACCTCT)，pRNAe-apc(配对序列为AGCTGCTCGTAGGGCGCCACGGAGCTCGCCATCTTCAGCTCCTGCAGCGTCCGCTTACGTGCAGCTGGGCTG)，pRNAe-ctnnb1(配对序列为TCCAACTCCATCAAATCAGCTTGAGTAGCCATTGTCCACGCTGGATTTTCAAAACAGTTGTATGGTATACTT)，pRNAe-bax(配对序列为CCGCCTCTGGGCTGCTCCCCGGACCCGTCCATCACCGCCGCTCCCGCCGCCGCCTCTCGCCGGGTCCGCGCG)，pRNAe-c-myc(配对序列为TTCCTGTTGGTGAAGCTAACGTTGAGGGGCATCGTCGCGGGAGGCTGCTGGTTTTCCACTACCCGAAAAAAA)，pRNAe-src(配对序列为GCATCCTTGGGCTTGCTCTTGTTGCTACCCATGGTCCTGGTAGAAGGCAGGGGCTGTCCCAGAGGACCTGGG)，pRNAe-p53(配对序列为TCGACGCTAGGATCTGACTGCGGCTCCTCCATGGCAGTGACCCGGAAGGCAGTCTGGCTGCCAATCCAGGGA)，pRNAe-sp1(配对序列为ATTTCATCCATGGAGTGATCTTGGTCGCTCATGGTGGCAGCTGAGGGACAAGCTCAAGGGGGTCCTGTCCGG)，pRNAe-h-ras(配对序列为GCGCCCACCACCACCAGCTTATATTCCGTCATCGCTCCTCAGGGGCCTGCGGCCCGGGGTCCTCCTACAGGG))，我们分别将RNAe质粒分别转入HeLa或HEK293T细胞中，两种细胞分别经历两种培养条件：在转染后依说明书换液时，一种使用正常培养基进行换液，一种采用不加入血清的培养基进行换液(通过不同条件中的基因筛选以模拟真实科研条件下可能的情况)下通过【上海翊圣生物科技有限公司的Cell Counting Kit(CCK8)CCK-8/WST-8试剂盒(40203ES60)】测量其细胞增殖速率。结果如图9所示，进行的四组实验中，CCK8测量值与对照相比有显著性差异的基因数目有：HEK293T正常情况：12/23(8个数值降低，4个数值增高)，HEK293T血清饥饿：12/23(0个数值降低，12个数值增高)，Hela正常情况：15/23(8个数值降低，7个数值增高)，Hela血清饥饿：10/23(6个数值降低，4个数值增高)。经查阅文献得知(文献附于表3中)，所有变化基因对细胞的影响与文献趋势一致，证明RNAe进行大规模筛选是有效的。
同时我们也希望将我们所提出的RNAe方法与一种被广泛认可的方法RNAi进行对比，检定RNAe的效果。我们选择了15个基因(八个抑制增殖基因gsk3β，p21，e2f1，bid，c-myb，bax，c-myc，p53，七个促进增殖基因cxcr4，smad3，ccne1，bcl-xL，bcl-2，src，sp1)并合成了这些基因对应的RNAi分子(采用【上海吉玛制药技术有限公司】设计，合成并保证抑制效率的三条RNAi混合抑制确保其功能)。我们分别将RNAe质粒或混合的三条siRNA按Lipofectamine3000说明书转染方式分别转入HEK293T细胞中，并通过【上海翊圣生物科技有限公司的Cell Counting Kit(CCK8)CCK-8/WST-8试剂盒(40203ES60)】测量其细胞增殖速率。实验结果如图10所示，对于促进增殖的7个基因，RNAi转染后CCK8数值均下调，RNAe转染后CCK8数值均上调，两者结果虽然相反，但由于RNAe方法是促进基因表达，得到的结果是促进基因表达后的生理影响，而RNAi揭示的是抑制基因表达后的生理影响，其对基因功能的影响相反，因而相反的结果证明RNAe与RNAi相同，均可进行目的基因功能验证。同时对于抑制增殖的8个基因，可以看出RNAi转入对细胞CCK8数值几乎无影响，而RNAe转染后CCK8数值显著下调。推测源于在正常情况下的细胞中抑制细胞增殖的基因表达水平较低，其沉默未必会带来显著的生理功能，但其表达增加却能产生明显的生理效果，所以在抑制增殖的基因筛选中RNAi抑制这些基因后细胞几乎与正常生长情况无显著性差异，RNAe在这种特定情况下具有明显优势(图10)。
表3 增殖相关基因选择及功能
实施例11 单个RNAe可以促进一类具有相同5’端的mRNAs的表达
RNAe通过与目的mRNA的5’端序列配对来实现功能，故理论上具有相同5’端的蛋白都能被同一条RNAe调控。我们分别构建了在5’端有EGFP的融合蛋白EGFP-BBCK(N-terminalEGFP and C-terminal brain-type creatine kinase，脑型肌酸激酶蛋白与N端EGFP蛋白构建的融合蛋白，由pEGFP-BBCK质粒表达)和EGFP-βB2-crystallin(N-terminal EGFP andC-terminalβB2-crystallin,晶状体蛋白βB2与N端EGFP蛋白构建的融合蛋白由pEGFP-βB2质粒表达)的质粒，并与pRNAe-egfpc1质粒(由于这两个蛋白为EGFP在N端的融合蛋白，经序列比对我们发现pRNAe-egfpc1是其所对应的RNAe质粒)进行如实施例1的方式对HEK293T细胞的转染与流式术荧光测量，可以看出pRNAe-egfpc1对该两蛋白的荧光表达强度提高了至少200％(图11A)。我们同样使用Western Blot的方式对pRNAe-egfpc1的促进效果进行验证，(图11B中可以看到内标GAPDH蛋白表达不变，但对于BBCK蛋白来讲(上部分图)，位于下方的内源BBCK蛋白二者几乎相同，但上方EGFP-BBCK融合蛋白右边条带相较左边对照组更重，证明了内源的BBCK蛋白表达量不变，而EGFP-BBCK在RNAe作用下表达量提升)。对于无内源表达的βB2-crystallin蛋白，从Western Blot结果图中可以看出，下方内标GAPDH相同，而上方右边实验组相较左边对照组条带更重，说明RNAe显著促进了该蛋白表达(图11C)。
实施例12 更高表达外源基因的单质粒的构建：RNAe-Plus载体系列
传统的RNAe在使用其促进外源基因表达时，我们需要针对外源基因的表达载体依上文所述方式构建其相对应的RNAe，并将含有RNAe的质粒与原表达载体共同转染进入细胞中进行表达。为简化该过程，基于实施例8的结论(单个RNAe可以促进一类具有相同5’端的mRNAs的表达)，并考虑到在进行蛋白表达时经常利用一些人工设计的多肽标签与目的蛋白进行融合表达，我们依据此我们构建了一系列叫做pRNAe-Plus的载体。RNAe-Plus载体有一个系列，包含pRNAe-Plus-EGFP，pRNAe-Plus-HA及将来可能的针对更多通用的蛋白标签构建的pRNAe-Plus载体。一个标准的pRNAe-Plus载体包含一个含有特定的蛋白标签(比如pRNAe-Plus-HA含有HA蛋白标签，pRNAe-Plus-EGFP含有EGFP蛋白标签，诸如此例)及固定标签后的多克隆位点序列从而可以用于插入目的cDNA的多克隆位点，及一个设计好的与该特定的蛋白标签及质粒骨架上固定5’非翻译区配对的RNAe序列(图12A)。需要表达的目的蛋白的序列可插入至该特定的蛋白标签后的多克隆位点区域，从而表达N端含有固定标签的目的蛋白的融合蛋白。该设计可将需要表达的目的蛋白与RNAe构建在一个载体上，一方面减少了细胞转染时质粒的种类数目，一方面也不需要重新针对目的蛋白进行RNAe构建。
为验证该RNAe-Plus的设计是否有效，我们首先采用EGFP表达载体pEGFP-C1，通过在其表达载体上添加表达其对应RNAe的序列，构建了pRNAe-Plus-EGFP载体。同样我们也选择了多种常用蛋白表达标签包括His标签，HA标签，Myc标签，Flag标签等构建了pRNAe-Plus(比如pRNAe-Plus-His，pRNAe-Plus-HA，pRNAe-Plus-Myc，pRNAe-Plus-Flag)。同时为检验其功能，我们通过分别对每个pRNAe-Plus载体上的RNAe序列的配对部分进行截除，我们分别构建了pRNAe-Plus-Mock系列载体(比如pRNAe-Plus-Mock-HA即是对应pRNAe-Plus-HA载体的对照载体，诸如此例)。
我们首先验证pRNAe-Plus-EGFP的功能，将该质粒及对应的pRNAe-Plus-Mock-EGFP质粒依上文所述方式以不同的质粒量(分别为0.1，0.25，0.5，0.75，1，1.5μg质粒每个12孔板的孔)转染入HEK293T细胞中，并使用流式细胞术测量荧光表达强度。实验分别表明对于pRNAe-Plus-EGFP此质粒，相比对照组pRNAe-Plus-Mock-EGFP，其在0.1ug～1.5ug每孔的浓度范围内均可以显著提升测量的细胞荧光强度值，证明其可促进EGFP蛋白的表达量更高(图12B)。这证明pRNAe-Plus的构建思路是有效的。
其后，我们也使用EGFP蛋白模拟目的蛋白对构建的其余含有通用标签的pRNAe-Plus系列进行尝试。我们分别将EGFP蛋白克隆至pRNAe-Plus及pRNAe-Plus-Mock系列载体中(如对于pRNAe-Plus-HA的验证，我们分别构建了pRNAe-Plus-HA-EGFP与pRNAe-Plus-Mock-HA-EGFP)，我们同样以该pRNAe-Plus系列中的Mock质粒作为对照并将该质粒及对应的Mock质粒依上文所述方式转染入HEK293T细胞中，并使用流式细胞术测量荧光表达强度。实验分别表明对于pRNAe-Plus-HA-EGFP此质粒，相比对照组pRNAe-Plus-Mock-HA-EGFP，其测量的细胞荧光强度值增加，证明其可促进所表达的HA标签与EGFP融合蛋白的表达量更高(图12C)，证明不仅上述所构建pRNAe-Plus-EGFP一种质粒，换用不同的蛋白标签比如HA标签，pRNAe-Plus的构建模式同样可以起到效果。这也同样说明pRNAe-Plus系列可用来构建能够更高表达目的蛋白的载体。同样该思路也可以AT-RNAe或minRNAe为源构建类似的pAT-RNAe-Plus或pminRNAe-Plus载体。
Claims (20)
1.一种核酸分子，该核酸分子为：
(1)由以下元件构成的RNA分子：
与目的mRNA互补的配对区，
倒置的SINEB2序列，以及
任选的poly(A)信号区；或者
(2)能够转录该RNA分子的DNA分子；
其中所述倒置的SINEB2序列为cagtgctagaggaggtcagaagagggcattggatcccccagaactggagttatacggtaacctcgtggtggttgtgaaccaccatgtggatggatattgagttccaaacactggtcctgtgcaagagcatccagtgctcttaagtgctgagccatctctttagctcc(SEQ ID NO:61)；
其中所述配对区至少包含针对目的mRNA的5’-翻译区的序列，且所述配对区的总长度不超过600nt。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述RNA分子由以下元件构成：
与目的mRNA互补的配对区，
倒置的SINEB2序列，以及
poly(A)信号区。
3.权利要求1的核酸分子，其中所述RNA分子由以下元件构成：
与目的mRNA互补的配对区，以及
倒置的SINEB2序列。
4.权利要求1-3之任一项的核酸分子，其中所述RNA分子不含5'加帽。
5.权利要求1-3之任一项的核酸分子，其中所述配对区与目的mRNA的-100nt到+Xnt的区域配对，其中X为正整数。
6.一种促进目的蛋白表达的方法，包括：将针对所述目的蛋白的如权利要求1所述的核酸分子转染至表达所述目的蛋白的细胞中。
7.权利要求6的方法，其中所述目的蛋白为分泌型蛋白或抗体。
8.权利要求6的方法，其中所述目的蛋白为内源蛋白。
9.权利要求6的方法，其中所述目的蛋白选自由EGFP、Uchl1、SOX9、分泌性荧光素酶蛋白、HIV单克隆抗体10E8、融合蛋白EGFP-BBCK和EGFP-βB2-crystallin构成的组。
10.权利要求6-9之任一项的方法，其中所述细胞为人源细胞系、中国仓鼠细胞系或大鼠源细胞系。
11.权利要求6-9之任一项的方法，其中所述核酸分子以质粒、慢病毒载体或体外RNA转录本形式存在。
12.权利要求6-9之任一项的方法，其中所述目的蛋白基因与所述RNA分子位于同一表达载体上。
13.权利要求6-9之任一项的方法，其中所述目的蛋白选自一组具有相同5’端的多个蛋白。
14.一种表达载体，包括：
载体骨架，
固定标签及固定标签之后的多克隆位点序列，
与所述固定标签及所述载体骨架上的固定5‘非翻译区配对的核酸分子；
其中该核酸分子为：
(1)由以下元件构成的RNA分子：
与目的mRNA互补的配对区，
倒置的SINEB2序列，
任选的poly(A)信号区，以及
任选的调控元件；或者
(2)能够转录该RNA分子的DNA分子；
其中所述倒置的SINEB2序列为cagtgctagaggaggtcagaagagggcattggatcccccagaactggagttatacggtaacctcgtggtggttgtgaaccaccatgtggatggatattgagttccaaacactggtcctgtgcaagagcatccagtgctcttaagtgctgagccatctctttagctcc(SEQ ID NO:61)；
其中所述配对区至少包含针对目的mRNA的5’-翻译区的序列，且所述配对区的总长度不超过600nt。
15.权利要求14的表达载体，其中所述固定标签选自由HA、EGFP、His、Myc和Flag标签构成的组。
16.一种高通量基因筛选的方法，其特征在于：将针对所述基因的权利要求1所述的核酸分子转染至表达所述基因的细胞中，并依据所述基因的影响进行筛选。
17.权利要求16的方法，其中所述基因的影响为对细胞增殖的影响，并使用所述细胞增殖速率作为筛选条件。
18.权利要求16-17之任一项的方法，其中所述细胞为HeLa或HEK293T细胞。
19.权利要求16-17之任一项的方法，其中所述基因为抑制细胞增殖的基因。
20.权利要求19的方法，其中所述抑制细胞增殖的基因选自由：gsk3β、p21、e2f1、bid、c-myb、bax、c-myc和p53构成的组。
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