CN105623645A - 一种基于聚集诱导发光原理的荧光探针及其制备方法、应用和检测内毒素方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于聚集诱导发光原理的荧光探针及其制备方法、应用和利用荧光探针的聚集诱导发光特性和去碘离子荧光淬灭效应快速、直观地定性或定量检测内毒素方法。
Description
技术领域
本发明涉及荧光技术领域，尤其是涉及一种基于聚集诱导发光原理的荧光探针及其制备方法、应用和检测内毒素方法。
背景技术
内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的一种成分，又称之为脂多糖(LPS)，被其污染的临床用注射液进入人体后可引起发热、微循环障碍、内毒素休克以及播散性血管内凝血等毒性反应。
目前检测内毒素的方法主要为鲎试验，根据不同的鲎试剂产品，其具体试验方法可分为凝胶法、动态浊度法、终点浊度法、动态显色法和终点显色法。凝胶法为半定量检测内毒素方法，仅适合样品内毒素的限量检测；动态浊度法与动态显色法需要带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件；终点显色法需要配套酶标仪或可见分光光度计进行检测，对软硬件设施要求较高，而且动态显色法和终点显色法所需试剂价格昂贵，终点浊度法相对应试剂目前未见商品化产品，其应用受到一定限制。
目前，上述的内毒素检测方法中均无采用荧光分析法，而基于荧光的检测方法具有简便、灵敏、快速和直观的优势。此外，AIE(aggregation-inducedemission，聚集诱导发光)特性的荧光探针在分散状态时不发光，而在聚集状态时发出强荧光，利用这种特性研发了许多检测生物活性分子的新方法，例如用于检测ATP分子(ManchunZhao,MingWang,HuajieLiu,etal.Continuouson-sitelabel-freeATPfluorometricassaybasedonaggregation-inducedemissionofsilole.Langmuir2009,25,676-678；TakaoNoguchi,TomohiroShiraki,ArnabDawn,etal.NonlinearfluorescenceresponsedrivenbyATP-inducedself-assemblyofguanidinium-tetheredtetraphenylethene.Chem.Commun2012,48,8090–8092)、检测乳酸分子(XiangShen,GuanxinZhangandDeqingZhang.Anewfluorometricturn-ondetectionofL-lacticacidbasedonthecascadeenzymaticandchemicalreactionsandtheabnormalfluorescentbehaviorofsilole)和检测肝素分子(MingWang,DeqingZhang,GuanxinZhang,etal.Theconvenientfluorescenceturn-ondetectionofheparinwithasilolederivativefeaturinganammoniumgroup.ChemCommun2008,4469–4471)等，原理是利用AIE探针与检测底物分子作用后形成聚集体发出强荧光，从而检测ATP、乳酸和肝素等分子。但目前无利用AIE特性制备用于检测LPS荧光探针的报道，尤其是临床用注射用液中LPS的定性和定量检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于聚集诱导发光原理的荧光探针及其制备方法、应用和利用荧光探针的聚集诱导发光特性和去碘离子荧光淬灭效应快速、直观地定性或定量检测内毒素方法，解决现有技术中内毒素检测技术不足的问题。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种基于聚集诱导发光原理的荧光探针(TPE-Be-I)，其分子式为C37H30INS，结构式为：
本发明还提供了上述荧光探针的制备方法，包括下述步骤：
A、4-(1,2,2-三苯基乙烯)-苯甲醛(TPE-CHO)的合成：将1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯基乙烯(TPE-Br)溶于四氢呋喃溶剂中并置于-88℃～-68℃温度条件下，缓慢向反应瓶中滴加丁基锂；滴加完毕后，在-88℃～-68℃温度条件下反应，反应后将哌啶缓慢加入反应液中形成混合物，之后回到室温继续反应；反应完毕后，混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，最后将有机溶剂蒸干，以正己烷和二氯甲烷作为洗脱剂通过柱层析分离得到产物4-(1,2,2-三苯基乙烯)-苯甲醛(TPE-CHO)；
B、3-乙基-2-甲基-苯并噻唑碘盐(Be-I)的合成：将苯并噻唑和碘乙烷溶于乙腈中进行回流反应；反应完毕后，将沉淀物过滤，并用乙腈洗涤沉淀物，得到产物3-乙基-2-甲基-苯并噻唑碘盐(Be-I；
C、荧光探针(TPE-Be-I)的合成：将TPE-CHO和Be-I溶于干燥的乙醇中，氮气保护下进行回流反应；反应完毕后，将有机溶剂蒸干，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂通过柱层析分离得到产物荧光探针(TPE-Be-I)。
在本发明的荧光探针的制备方法中，在步骤A中，在-88℃～-68℃温度条件下反应2小时～4小时；在常温下反应1小时～3小时；在步骤B中，回流反应时间为20小时～28小时；在步骤C中，在氮气保护下进行回流反应时间为40小时～60小时。
在本发明的荧光探针的制备方法中，在步骤A中，所述1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯基乙烯(TPE-Br)与丁基锂的摩尔比为5：6；所述1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯基乙烯(TPE-Br)与哌啶的摩尔比为1：2；所述TPE-Br在四氢呋喃溶剂中的摩尔浓度为0.05mol/L～0.14mol/L。
在本发明的荧光探针的制备方法中，在步骤B中，所述苯并噻唑与碘乙烷的摩尔比为1：2，其中所述苯并噻唑在所述乙腈中的摩尔浓度为0.25mol/L～0.4mol/L。
在本发明的荧光探针的制备方法中，在步骤C中，步骤A中得到的产物得到产物4-(1,2,2-三苯基乙烯)-苯甲醛(TPE-CHO)与步骤B中得到的产物3-乙基-2-甲基-苯并噻唑碘盐(Be-I)之间的摩尔比为1：1，其中步骤A中得到的产物得到产物4-(1,2,2-三苯基乙烯)-苯甲醛(TPE-CHO)与步骤B中得到的产物3-乙基-2-甲基-苯并噻唑碘盐(Be-I)在所述乙醇中的摩尔浓度分别为0.03mol/L～0.04mol/L。
本发明的上述荧光探针可以应用于检测内毒素。
本发明还提供了上述荧光探针检测内毒素的方法，包括下述步骤：
S1、将荧光探针(TPE-Be-I)溶入DMSO溶液中，制备储存液；
S2、分别吸取储存液与待测溶液进行混合，混合均匀得到检测反应体系；
S3、对检测反应体系的荧光进行分析检测。
在本发明的荧光探针检测内毒素的方法中，在步骤S1中，储存液中荧光探针(TPE-Be-I)的摩尔浓度为1mmol/L～2mmol/L；在步骤S2中，所述待测溶液为临床用葡萄糖注射液、HEPES缓冲液或超纯水，吸取1μL的储存液与99μL的待测溶液混合，混合均匀后得到100μL的检测反应体系。
在本发明的荧光探针检测内毒素的方法中，在步骤S3中，在UV灯激发下观察荧光对内毒素进行定性检测，UV灯激发波长为365nm；和/或者通过荧光分光光度仪检测荧光强度，对内毒素进行定量检测，荧光分光光度仪中使用的激发波长为400～450nm，采集500～700nm区间的荧光。
实施本发明获得的荧光探针及其制备方法、应用和检测内毒素方法，具有以下有益效果：
(1)由于本发明用于检测LPS(内毒素)分子的原理是基于该探针的AIE特性和去碘离子淬灭效应，以及荧光探针TPE-Be-I具有很大的Stokes位移，极大地降低了激发光对检测结果的影响，基于上述原理，本发明的检测过程中不易受到其它外界因素的影响，具有较高的特异性；
(2)与现有的检测方法和技术相比，本发明的技术方法操作简便，操作人员无需行特别的专业学习与培训，掌握基本操作流程即可进行；检测所需时间缩短，检测过程中无特殊生物或化学反应耗时，荧光探针于检测样本液体中溶解均匀即可检测，迅速得出结果；检测结果精确，可定性，也可定量；该检测方法所需TPE探针量极少，且其价格低廉，其余检测设备为实验室常规设施，不会构成过多成本；
(3)本发明可定性检测LPS待测溶液(如临床用葡萄糖注射液)是否为LPS污染，抑或定量检测LPS在该类液体中的浓度；
(4)本发明用于检测LPS待测溶液(如临床用葡萄糖注射液)中的LPS，具有快速、简便的特点。即混合后在手提式UV灯激发下即可初步判断该类液体是否被LPS污染。
附图说明
图1为荧光探针的合成路线；
图2为荧光探针的光学特性图；
图3A为高浓度时荧光探针检测HEPES液中内毒素的荧光强度变化曲线图；
图3B为高浓度时荧光探针检测HEPES液中内毒素在365nm的紫外灯照射下所拍摄照片；
图3C为高浓度时荧光探针检测HEPES液中内毒素的线性拟合图；
图4A为在不含LPS的DMSO/HEPES混合液中检测TPE-Be-I直径的动态光散射检测图；
图4B为在含LPS的DMSO/HEPES混合液中的TPE-Be-I/LPS聚合物直径的动态光散射检测图；
图5A为低浓度时荧光探针检测HEPES液中内毒素的荧光强度变化曲线图；
图5B为低浓度时荧光探针检测HEPES液中内毒素的线性拟合图；
图6为TPE-Be-I对不同临床用注射液进行荧光检测结果图；
图7A为内毒素类似结构Glycol-CS的化学结构式；
图7B为荧光探针分别与内毒素和内毒素类似结构分子Glycol-CS作用的荧光强度对比图；
图7C为荧光探针分别与内毒素和内毒素类似结构分子Glycol-CS作用后在波长为365nm紫外灯照射下所拍摄照片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明荧光探针及其制备方法、应用和检测内毒素方法的具体实现作进一步说明：
本发明的目的是针对现有检测内毒素技术的不足，提供一种基于聚集诱导发光原理的荧光探针及其制备方法，利用该荧光探针的AIE特性和去碘离子荧光淬灭效应来快速、直观地定性或定量检测内毒素的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的一种基于聚集诱导发光原理的荧光探针，该荧光探针命名为：TPE-Be-I，其分子式为C37H30INS，其结构式为：
荧光探针的制备方法如图1所示，包括以下步骤：
1)将TPE-Br溶于四氢呋喃溶剂中，将其置于-88℃～-68℃，缓慢向反应瓶中滴加丁基锂；滴加完毕后，保持反应液在-88℃～-68℃反应2小时～4小时后，将哌啶缓慢加入上述反应液中形成混合物；之后回到室温继续反应1小时～3小时；反应完毕后，混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，最后将有机溶剂蒸干；以正己烷和二氯甲烷作为洗脱剂通过柱层析分离得到产物4-(1,2,2-三苯基乙烯)-苯甲醛(缩写为TPE-CHO)。上述用二氯甲烷进行萃取的次数可以根据需要而定，可以萃取一次，也可以萃取多次，优选萃取三次，这样可以基本将需要的萃取物萃取完全的同时不会浪费二氯甲烷，避免造成浪费和污染，节省成本。
2)将苯并噻唑和碘乙烷溶于乙腈中，将其回流反应20小时～28小时；反应完毕后，将沉淀物过滤，并用乙腈洗涤沉淀物，得到目标产物3-乙基-2-甲基-苯并噻唑碘盐(缩写为Be-I)。其中用乙腈洗涤时，优选使用少量乙腈洗涤，避免浪费；洗涤的次数根据需要而定，可以一次，也可以多次，优选为三次，同样可以基本将沉淀物上的杂质、其它残留溶剂洗涤干净的同时不会浪费乙腈，避免造成浪费和污染，节省成本。
3)将TPE-CHO和Be-I溶于干燥的乙醇中，氮气保护下回流反应40小时～60小时；反应完毕后，将有机溶剂蒸干，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂通过柱层析分离得到产物荧光探针(命名为TPE-Be-I)。
本发明还提供了一种荧光探针(TPE-Be-I)在检测内毒素(LPS)中的应用及具体的检测方法，该荧光探针(TPE-Be-I)具有很大的Stokes位移，极大地降低了激发光对检测结果的影响，最大程度地增加检测内毒素(LPS)的效果。
优选地，上述荧光探针(TPE-Be-I)用于定性或者定量检测临床用葡萄糖注射液、HEPES缓冲液、超纯水，或者其它不含有能置换荧光探针中碘离子的成分的液体中的LPS成分，均在本发明的保护范围之内。
优选地，上述荧光探针(TPE-Be-I)定性检测临床用葡萄糖注射液中的是否被LPS污染。
优选地，上述荧光探针(TPE-Be-I)定量检测临床用葡萄糖注射液中的LPS浓度，首先利用荧光探针(TPE-Be-I)绘制标准曲线，根据标准曲线确定LPS的浓度。
其中，所述的定量检测采用荧光分光光度仪，定性检测采用荧光分光光度仪或者在高浓度时可用肉眼观察鉴别。
上述荧光探针(TPE-Be-I)检测LPS的方法，包括以下步骤：
1)将荧光探针(TPE-Be-I)溶入DMSO溶液中，制备得到荧光探针(TPE-Be-I)摩尔浓度为1mmol/L～2mmol/L的储存液；
2)吸取1μL的步骤1)中的储存液加入99μL的内毒素待测溶液中，混合均匀得到100μL、pH值为6～7.5的检测反应体系：
在检测反应体系中，荧光探针(TPE-Be-I)的摩尔浓度为 其中荧光探针(TPE-Be-I)的摩尔浓度选定是由LPS的浓度确定。
3)在手提式UV灯激发下观察荧光或者荧光分光光度仪检测荧光强度，其中，手提式UV灯激发波长为365nm；荧光分光光度仪中使用的激发波长为400～450nm，采集500～700nm区间的荧光。
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1：
荧光探针TPE-Be-I的制备，步骤如下：
1)TPE-CHO的合成：将5mmol的TPE-Br溶于50毫升四氢呋喃溶剂中，将其置于-78℃，缓慢向反应瓶中滴加6mmol的丁基锂(1.6mol/L，3.8毫升)；滴加完毕后，保持反应液在-78℃反应3小时后，将10mmol的哌啶缓慢加入上述反应液中形成混合物；之后回到室温继续反应2个小时，反应完毕后，混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，最后将有机溶剂蒸干；以正己烷和二氯甲烷作为洗脱剂，通过柱层析分离得到产物TPE-CHO，其核磁共振谱如下：1HNMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):9.90(s,1H),7.61(d,J＝8.2Hz,2H),7.19(d,J＝8.2Hz,2H),7.11(m,9H),7.02(m,6H).13CNMR(100MHz,CDCl3),δ(ppm):191.2,149.9,142.4,142.3,142.2,139.1,133.6,131.3,130.7,130.6,128.5,127.3,127.1,126.4,126.2,126.1.HRMS(MALDI-TOF):m/z360.1520[M+,calcd360.1514]；
2)Be-I的合成：将7mmol的苯并噻唑和14mmol的碘乙烷溶于20毫升乙腈中，将其回流24小时；反应完毕后，将沉淀物过滤，并用少量乙腈洗涤沉淀物三次，得到目标产物Be-I，其核磁共振谱如下：1HNMR(400MHz,CD3OD),δ(TMS,ppm):8.33(d,J＝7.8Hz,2H),8.30(d,J＝8.4Hz,2H),7.92(dd,J1＝7.8Hz,J2＝8.4Hz,2H),7.81(dd,J1＝7.8Hz,J2＝8.4Hz,2H),4.85(q,J＝7.5Hz,4H),3.27(s,3H),1.60(t,6H,J＝7.5Hz,6H).HRMS(MALDI-TOF):m/z178.0660[(M–I)+,calcd178.0690]；
3)TPE-Be-I的合成：将0.55mmol的TPE-CHO和0.55mmol的Be-I溶于15毫升干燥的乙醇中，氮气保护下回流48小时。反应完毕后，将有机溶剂蒸干，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，通过柱层析分离得到产物TPE-Be-I，其核磁共振谱如下：1HNMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):8.42(d,J＝7.2Hz,1H),8.28(d,J＝8.8Hz,1H),8.12(d,J＝15.6Hz,1H),7.93(d,J＝16.0Hz1H),7.76-7.89(m,4H),7.11-7.19(m,11H),6.97-7.04(m,6H),4.92(q,2H),1.43(t,J＝7.2Hz,3H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm):171.4,148.4,147.5,142.6,142.4,142.0,140.8,139.6,131.3,130.6,130.5,130.4,129.5,129.3,128.2,127.8,127.7,126.9,126.7,124.3,116.5,112.9,44.4,14.0.HRMS(MALDI-TOF):m/z520.2103[(M–I)+,calcd520.2099]。
TPE-Be-I为典型AIE特性分子四苯基乙烯(TPE)衍生物，具有AIE活性并含有可淬灭荧光的碘离子，该荧光探针需先于检测分子作用去掉碘离子，然后形成聚集体，才能发出强荧光。
实施例2：
荧光探针TPE-Be-I的制备，步骤如下：
1)TPE-CHO的合成：将2.5mmol的TPE-Br溶于50毫升四氢呋喃溶剂中，将其置于-68℃，缓慢向反应瓶中滴加3mmol的丁基锂(1.6mol/L，1.9毫升)；滴加完毕后，保持反应液在-68℃反应2小时后，将5mmol的哌啶缓慢加入上述反应液中形成混合物；之后回到室温继续反应1个小时，反应完毕后，混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取一次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，最后将有机溶剂蒸干；以正己烷和二氯甲烷作为洗脱剂，通过柱层析分离得到产物TPE-CHO；
2)Be-I的合成：将5mmol的苯并噻唑和10mmol的碘乙烷溶于20毫升乙腈中，将其回流20小时；反应完毕后，将沉淀物过滤，并用少量乙腈洗涤沉淀物四次，得到目标产物Be-I；
3)TPE-Be-I的合成：将0.45mmol的TPE-CHO和0.45mmol的Be-I溶于15毫升干燥的乙醇中，氮气保护下回流40小时。反应完毕后，将有机溶剂蒸干，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，通过柱层析分离得到产物TPE-Be-I。
实施例3：
荧光探针TPE-Be-I的制备，步骤如下：
1)TPE-CHO的合成：将7mmol的TPE-Br溶于50毫升四氢呋喃溶剂中，将其置于-88℃，缓慢向反应瓶中滴加8.4mmol的丁基锂(1.6mol/L，5.25毫升)；滴加完毕后，保持反应液在-88℃反应4小时后，将14mmol的哌啶缓慢加入上述反应液中形成混合物；之后回到室温继续反应3个小时，反应完毕后，混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取一次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，最后将有机溶剂蒸干；以正己烷和二氯甲烷作为洗脱剂，通过柱层析分离得到产物TPE-CHO；
2)Be-I的合成：将8mmol的苯并噻唑和16mmol的碘乙烷溶于20毫升乙腈中，将其回流28小时；反应完毕后，将沉淀物过滤，并用少量乙腈洗涤沉淀物五次，得到目标产物Be-I；
3)TPE-Be-I的合成：将0.6mmol的TPE-CHO和0.6mmol的Be-I溶于15毫升干燥的乙醇中，氮气保护下回流60小时。反应完毕后，将有机溶剂蒸干，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，通过柱层析分离得到产物TPE-Be-I。
实施例4：
较高浓度LPS的检测：将TPE-Be-I先溶于DMSO制备2mmol/L的储备液，将LPS溶于浓度为10mmol/L的HEPES缓冲液(pH＝7.0)中得到含不同浓度LPS的九份待测溶液，分别吸取九份1μL的储存液与上述九份99μL的待测溶液相混合得到九组体积为100μL的检测反应体系，使得TPE-Be-I浓度为20μmol/L，LPS浓度分别为0、2、5、10、20、40、60、80和100μg/mL。
如图2所示，在得到的检测反应体系中TPE-Be-I(实线)与TPE-Be-I/LPS混合物(虚线)的紫外吸收光谱和荧光强度。TPE-Be-I浓度为20μmol/L，LPS浓度20μg/mL，HEPES浓度为10mmol/L，激发波长为420nm，表明该探针的Stokes位移为165nm，提示有利于降低检测过程中激发光的干扰。
如图3A所示为TPE-Be-I溶于含不同浓度LPS的HEPES缓冲液(pH＝7.0)中的荧光强度，激发波长为420nm。图3B为含有TPE-Be-I或LPS的HEPES液在波长为365nm的紫外灯照射下所拍摄照片。图3C为检测高浓度LPS时荧光强度和LPS浓度的线性关系。
TPE-Be-I浓度为20μmol/L，HEPES浓度为10mmol/L。随LPS浓度的升高，荧光强度亦升高；当LPS浓度升高至80μg/mL与100μg/mL时，两者的荧光强度相近，表明此时TPE-Be-I的结合位点与LPS结合已达饱和状态。此外，肉眼观察所见荧光强度与曲线具有相同的变化规律。
图4A显示了在不含LPS的DMSO/HEPES混合液中TPE-Be-I的直径；图4B显示了含LPS的DMSO/HEPES混合液中的TPE-Be-I/LPS聚合物的直径。TPE-Be-I浓度为20μmol/L，LPS浓度为20μg/mL，HEPES浓度为10mM。表明该荧光探针在与LPS中的磷酸根发生作用后，重组形成粒径更大的纳米颗粒，从而发出强荧光。
实施例5：
较低浓度LPS的检测：将TPE-Be-I先溶于DMSO制备1mmol/L的储备液，将LPS溶于浓度为10mmol/L的HEPES缓冲液(pH＝7.0)中得到含不同浓度LPS的六份待测溶液，分别吸取六份1μL的储存液与上述六份99μL的待测溶液相混合得到六组体积为100μL的检测反应体系，使得TPE-Be-I浓度为10μmol/L，LPS浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、1.5和2.0μg/mL。
如图5A显示了TPE-Be-I溶于含低浓度LPS的HEPES缓冲液(pH＝7.0)中的荧光强度。TPE-Be-I浓度为10μmol/L，HEPES浓度为10mmol/L，激发波长为420nm。随着LPS浓度的增加，荧光强度逐渐增强。
图5B为检测低浓度LPS时荧光强度和LPS浓度的线性关系，图5A和图5B表明：该检测方法可用于LPS的定量检测。
实施例6：
超纯水中LPS的检测：将TPE-Be-I先溶于DMSO制备1.5mmol/L的储备液，取超纯水99μL，加入1μL含有TPE-Be-I的DMSO，混匀后采用荧光分光光度仪检测荧光强度，激发波长为400nm，或者用激发波长为365nm的手提式UV灯激发肉眼观察荧光强弱。
实施例7：
超纯水中LPS的检测：将TPE-Be-I先溶于DMSO制备1.5mmol/L的储备液，取超纯水99μL，加入1μL含有TPE-Be-I的DMSO，混匀后采用荧光分光光度仪检测荧光强度，激发波长为450nm，或者用激发波长为365nm的手提式UV灯激发肉眼观察荧光强弱。
实施例8：
临床用注射液中LPS的检测：取含有或不含有LPS的临床用注射液99μL，加入1μL含有TPE-Be-I的DMSO，混匀后采用荧光分光光度仪检测荧光强度，并用手提式UV灯激发肉眼区分对比混合液的荧光。其中临床用注射液包括5％葡萄糖注射液(5％GI)、10％葡萄糖注射液(10％GI)、生理盐水(SCl)和Ringer’液(RS)。
图6显示了用浓度为20μmol/L的TPE-Be-I检测含20μg/mL的LPS(+)以及不含LPS(-)的各医疗注射液时的荧光强度，表明该荧光探针可用于临床用葡萄糖注射液中LPS的检测，生理盐水和Ringer’液中的Cl－会影响探针中I－，因此证实该荧光探针是适用于定性或者定量检测临床用葡萄糖注射液、前述实施例的HEPES缓冲液、超纯水，以及其他不含有能置换探针中碘离子的成分的等液体中的LPS成分。
特异性实验：
图7A为Glycol-CS的化学结构式。图7B中，实线代表浓度为20μmol/L的TPE-Be-I溶于含LPS的HEPES(10mmol/L)缓冲液(pH＝7.0)中的荧光强度，虚线代表浓度为20μmol/LTPE溶于含Glycol-CS(20μg/mL)的HEPES(10mmol/L)缓冲液(pH＝7.0)中的荧光强度，激发波长为420nm。图7C为TPE-Be-I/LPS混合液以及TPE-Be-I/Glycol-CS混合液在波长为365nm紫外灯照射下所拍摄照片。图7A-7C表明，该荧光探针能选择性作用于LPS，而不能和类似结构的Glycol-CS发生反应，具有检测特异性。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于聚集诱导发光原理的荧光探针，其特征在于，荧光探针3-乙基-2-(4-1,2,2-三苯基乙烯)烯基-苯并噻唑碘盐(TPE-Be-I)的分子式为C37H30INS，结构式为：
。
2.一种权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
A、4-(1,2,2-三苯基乙烯)-苯甲醛(TPE-CHO)的合成：将1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯基乙烯(TPE-Br)溶于四氢呋喃溶剂中并置于-88℃～-68℃温度条件下，缓慢向反应瓶中滴加丁基锂；滴加完毕后，在-88℃～-68℃温度条件下反应，反应后将哌啶缓慢加入反应液中形成混合物，之后回到室温继续反应；反应完毕后，混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，最后将有机溶剂蒸干，以正己烷和二氯甲烷作为洗脱剂通过柱层析分离得到产物4-(1,2,2-三苯基乙烯)-苯甲醛(TPE-CHO)；
B、3-乙基-2-甲基-苯并噻唑碘盐(Be-I)的合成：将苯并噻唑和碘乙烷溶于乙腈中进行回流反应；反应完毕后，将沉淀物过滤，并用乙腈洗涤沉淀物，得到产物3-乙基-2-甲基-苯并噻唑碘盐(Be-I)；
C、荧光探针(TPE-Be-I)的合成：将TPE-CHO和Be-I溶于干燥的乙醇中，氮气保护下进行回流反应；反应完毕后，将有机溶剂蒸干，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂通过柱层析分离得到产物荧光探针(TPE-Be-I)。
3.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤A中，在-88℃～-68℃温度条件下反应2小时～4小时；在常温下反应1小时～3小时；在步骤B中，回流反应时间为20小时～28小时；在步骤C中，在氮气保护下进行回流反应时间为40小时～60小时。
4.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤A中，所述1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯基乙烯(TPE-Br)与丁基锂的摩尔比为5：6；所述1-(4-溴苯基)-1,2,2-三苯基乙烯(TPE-Br)与哌啶的摩尔比为1：2；所述TPE-Br在四氢呋喃溶剂中的摩尔浓度为0.05mol/L～0.14mol/L。
5.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤B中，所述苯并噻唑与碘乙烷的摩尔比为1：2，其中所述苯并噻唑在所述乙腈中的摩尔浓度为0.25mol/L～0.4mol/L。
6.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤C中，步骤A中得到的产物得到产物4-(1,2,2-三苯基乙烯)-苯甲醛(TPE-CHO)与步骤B中得到的产物3-乙基-2-甲基-苯并噻唑碘盐(Be-I)之间的摩尔比为1：1，其中步骤A中得到的产物得到产物4-(1,2,2-三苯基乙烯)-苯甲醛(TPE-CHO)与步骤B中得到的产物3-乙基-2-甲基-苯并噻唑碘盐(Be-I)在所述乙醇中的摩尔浓度分别为0.03mol/L～0.04mol/L。
7.一种权利要求1所述的荧光探针在检测内毒素中的应用。
8.一种利用权利要求1所述的荧光探针检测内毒素的方法，其特征在于，包括下述步骤：
S1、将荧光探针(TPE-Be-I)溶入DMSO溶液中，制备储存液；
S2、分别吸取储存液与待测溶液进行混合，混合均匀得到检测反应体系；
S3、对检测反应体系的荧光进行分析检测。
9.根据权利要求8所述的荧光探针检测内毒素的方法，其特征在于，在步骤S1中，储存液中荧光探针(TPE-Be-I)的摩尔浓度为1mmol/L～2mmol/L；
在步骤S2中，所述待测溶液为临床用葡萄糖注射液、HEPES缓冲液、超纯水或其他不含有能置换探针中碘离子的成分的液体，吸取1μL的储存液与99μL的待测溶液混合，混合均匀后得到100μL的检测反应体系(pH＝6～7.5)。
10.根据权利要求8所述的荧光探针检测内毒素的方法，其特征在于，在步骤S3中，在UV灯激发下观察荧光对内毒素进行定性检测，UV灯激发波长为365nm；和/或者通过荧光分光光度仪检测荧光强度，对内毒素进行定量检测，荧光分光光度仪中使用的激发波长为400～450nm，采集500～700nm区间的荧光。
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