CN105616037A - 一种人造血管的制备方法及其装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人造血管的制备方法及其装置,属于组织工程技术领域。该方法首先将取自病患的血管种子细胞进行多次传代培养以达到数量要求;然后将该细胞悬浮液与含有离子浓度敏感性材料海藻酸钠、促进细胞黏附生长生物可降解材料按特定质量比混合;最后将上述含有血管细胞、海藻酸钠、促进细胞黏附生长的生物可降解材料等的混合溶液通过自制装置在0.5%的CaCl2溶液中挤压成形,并得到具有一定形态和力学性能的人造血管单元雏形。
Description
技术领域
本发明涉及一种人造血管的制备方法及其装置,属于组织工程技术领域。
背景技术
众所周知,心血管疾病已成为威胁人类健康的主要因素。并随着发病率的提高以及心血管外科的发展,对各种口径血管移植替代物的需求也与日俱增。目前常用的人工高分子生物材料管道(涤纶,膨体聚四氟乙烯),在临床大口径血管移植中有较为可靠的效果,远期通畅率较为肯定。但对于内径小于6mm的小口径血管,由于血管内高张力,低血流的状态,6个月栓塞率高达40%。自体血管虽然疗效较为理想,但来源不足问题又严重制约其应用。
组织工程学的出现和发展,为解决心血管移植物的不足问题提供了新的解决思路。组织工程学的具体实施方法是:将直接获得的或培养获得的功能相关种子细胞接种于天然的或人工合成的生物材料上,体外培养后回植体内,构建出具有功能的新组织。
中国发明专利(申请号:201310016226.6)本发明公开了一种用于体内器官替换的人工器官软体支架的制备方法。该方法首先对病患个体器官进行CT或MRI扫描,获取一组从下至上共N层关于该器官、组织部位的断层图像,并将所得模型数据导入生物成型机;然后取用病患个体的器官组织细胞进行培养,从而获取含有特定细胞密度的组织细胞悬浮液,并将培养所得的具有特定细胞密度的组织细胞悬浮液与水凝胶按一定体积比均匀混合;最后通过自制生物成型机打印组织细胞悬浮液与凝胶的混合物,从而实现器官软体支架的制备。但是并没有涉及到内部血管体系的制备。
中国发明专利(申请号:200410009787.4)公开了“一种细胞-材料单元的三维受控堆积方法”,该方法将离子浓度敏感材料和多种促进细胞粘附生长的生物可降解材料制成水溶液,灭菌;然后选定一种或多种细胞,分别与灭菌的溶液混合,制成细胞-材料溶液的混合物,并根据预先设计的结构和路径,将各种细胞-材料溶液的混合物分别通过不同的喷头挤压或喷射出来,形成一定形态和强度的细胞-材料凝胶;通过逐点逐层的堆积,得到具有一定结构的组织器官雏形。该方法同样对于三维软体组织的制备具有一定的指导意义,但是对于血管类薄壁器官组织的制备并不适用,原因是此方法不能够保证薄壁类器官的成型。
发明内容
为了克服现有技术人工血管不能很好的满足临床的实践需求,同时有效地解决血管类薄壁器官来源有限性,本发明提出了一种人造血管的制备方法及装置,该方法克服了已有技术的不足,降低了成型的费用,提高了制备效率,最小可以制备内径大小为2~3mm的血管。此外,该方法简易可行,在自制装置的基础上,基于材料在挤压、喷射之后的溶胶-凝胶转变,实现含有细胞凝胶的挤压成型。其中挤压成型之前,细胞生存在细胞溶液环境中,而成型后细胞生存在含有大量水分的水凝胶环境中,从而保证了细胞进行增值分化所需的空间结构,同时成型后的结构又具有一定的力学性能。
本发明提出的:一种人造血管的制备方法,包括如下步骤:
步骤1、将一种离子浓度敏感材料海藻酸钠和促进细胞增殖分化的生长因子,以细胞培养液或其它细胞营养液为溶剂来制备成含有敏感溶液,浓度为50~120g/L,其中的离子浓度敏感材料与促进细胞黏附生长的生物可降解材料的质量比为1:0.5~5,将所制备的溶液进行灭菌,以备后用;
步骤2、从病患身上直接或间接获得的血管种子细胞进行增值分化培养,细胞培养液为高糖DMEM培养液,其中每100ml培养液中添加有10ml胎牛血清、29.2mg谷氨酰胺和10mg青霉素/链霉素,经过多次传代已达到需求数量,使用前用胰酶消化后,提取血管细胞,并加入一定量的细胞生长因子,从而制备出含有生长因子的血管细胞悬浮液;
步骤3、称取一定量的无水CaCl2,并将其配置成质量分数为0.5%的CaCl2溶液,并进行灭菌处理,以备后用;
步骤4、将步骤2所得血管细胞悬浮液和步骤1灭菌后的溶液混合均匀,制备成含有细胞的材料溶液,根据预先设计的结构和定义规划的路径,在计算机控制下,通过自制血管成型装置将上述含有细胞材料溶液挤压或喷射出来;此处,自制血管成型装置必须与步骤3所制备的CaCl2液接触,以保证含有细胞的离子敏感材料一挤压出来就与CaCl2溶液接触,从而在有触发离子存在的条件下,迅速发生溶胶-凝胶的转变,最终得到具有一定形态和力学性能的人造血管单元雏形;
步骤5、待挤压完成后,继续在CaCl2溶液中浸泡1~5Min,而后具有一定形态和力学性能的人造血管单元雏形取出,并用细胞培养液冲洗2~5次;
步骤6、将步骤5冲洗处理后的人造血管置于生物反应器后,连接到体外动态灌流系统平台中,加入预热的培养液后进行动态培养。
本发明所述的离子浓度敏感材料为海藻酸钠,触发离子为Ca---------- 2+,所述的促进细胞粘附生长的生物可降解材料可以是蛋白质、多糖、糖蛋白、蛋白多糖、氨基酸或生长因子中的一种或几种。
本发明具有以下优点及突出性效果:
1)本发明所采用的人工血管制备方法简易,降低了成型的费用,提高了制备效率,同时,自制血管挤压装置可以根据临床对血管内径要求进行设计,并可以实现按需制备,且制作成低廉;
2)本发明所采利用的工艺方法可以对活体血管细胞进行装配挤压成型而不对细胞活性不产生影响。成型后的凝胶材料具有一定的孔隙结构,可以为细胞的增值分化和营养物质的输送提供空间,从而确保了细胞存活培养的基本条件;通过这些生物活体细胞的装配成型,将工程制造的对象扩大到了活体器官的领域,是对传统生物工程制造的概念的一大突破,对生物活体器官的制备具有重大意义;
3)本发明利用了离子敏感材料为细胞载体,对细胞无污染,且操作工艺易于执行,大大降低了人工血管制备的难度,有望为临床上对血管的需求提供一套全新的方案。
附图说明
图1自制人工血管设备的结构示意图
具体实施实例
图1为实现本发明工艺方法的设备结构示意图。将含有血管细胞的材料溶液输入挤压喷射成型设备中,其结构示意图如图1所示。整个装置包括以下部件:
圆柱管1的下端管口较上端管口收缩,设置在管内且与该管同心的芯轴3,所述的芯轴3通过定位板2与管1相连,定位板2上设有通孔8个,且芯轴的一端从管底的中心孔伸出,4为流体材料的储液腔,管的上方设有流体材料和气压的加入口5。圆柱管1下端管口与芯轴3的直径大小可跟据所制备的血管内外径来设计,即通过调节圆柱管1下端与芯轴3的间隙来控制血管壁的厚度,而芯轴的直径决定了血管的内径大小;同时圆柱管1与芯轴3选择与溶液不浸润的材料或进行表面处理,迫使材料很容易沿芯轴留下。流体材料从管1的上方入口5进入管内,具有一定压力的气体也可通过加入口5进入管内,推动流体材料沿芯轴均匀流下,根据溶液的粘稠度不同,气体压力一般在0.5MPa~5MPa之间。最终所挤压出来的材料溶液在CaCl2溶液下形成具有一定孔径的人工血管雏形。
本实施例中采用自制人工血管成型装置来制备人工血管,本实例中自制血管成型装置圆柱管1的内径为5mm,芯轴3的外径为3.5mm。其具体包括以下步骤:
步骤1、离子浓度敏感性的海藻酸钠和促进细胞粘附生长的明胶均匀混合,以细胞培养液或其它细胞营养液为溶剂来制备成溶液,浓度为120mg/ml,其中的海藻酸钠与明胶的质量比为1:5,将所制备的溶液进行灭菌,以备后用;
步骤2、从病患身上直接或间接获得的血管种子细胞进行增值分化培养,细胞培养液为高糖DMEM培养液,其中每100ml培养液中添加有10ml胎牛血清、29.2mg谷氨酰胺和10mg青霉素/链霉素,经过多次传代已达到需求数量,使用前用胰酶消化后,提取血管细胞,并加入一定量的细胞生长因子,从而制备出含有生长因子的血管细胞悬浮液,细胞密度为7×109细胞/ml;
步骤3、称取一定量的无水CaCl2,并将其配置成质量分数为0.5%的CaCl2溶液200ml,并进行灭菌处理,以备后用;
步骤4、将步骤2所得血管细胞悬浮液和步骤1灭菌后的溶液混合均匀,制备成含有血管细胞的材料溶液,其中,血管细胞悬浮液与步骤1灭菌后的溶液按体积比1:2;根据预先设计的结构和定义规划的路径,在计算机控制下,通过自制血管成型装置将上述含有细胞材料溶液挤压或喷射出来;此处,自制血管成型装置必须与步骤3所制备的CaCl2液接触,以保证含有细胞的离子敏感材料一挤压出来就与CaCl2溶液接触,从而在有触发离子存在的条件下,迅速发生溶胶-凝胶的转变,最终得到具有一定形态和力学性能的人造血管单元雏形;
步骤5、待挤压完成后,继续在CaCl2溶液中浸泡2Min,而后具有一定形态和力学性能的人造血管单元雏形取出,并用细胞培养液冲洗3次,最终,获得人工血管雏形的外径为4.3mm,内径为3.2mm;
步骤6、将步骤5冲洗处理后的人造血管置于生物反应器后,连接到体外动态灌流系统平台中,加入预热的培养液后进行动态培养。
Claims (5)
1.一种人造血管的制备方法及其装置,装置及其工作方式如下:圆柱管1的下端管口较上端管口收缩,设置在管内且与该管同心的芯轴3,所述的芯轴3通过定位板2与管1相连,定位板2上设有通孔8个,且芯轴的一端从管底的中心孔伸出,4为流体材料的储液腔,管的上方设有流体材料和气压的加入口5。
2.圆柱管1下端管口与芯轴3的直径大小可跟据所制备的血管内外径来设计,即通过调节圆柱管1下端与芯轴3的间隙来控制血管壁的厚度,而芯轴的直径决定了血管的内径大小;同时圆柱管1与芯轴3选择与溶液不浸润的材料或进行表面处理,迫使材料很容易沿芯轴留下。
3.流体材料从管1的上方入口5进入管内,具有一定压力的气体也可通过加入口5进入管内,推动流体材料沿芯轴均匀流下,根据溶液的粘稠度不同,气体压力一般在0.5MPa~5MPa之间。
4.最终所挤压出来的材料溶液在CaCl2溶液下形成具有一定孔径的人工血管雏形。
5.具体制备步骤如下:
步骤1、将一种离子浓度敏感材料海藻酸钠和促进细胞增殖分化的生长因子,以细胞培养液或其它细胞营养液为溶剂来制备成含有敏感溶液,浓度为50~120g/L,其中的离子浓度敏感材料与促进细胞黏附生长的生物可降解材料的质量比为1:0.5~5,将所制备的溶液进行灭菌,以备后用;
步骤2、从病患身上直接或间接获得的血管种子细胞进行增值分化培养,细胞培养液为高糖DMEM培养液,其中每100ml培养液中添加有10ml胎牛血清、29.2mg谷氨酰胺和10mg青霉素/链霉素,经过多次传代已达到需求数量,使用前用胰酶消化后,提取血管细胞,并加入一定量的细胞生长因子,从而制备出含有生长因子的血管细胞悬浮液;
步骤3、称取一定量的无水CaCl2,并将其配置成质量分数为0.5%的CaCl2溶液,并进行灭菌处理,以备后用;
步骤4、将步骤2所得血管细胞悬浮液和步骤1灭菌后的溶液混合均匀,制备成含有细胞的材料溶液,根据预先设计的结构和定义规划的路径,在计算机控制下,通过自制血管成型装置将上述含有细胞材料溶液挤压或喷射出来;此处,自制血管成型装置必须与步骤3所制备的CaCl2液接触,以保证含有细胞的离子敏感材料一挤压出来就与CaCl2溶液接触,从而在有触发离子存在的条件下,迅速发生溶胶-凝胶的转变,最终得到具有一定形态和力学性能的人造血管单元雏形;
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CN201510425535.8A CN105616037A (zh) | 2015-07-20 | 2015-07-20 | 一种人造血管的制备方法及其装置 |
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CN109731139A (zh) * | 2018-11-28 | 2019-05-10 | 山东省科学院能源研究所 | 一种小口径人工血管及其制备方法 |
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- 2015-07-20 CN CN201510425535.8A patent/CN105616037A/zh active Pending
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