CN105611935A - 用于治疗或预防滑膜炎的抗炎植物营养素 - Google Patents

用于治疗或预防滑膜炎的抗炎植物营养素 Download PDF

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CN105611935A CN201480055101.7A CN201480055101A CN105611935A CN 105611935 A CN105611935 A CN 105611935A CN 201480055101 A CN201480055101 A CN 201480055101A CN 105611935 A CN105611935 A CN 105611935A
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F·门布雷兹
E·奥佛德卡万
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Abstract

本发明提供了用于治疗或预防滑膜炎的组合物。所述组合物包含治疗有效量的橄榄苦苷、芦丁、姜黄素中的至少一者，优选地至少包含橄榄苦苷。本发明还提供了用于治疗或预防滑膜炎的方法，所述方法包括施用这类组合物。所述组合物可另外包含槲皮素、羟基酪醇或维生素D中的一者或多者。

Description

用于治疗或预防滑膜炎的抗炎植物营养素
背景技术
本发明整体涉及用于治疗或预防滑膜炎的方法和组合物。更具体地讲，本发明涉及包含一种或多种抗炎植物营养素的组合物，并且还涉及包括施用此类组合物的方法。
滑膜关节位于关节骨相互接触的位置。骨与骨之间形成滑膜关节腔，该腔内衬有被称为滑膜的膜。滑膜炎是滑膜的炎症，这种病症通常让患者感到疼痛，特别是在关节发生移动的情况下。在滑膜炎中，通常由于滑液聚集而发生关节肿胀。
长久以来，骨关节炎(OA)一直被认为是导致软骨丧失的“磨损”疾病。以前认为，任何使某一具体关节上压力增大或软骨基质变脆弱的过程才会引起骨关节炎。然而，许多可溶性介质(例如，细胞因子或前列腺素)能够促进软骨细胞产生基质金属蛋白酶，这一发现开启了“炎症”理论。至今，滑膜炎被公认是骨关节炎的关键特征，而一些研究正试图证明滑膜炎是骨关节炎过程的驱动因素。
最近的实验数据表明，软骨下骨作为机械减震器以及与骨关节炎疼痛过程和与深层软骨的退化相关的炎症介质来源，在骨关节炎过程中可能具有重要作用。因此，由于软骨、骨骼和滑膜所释放的炎症介质，最初被认为由软骨主导的骨关节炎变得更加复杂。在支持骨关节炎的炎症理论的最新争论中，有人提出了由代谢综合征引起的低级炎症理论、先天免疫理论和炎性衰老理论。
尽管罹患骨关节炎的个体越来越多，但目前仍没有治愈该疾病的方法。目前的药物治疗只能减轻症状，注重使用镇痛剂(对乙酰氨基酚)和非甾体抗炎药(NSAID)来缓解例如疼痛和炎症等症状。此外，用这些药物治疗通常伴随副作用，例如胃肠道风险或心血管风险，因此还需要不断的研究。
发明内容
治疗骨关节炎的理想解决方案是，在实现抗炎和止痛功效并保证安全的同时，利用分子来改善疾病进展。在缺乏改善骨关节炎疾病的药物(disease-modifyingOAdrugs,DMOAD)的情况下，可用营养物质替代药物来治疗和预防骨关节炎。因此，本发明提供减轻滑膜炎的营养解决方案，从而限制衰老期间软骨退化的进展。
因此，在一般实施例中，本发明提供了一种治疗滑膜炎的方法。该方法包括将包含治疗有效量的植物营养素的组合物施用于患有滑膜炎的个体，所述植物营养素选自橄榄苦苷、芦丁、姜黄素以及它们的组合。
在一个实施例中，滑膜炎与选自狼疮、痛风、关节炎以及它们的组合的病症相关。该病症可以是关节炎，所述关节炎选自类风湿性关节炎、骨关节炎、骨软骨炎、骨关节病以及它们的组合。
在一个实施例中，该植物营养素包含橄榄苦苷。
在一个实施例中，该组合物还包含另外的生物活性化合物，该生物活性化合物选自槲皮素、羟基酪醇、维生素D以及它们的组合。
在一个实施例中，该植物营养素从植物提取物中分离。
在另一个实施例中，提供了一种预防滑膜炎的方法。该方法包括将包含治疗有效量的植物营养素的组合物施用于有患滑膜炎风险的个体，该植物营养素选自橄榄苦苷、芦丁、姜黄素以及它们的组合。
在一个实施例中，所述个体选自衰老的人和老年人。
在一个实施例中，该植物营养素从植物提取物中分离。
在一个实施例中，该组合物还包含另外的生物活性化合物，该生物活性化合物选自槲皮素、羟基酪醇、维生素D以及它们的组合。
在一个实施例中，该组合物每天施用，持续至少一个月。
在另一个实施例中，提供了一种用于治疗或预防滑膜炎的组合物。该组合物包含治疗有效量的植物营养素，该植物营养素选自橄榄苦苷、芦丁、姜黄素以及它们的组合。
在一个实施例中，该组合物为营养组合物。
在一个实施例中，该营养组合物包含选自蛋白质、碳水化合物、脂肪以及它们的组合的组分。
在另一个实施例中，提供了一种治疗或预防滑膜炎继发的关节软骨退化的方法。该方法包括将包含治疗有效量的植物营养素的组合物施用于需要治疗或预防的个体，该植物营养素选自橄榄苦苷、芦丁、姜黄素以及它们的组合。
本发明的一个优点是治疗或预防滑膜炎。
本发明的另一个优点是使用抗炎营养物质治疗或预防滑膜炎。
本发明的另一个优点是以比镇痛剂和NSAID更安全的方式治疗或预防滑膜炎。
本发明的另一个优点是在无需使用镇痛剂或NSAID的情况下治疗或预防滑膜炎。
本发明的另一个优点是使用天然和/或营养化合物治疗或预防滑膜炎。
本发明的另一个优点是治疗或预防与狼疮、痛风或关节炎(例如，类风湿性关节炎或骨关节炎)相关的滑膜炎。
本发明的另一个优点是以副作用可耐受或无副作用的方式治疗或预防滑膜炎。
本发明的另一个优点是使用生理剂量的营养组合物治疗或预防滑膜炎。
本发明的另一个优点是限制衰老期间软骨退化的进展。
本发明的另一个优点是治疗或预防滑膜炎继发的关节软骨退化。
本发明的另一个优点是使用协同起效的抗炎植物营养素治疗或预防滑膜炎。
本发明的另一个优点是使用生理剂量的橄榄苦苷、芦丁或姜黄素中的至少一者并同时提供生理剂量的其他多酚如类黄酮及矿物质和维生素来治疗或预防滑膜炎。
本文描述了另外的特征和优点，并且根据以下具体实施方式和附图，这些特征和优点将显而易见。
附图说明
图1A示出了不存在IL1a时(模拟正常细胞状态)ADAMTS-5mRNA相对于GAPDH的表达。各条件与CTL-进行了统计比较。
图1B示出了存在IL1a时(模拟患病细胞状态)ADAMTS-5mRNA相对于GAPDH的表达。各条件与IL1a进行了统计比较，而IL1a与CTL-进行了比较(实验验证)。
图2A示出了不存在IL1a时(模拟正常细胞状态)COX-2mRNA相对于GAPDH的表达。各条件与CTL-进行了统计比较。
图2B示出了存在IL1a时(模拟患病细胞状态)COX-2mRNA相对于GAPDH的表达。各条件与IL1a进行了统计比较，而IL1a与CTL-进行了比较(实验验证)。
图3A示出了不存在IL1a时(模拟正常细胞状态)MMP-13mRNA相对于GAPDH的表达。各条件与CTL-进行了统计比较。
图3B示出了存在IL1a时(模拟患病细胞状态)MMP-13mRNA相对于GAPDH的表达。各条件与IL1a进行了统计比较，而IL1a与CTL-进行了比较(实验验证)。
图4示出了豚鼠膝盖的组织切片(苏木精、固绿和番红O染色)。图4A和图4B示出了A组(橄榄苦苷)的染色结果；图4C和图4D示出了C组(芦丁)的染色结果；图4E和图4F示出了D组(芦丁和姜黄素)的染色结果；图4G和图4H示出了B组(对照)的染色结果。
图5示出了每组的骨关节炎总评分。第4周的对照组＝基线；第35周的对照组；A＝橄榄苦苷组(在饮食中的含量为0.025％)；C＝芦丁组(在饮食中的含量为0.5％)；D＝芦丁(在饮食中的含量为0.5％)+姜黄素(在饮食中的含量为0.25％)。
图6A示出了血浆中炎症生物标志物PGE2的浓度。第4周的对照组＝基线；第35周的对照组；A＝橄榄苦苷组(在饮食中的含量为0.025％)；C＝芦丁组(在饮食中的含量为0.5％)；D＝芦丁(在饮食中的含量为0.5％)+姜黄素(在饮食中的含量为0.25％)。
图6B示出了对照组在第4周和第35周时血浆中PGE2水平与相应的骨关节炎评分之间的相关性。
图7示出了血浆中与胶原2的分解有关的生物标志物Coll2-1NO2随着时间推移的浓度。B＝对照组；A＝橄榄苦苷组(在饮食中的含量为0.025％)；C＝芦丁组(在饮食中的含量为0.5％)；D＝芦丁(在饮食中的含量为0.5％)+姜黄素(在饮食中的含量为0.25％)。
图8A示出了血浆中与胶原2的分解有关的生物标志物Coll2-1NO2的浓度。第4周的对照组＝基线；第35周的对照组；A＝橄榄苦苷组(在饮食中的含量为0.025％)；C＝芦丁组(在饮食中的含量为0.5％)；D＝芦丁(在饮食中的含量为0.5％)+姜黄素(在饮食中的含量为0.25％)。
图8B示出了对照组在第4周和第35周时血浆中生物标志物Coll2-1NO2的浓度与相应的骨关节炎评分之间的相关性。
图9示出了骨关节炎患者血浆中与软骨细胞的肥大作用有关的生物标志物Fibulin3-1的浓度。B＝对照组；A＝橄榄苦苷组(在饮食中的含量为0.025％)；C＝芦丁组(在饮食中的含量为0.5％)；D＝芦丁(在饮食中的含量为0.5％)+姜黄素(在饮食中的含量为0.25％)。
图10A示出了骨关节炎患者血浆中与软骨细胞的肥大作用有关的生物标志物Fibulin3-1的浓度。第4周的对照组＝基线；第35周的对照组；A＝橄榄苦苷组(在饮食中的含量为0.025％)；C＝芦丁组(在饮食中的含量为0.5％)；D＝芦丁(在饮食中的含量为0.5％)+姜黄素(在饮食中的含量为0.25％)。
图10B示出了对照组在第4周和第35周时血浆中生物标志物Fibulin3-1的浓度与相应的骨关节炎评分之间的相关性。
图11A示出了每组的滑膜总评分。第4周的对照组＝基线；第35周的对照组；A＝橄榄苦苷组(在饮食中的含量为0.025％)；C＝芦丁组(在饮食中的含量为0.5％)；D＝芦丁(在饮食中的含量为0.5％)+姜黄素(在饮食中的含量为0.25％)。
图11B示出了对照组在第4周和第35周时滑膜总评分与相应的骨关节炎评分之间的相关性。
图12A示出了每组的滑膜内衬细胞增生。第4周的对照组＝基线；第35周的对照组；A＝橄榄苦苷组(在饮食中的含量为0.025％)；C＝芦丁组(在饮食中的含量为0.5％)；D＝芦丁(在饮食中的含量为0.5％)+姜黄素(在饮食中的含量为0.25％)。
图12B示出了对照组在第4周和第35周时滑膜内衬细胞增生与相应的骨关节炎评分之间的相关性。
图13A示出了每组中血管周围淋巴细胞和单核细胞对滑膜的细胞浸润的程度。第4周的对照组＝基线；第35周的对照组；A＝橄榄苦苷组(在饮食中的含量为0.025％)；C＝芦丁组(在饮食中的含量为0.5％)；D＝芦丁(在饮食中的含量为0.5％)+姜黄素(在饮食中的含量为0.25％)。
图13B示出了对照组在第4周和第35周时滑膜细胞浸润与相应的骨关节炎评分之间的相关性。
图14示出了成骨细胞培养9天后的胶原合成情况，其中通过测定组合使用1,25(OH)2D3、OLP和HTy刺激细胞后，每毫克总蛋白中产生的胶原微克数来表示胶原合成量。
图15示出了培养9天后的碱性磷酸酶(ALP)活性，其中通过测定组合使用1,25(OH)2D3、OLP和HTy后，每毫克蛋白每小时产生的ALP微摩尔数来表示ALP活性。
图16示出了在存在1,25(OH)2D3的情况下，处理5、9、12或15天后，所培养的成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性。
图17A示出了在存在橄榄苦苷的情况下，处理5、9、12或15天后，所培养的成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性。
图17B示出了在存在1,25(OH)2D3和橄榄苦苷的情况下，处理5、9、12或15天后，所培养的成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性。
图18A示出了在存在羟基酪醇的情况下，处理5、9、12或15天后，所培养的成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性。
图18B示出了在存在1,25(OH)2D3和羟基酪醇的情况下，处理5、9、12或15天后，所培养的成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性。
图19A示出了在存在橄榄苦苷和羟基酪醇的情况下，处理5、9、12或15天后，所培养的成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性。
图19B示出了在存在1,25(OH)2D3、橄榄苦苷和羟基酪醇的情况下，处理5、9、12或15天后，所培养的成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性。
图20示出了橄榄苦苷的化学结构。
图21示出了芦丁的化学结构。
图22示出了姜黄素的化学结构。
具体实施方式
本文中表示的所有百分数均以组合物的总重量计，除非另有表示。提及pH时，其值对应于使用标准设备在25℃下测量的pH。如在本发明和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。如本文所用，“约”应理解为指代数值范围中的数字。此外，本文中的所有数值范围都应理解为包含该范围内的所有整数或分数。本文所公开的组合物可能不含本文未明确公开的任何要素。因此，使用术语“包含/包括”的实施例的公开内容包括“基本上由所引用的组分组成”的实施例和“由所引用的组分组成”的实施例的公开内容。本文所公开的任何实施例可与本文所公开的任何其他实施例组合。
“预防”包括降低滑膜炎的风险和/或严重程度。术语“治疗”和“缓解”既包括预防性或防止性治疗(预防和/或延缓目标病理学病症或病况的发展)，也包括治愈性、治疗性或疾病改善性治疗，包括治愈、延缓、减轻诊断的病理学病症或病况的症状和/或中断其进展的治疗性措施；和治疗存在染病风险或怀疑已染病的患者，以及治疗有病或已经诊断为罹患疾病或医学病症的患者。该术语不一定表示受试者被治疗直至完全恢复。术语“治疗”还指维持和/或促进未罹患疾病但可能易于发展不健康病症的个体的健康状况。术语“治疗”和“缓解”还旨在包括强化或以其他方式增强一种或多种主要的预防性或治疗性措施。术语“治疗”和“缓解”还旨在包括疾病或病症的膳食管理或用于预防或防止疾病或病症的膳食管理。治疗可与患者或医生相关。
如本文所用，“治疗有效量”是预防个体缺陷、治疗其疾病或医学病症的量，或更一般地说，是减轻个体症状、管理其疾病进展或向其提供营养、生理或医疗益处的量。当然，达到治疗效果所需的治疗有效量根据具体组合物、施用途径、受体的年龄和病症以及要治疗的具体病况或疾病将会有所不同。
“衰老”动物是指已超过其特定物种和/或物种内品种的平均寿命的50％的动物。如果动物的年龄超过其出生地平均预期寿命的三分之二，优选地超过其出生地平均预期寿命的四分之三，更最优选地超过其出生地平均预期寿命的五分之四，那么就认为该动物为“老年”。“老年人”是指实际年龄为65岁或更大的人。
“动物”包括但不限于哺乳动物，该哺乳动物包括但不限于啮齿动物、水生哺乳动物、家畜(例如，狗和猫)、农畜(例如，羊、猪、牛和马)以及人类。在使用“动物”、“哺乳动物”或其复数形式时，这些术语还适用于能够具有通过段落上下文表现出的或意欲表现出的作用的任何动物。如本文所用，术语“患者”应被理解为包括接受或意欲接受本文所定义的治疗的动物，尤其是哺乳动物，并且更尤其是人。虽然本文中常用术语“个体”和“患者”来指人，但本发明并非限制于此。因此，术语“个体”和“患者”是指患有可受益于治疗的医疗病症或具有所述医疗病症风险的任何动物、哺乳动物或人。
如本文所用，“食物产品”和“食物组合物”应被理解为包含任何数量的任选的附加成分，包括常规食品添加剂，例如一种或多种蛋白质、碳水化合物、脂肪、酸化剂、增稠剂、缓冲剂或用于pH调节的物质、螯合剂、着色剂、乳化剂、赋形剂、调味剂、矿物质、渗透剂、药学上可接受的载体、防腐剂、稳定剂、糖、甜味剂、质构剂和/或维生素。可以按任何合适的量添加所述任选成分。
“试剂盒”是指该试剂盒的多个组分在一个或多个容器中物理上相关联，或与一个或多个容器物理上相关联，而且被视作制造、分装、销售或使用的单元。容器包括但不限于袋、盒、纸盒、瓶、外包装、收缩包装、附连部件(例如，装订部件、粘附部件等)，任何类型、任何设计或任何材料的包装，或它们的组合。
“植物营养素”是存在于许多食物中的非营养性化合物。术语“植物营养素”是指由植物产生的并能赋予使用者一种或多种健康益处的任何化合物。
不希望受理论的束缚，本发明人相信炎症介质在骨关节炎过程的发生和发展中起关键作用。这类介质的来源将局部地来自关节细胞或系统地来自其他组织，例如释放到血流中并随后经由软骨下骨血管到达关节的脂肪组织。这些介质对软骨、骨骼和滑膜具有有害影响。例如，关节肿胀是骨关节炎的一个临床特征，该特征由发炎引起，出现该特征则表明存在由于滑膜增厚或渗出液引起的滑膜炎。
在这个背景下，本发明人评估了衰老动物骨关节炎模型(豚鼠)中抗氧化剂和抗炎营养物质对滑膜炎和软骨完整性的功效。姜黄素、芦丁和橄榄苦苷(以及后续代谢物)具有抗炎和抗氧化特性。本发明人评估了这些化合物对滑膜炎和后续的软骨退化的效用。姜黄素、芦丁和橄榄苦苷通过减少软骨退化和降低组织学骨关节炎评分来改善关节健康，而且橄榄苦苷施用组表现出滑膜改变(滑膜评分、内衬细胞增生和细胞浸润)显著降低。此外，橄榄苦苷明显地降低了血清中的PGE2水平，同时降低了Coll2-1NO2(一种与软骨中的氧化应激有关的生物标志物)水平。该数据表明，橄榄苦苷能够通过抗炎途径(PGE2)减轻滑膜炎(滑膜的炎症)。总之，橄榄苦苷和芦丁能显著延缓自发性发展骨关节炎的豚鼠中的骨关节炎病变的进展。此外，橄榄苦苷显著降低了PGE2和COLL2-1NO2的血清水平并减轻了滑膜炎，这表明橄榄苦苷具有强效的抗炎特性。此外，姜黄素(与芦丁)的协同效应已通过Fibulin-3.1(软骨细胞肥大的标志物)的血清水平得以证明。
因此，本发明提供的组合物包含治疗有效量的抗炎植物营养素，该植物营养素选自橄榄苦苷、芦丁、姜黄素以及它们的组合。在一个优选的实施例中，该组合物至少包含橄榄苦苷。图20至图22分别示出了橄榄苦苷、芦丁和姜黄素的化学结构。
在一个实施例中，通过将包含选自橄榄苦苷、芦丁、姜黄素以及它们的组合的抗炎植物营养素的组合物施用于有需要的个体来治疗或预防滑膜炎。例如，可将包含橄榄苦苷、芦丁、姜黄素中的至少一者的组合物施用于患有滑膜炎的个体，以治疗滑膜炎。滑膜炎可能与狼疮、痛风或关节炎(例如，类风湿性关节炎或骨关节炎)相关。在一个实施例中，该组合物每天至少施用一次，持续至少一个月，优选地持续至少两个月，更优选地持续至少三个月。
在一个实施例中，通过将包含橄榄苦苷、芦丁、姜黄素中的至少一者的组合物施用于衰老或年老个体(例如，老年人)来治疗或预防滑膜炎。但是，本发明不限于施用受体的具体年龄，该组合物可施用于任何年龄的个体。
该组合物可包含另外的多酚，例如羟基酪醇(橄榄苦苷的代谢物)和/或槲皮素(芦丁的代谢物)。该组合物可包含橄榄苦苷、芦丁、羟基酪醇、姜黄素和槲皮素每种组分各一定的量，所述量为每份组合物中0.01mg至约1g、优选地0.1mg至1g、甚至更优选地1mg至约1g。
橄榄苦苷、羟基酪醇、芦丁、姜黄素和/或槲皮素可来自于任何合适的来源，也可分离和/或化学合成。在一个优选的实施例中，橄榄苦苷、羟基酪醇、芦丁、姜黄素和/或槲皮素从植物来源中获得。例如，橄榄苦苷和羟基酪醇可从橄榄植物中获得，芦丁可从洋葱中获得，姜黄素可从姜科的姜黄植物中获得。
该组合物还可包含一种或多种另外的生物活性化合物，例如一种或多种选自抗氧化剂、抗炎化合物、糖胺聚糖、益生元、纤维、益生菌、脂肪酸、矿物质、痕量元素和维生素的化合物。“生物活性化合物”是任何有助于个体健康或对人体有超过满足基本营养需求的效果的化合物。所述一种或多种另外的生物活性化合物可来自于天然来源。因此，所述化合物可来自于植物、动物、鱼类、真菌、藻类或微生物发酵的提取物。矿物质被认为来自于天然来源。
在一个实施例中，该组合物包含一种或多种另外的抗炎化合物。在一个实施例中，治疗或预防滑膜炎的方法包括与包含治疗有效量的橄榄苦苷、芦丁、姜黄素中的至少一者的组合物相继或同时施用一种或多种另外的抗炎化合物。例如，所述一种或多种另外的抗炎化合物可在与包含治疗有效量的橄榄苦苷、芦丁、姜黄素中的至少一者的组合物相同的组合物中提供。作为另外一种选择，该一种或多种另外的抗炎化合物可与治疗有效量的橄榄苦苷、芦丁、姜黄素中的至少一者分开提供，例如以试剂盒或一系列相互关联产品提供。如果包含治疗有效量的橄榄苦苷、芦丁、姜黄素中的至少一者的组合物和该一种或多种另外的抗炎化合物以分开的组合物提供，那么这些组合物可在施用之前混合，或可同时或相继施用。
该一种或多种另外的抗炎化合物可以是任何具有抗炎效果的化合物。合适的另外的抗炎化合物的一个非限制性例子为ω-3多不饱和脂肪酸，该脂肪酸可(例如)从鱼类中提取。合适的另外的抗炎化合物的另一个非限制性例子为植物提取物，该植物提取物包含类黄酮、多酚、原花青苷(proanthocyanins)和/或脂质(例如，鳄梨大豆未皂化物和ω-3多不饱和脂肪酸)。植物提取物可来自于一种或多种选自以下的植物：魔鬼爪(Harpagophytumprocumbens)、迷迭香(Rosmarinusofficinalis)、牛膝草、生姜(Zingiberofficinale)、姜黄(Curcumalonga)、山金车(ArnicaMontana)、柳树皮、石榴(Punicagranatum)、绿茶(Camelliasinensis)、猫爪草(Uncariatometosa和Uncariaguianensis)、印度乳香(Bosweliaserrata)、菠萝蛋白酶(Ananascomosus)、黑种草(Nigellasativa)、圣约翰草、贯叶金丝桃素、白毛莨、德国洋甘菊(Matricariarecutita)以及它们的组合。
在一个实施例中，该组合物包含一种或多种另外的抗氧化剂。在一个实施例中，该组合物包含既可被表征为抗炎化合物又可被表征为抗氧化剂的另外的化合物。合适的抗氧化剂的非限制性例子为虾青素、类胡萝卜素、辅酶Q10(CoQ10)、类黄酮、谷胱甘肽、枸杞、橙皮苷、乳枸杞(lactowolfberry)、木脂体、叶黄素、番茄红素、多酚、硒、维生素A、维生素C、维生素E和玉米黄素。在优选的实施例中，抗氧化剂来自于天然来源，例如植物提取物。
在一个实施例中，该组合物包含糖胺聚糖。糖胺聚糖是存在于健康软骨中的大量带电的大分子。糖胺聚糖的例子为葡萄糖胺和硫酸软骨素。因此，本发明的一个实施例包含葡萄糖胺或硫酸软骨素中的至少一者。
在一些实施例中，该组合物包含一种或多种益生元。合适的益生元的非限制性例子包括金合欢胶、α-葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖、β-葡聚糖、右旋糖酐、果寡糖、岩藻糖基乳糖、半乳寡糖、半乳甘露聚糖、龙胆寡糖、葡寡糖、瓜尔豆胶、菊粉、异麦芽寡糖、乳新四糖、乳蔗糖、乳酮糖、果聚糖、麦芽糖糊精、乳寡糖、部分水解的瓜尔豆胶、果胶寡糖、抗性淀粉、回生淀粉、唾液酸寡糖、唾液酰乳糖、大豆寡糖类、糖醇类、木寡糖、它们的水解物，或它们的组合。
该组合物可包含纤维。所述纤维可以是可溶性纤维、不溶性纤维或它们的组合。可溶性纤维的非限制性例子包括果寡糖、金合欢胶、菊粉、琼脂、藻酸盐、角豆、卡拉胶、阿拉伯树胶、瓜尔豆胶、刺梧桐胶、果胶或黄原胶等等，这些可溶性纤维可以为水解形式，也可以为非水解形式。不溶性纤维的非限制性例子为豌豆外层纤维。
该组合物还可包含一种或多种益生菌。合适的益生菌的非限制性例子包括气球菌属(Aerococcus)、曲霉属(Aspergillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、假丝酵母属(Candida)、梭菌属(Clostridium)、德巴利氏酵母属(Debaromyces)、肠球菌属(Enterococcus)、梭杆菌属(Fusobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、微球菌属(Micrococcus)、毛霉属(Mucor)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)、青霉菌属(Penicillium)、消化链球菌属(Peptostrepococcus)、毕赤酵母属(Pichia)、丙酸菌属(Propionibacterium)、假小链双歧杆菌(Pseudocatenulatum)、根霉属(Rhizopus)、酵母属(Saccharomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、球拟酵母属(Torulopsis)、魏斯氏菌属(Weissella)、非复制型微生物以及它们的组合。
在一些实施例中，该组合物包含矿物质和痕量元素。合适的矿物质和痕量元素的非限制性例子包括钙、镁、钠、钾、磷、铜、锌、铁、硒、铬和钼，以及它们的组合。优选地，该组合物包含钙和/或镁。钙可以是例如生理学上可接受的有机和/或无机化合物，例如无机钙盐(氯化钙、磷酸钙、硫酸钙、氧化钙、氢氧化钙和/或碳酸钙)、有机钙盐(柠檬酸钙、马来酸钙或它们的混合物)和/或包含钙的有机组分(例如，脱脂乳粉或酪蛋白钙)中的一者或多者。镁可以是例如生理学上可接受的有机和/或无机化合物，例如无机镁盐(例如，氯化镁、磷酸镁、硫酸镁、氧化镁、氢氧化镁和/或碳酸镁)、有机镁盐(例如，柠檬酸镁、马来酸镁或它们的混合物)和/或包含镁的有机组分中的一者或多者。
该组合物可包含维生素，例如一种或多种选自以下的维生素：维生素A、维生素D、维生素E、维生素K、维生素C、叶酸、硫胺素、核黄素、维生素B6、维生素B12、烟酸、生物素和泛酸。维生素D可通过提高多酚(例如，橄榄苦苷和/或羟基酪醇)的效果和/或比不存在维生素D时更早地引发多酚的效果来加强多酚的效果。维生素D可以任何合适的形式存在，优选地以每份组合物中800至1200IU的量存在。合适形式的维生素D的非限制性例子包括胆钙化醇(D3)、麦角钙化醇(D2)以及其具有生物活性的代谢物和前体(例如，1-α-羟基维生素D、25-羟基维生素D、1,25-二羟基维生素D等)。
该组合物可通过任何适用于人类施用特别是在胃肠道的任何部分中施用的方式施用。经肠施用、口服施用以及通过管或导管施用均被本发明涵盖。该组合物还可通过选自口服、直肠、舌下、唇下、口腔内、局部等的方式施用。
该组合物可以任何已知的形式施用，包括例如方便剂型的片剂、胶囊剂、液体剂、咀嚼片、软凝胶、药囊、散剂、糖浆剂、液体悬浮剂、乳剂和溶液剂。在软胶囊剂中，活性成分优选地溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、石蜡油或液体聚乙二醇。可任选地添加稳定剂。如果该组合物通过管饲施用，那么该营养组合物可用于短期或长期的管饲。
该组合物可以是营养组合物或药物组合物，并可用于人类或兽类。“营养组合物”是任何为个体提供营养来源的组合物。营养组合物可以是完全营养的来源，也可以是不完全营养的来源。如本文所用，“完全营养”包括含有足够的种类和水平的常量营养素(蛋白质、脂肪和碳水化合物)和微量营养素的营养产品和组合物，对于所施用的动物而言，单靠摄入这种组合物就可获得充足的营养。患者能够从这类完全营养组合物中得到他们100％的营养需求。如本文所用，“不完全营养”包括含有水平不够充足的常量营养素(蛋白质、脂肪和碳水化合物)或微量营养素的营养产品或组合物，对于所施用的动物而言，不能单靠摄入这种组合物获得充足的营养。部分或不完全营养组合物可用作营养补充剂。
本发明提供的营养组合物可以是医疗食品。医疗食品是一类特殊的营养组合物，专用于提供某些病症的膳食管理。
在一个实施例中，该营养组合物包含蛋白质来源。蛋白质来源可以是膳食蛋白质，包括但不限于动物蛋白质(例如，乳蛋白、肉蛋白或卵蛋白)、植物蛋白质(例如，大豆蛋白、小麦蛋白、大米蛋白和豌豆蛋白)或它们的组合。在一个实施例中，该蛋白质选自乳清、鸡肉、玉米、酪蛋白酸盐、小麦、亚麻、大豆、角豆、豌豆以及它们的组合。
在一个实施例中，该营养组合物包含碳水化合物来源。任何合适的碳水化合物都可用于该组合物中，包括但不限于淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固形物、麦芽糖糊精、改性淀粉、直链淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、木糖醇、山梨糖醇或它们的组合。
在一个实施例中，该营养组合物包含脂肪来源。脂肪来源可包括任何合适的脂肪或脂肪混合物。例如，脂肪来源可包括但不限于植物脂肪(例如，橄榄油、玉米油、葵花油、高油酸葵花油、油菜籽油、低芥酸菜籽油、榛子油、大豆油、棕榈油、椰子油、黑加仑籽油、琉璃苣油、卵磷脂等)、动物脂肪(例如，乳脂肪)或它们的组合。脂肪来源也可以是以上所列的脂肪的较少精炼形式(例如，含有多酚的橄榄油)。
该营养组合物还可包含天然或人工风味物，例如水果风味物(例如，香蕉、橙子、桃、菠萝或覆盆子)或其他植物风味物(例如，香草、可可、咖啡等)。
除主要的生物活性组分之外，该营养组合物还可包含任何其他的生物活性组分，并且任选地包含蛋白质、碳水化合物和脂肪来源中的一种或多种以及任何数量的任选的另外的食品成分，包括常规(合成的或天然的)食品添加剂，例如一种或多种酸化剂、另外的增稠剂、缓冲剂或用于pH调节的物质、螯合剂、着色剂、乳化剂、赋形剂、调味剂、矿物质、渗透剂、药学上可接受的载体、防腐剂、稳定剂、食糖、甜味剂、质构剂和/或维生素。可以按任何合适的量添加所述任选成分。
该营养组合物可以任何合适的形式提供。可提供根据本发明使用的组合物的营养组合物形式的非限制性例子包括溶液、即用型组合物(例如，即饮型组合物或速溶饮料)、液体食品、软饮料、果汁、运动饮料、乳饮料、奶昔、酸奶饮料、汤等。在其他实施例中，该营养组合物可以浓缩物、粉末或颗粒(例如，泡腾颗粒)的形式提供，这些形式用水或其他液体(例如，乳或果汁)稀释以产生即用型的组合物。其他的营养组合物形式包括烘焙产品、乳制品、甜品、糖果产品、谷物棒和早餐谷物。乳制品的非限制性例子包括乳和乳饮料、酸奶和其他发酵牛奶产品、冰淇淋和奶酪。烘焙产品的非限制性例子包括面包、饼干和蛋糕。
在一个实施例中，该营养组合物可以设计为动物食品(特别是狗或猫的食品)的形式、以湿润形式、以半湿润形式或干燥形式提供，特别是以饼干的形式提供。
在一个实施例中，该组合物是药物组合物。药物组合物是不同于营养组合物的组合物，其用于身体上或体内以预防、诊断、缓解、治疗或治愈人类或动物的疾病。该药物组合物可用于人类，或者也可以是兽药组合物，例如适用于狗、猫或马，特别是良种马。
该药物组合物可适用于口服、肠胃外或静脉内施用。当该药物组合物包含至少一种药学上或生理学上可接受的赋形剂时，该赋形剂优选地适用于通过口服途径施用该组合物或适用于通过肠胃外途径施用该组合物。该药物组合物可具有固体或液体形式。对于口服施用，优选片剂、胶囊剂或明胶胶囊形式的固体药物组合物。在液体形式中，该药物组合物可以是水性或非水性的悬浮剂，也可以是油包水或水包油的乳剂。
固体药物形式可包含、稀释剂、风味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂或包囊剂中的一者或多者作为介质、佐剂或赋形剂。这类化合物的非限制性例子包括碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、纤维素材料、可可脂等。液体形式的药物组合物可包含水，该水任选地与丙二醇或聚乙二醇混合，还可包含一种或多种着色色剂、风味剂、稳定剂和增稠剂。
在一个实施例中，本发明提供一种用于治疗或预防滑膜炎的营养组合物的制备方法，该方法包括将橄榄苦苷和/或羟基酪醇与一种或多种其他成分混合，以形成营养组合物。所述一种或多种成分可包括姜黄素和/或槲皮素。
实例
以下非限制性实例示出了一系列数据，这些数据为使用选自橄榄苦苷、芦丁、姜黄素以及它们的组合的植物营养素治疗或预防滑膜炎这一概念提供了科学依据。
实例1
在海藻酸盐微珠中对牛原代软骨细胞进行体外研究。基本纯化的橄榄苦苷(>98％)从法国热奈的Extrasynthese公司(Extrasynthese(Genay,France))购得。基本纯化的羟基酪醇(>98％)从法国热奈的Extrasynthese公司(Extrasynthese(Genay,France))购得。基本纯化的槲皮素(>97％)从德国鲁尔兹罕姆的HWIAnalytik股份有限公司(HWIAnalytikGmbH(Ruelzheim,Germany))购得。基本纯化的姜黄素(>94％)从瑞士布克斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Buchs,Switzerland)购得。
清洗幼牛脚，去除污垢。去除牛脚上的皮肤。横向打开关节。横切关节内韧带。用磷酸缓冲盐溶液清洗打开的关节。使用解剖刀片解剖出完整厚度的软骨片，并将其收集在含有10mMHepes和1％青霉素-链霉素的DMEM高糖溶液中。在含有10mMHepes和1％青霉素-链霉素的DMEM高糖溶液中清洗软骨片。
然后将软骨依次用0.5mg/mL透明质酸酶消化30分钟，用1.0mg/mL链霉蛋白酶E消化60分钟，用1.0mg/mL胶原酶在低速搅拌下过夜消化。在酶温育后，用70μm细胞滤网过滤细胞悬浮液，以分离细胞群并去除组织碎片。离心该细胞悬浮液以沉淀细胞。弃去培养基，离心清洗细胞沉淀物，将其重新悬浮在含有10mMHEPES的0.9％氯化钠溶液中。
将细胞悬浮在含有1.2％海藻酸盐的0.9％NaCl、10mMHEPES溶液中，以获得4.3×106个细胞/mL的密度。通过针头将悬浮液逐滴加入102mMCaCl2溶液中。10分钟后，聚合微珠并用0.9％NaCl、10mMHEPES清洗微珠。在24孔培养板中，每个孔中沉积10个微珠，并加入1mL完全培养基(含有2mML-谷氨酰胺、0.5mg/mL抗坏血酸、0.2mg/mLL-脯氨酸和10％胎牛血清的DMEM高葡萄糖溶液)。细胞在培养基中培养2天，然后在存在或不存在白细胞介素-1α(10ng/mL)的情况下向其中加入以下物质进行处理：1.5μM橄榄苦苷、1.5μM羟基酪醇、1.5μM槲皮素、1.5μM姜黄素、1.5μM橄榄苦苷+1.5μM槲皮素、1.5μM橄榄苦苷+1.5μM姜黄素、1.5μM羟基酪醇+1.5μM槲皮素、1.5μM羟基酪醇+1.5μM姜黄素、1.5μM槲皮素+1.5μM姜黄素、1.5μM橄榄苦苷+1.5μM槲皮素+1.5μM姜黄素、1.5μM羟基酪醇+1.5μM槲皮素+1.5μM姜黄素。以上处理中加入的物质均溶解在二甲基亚砜(DMSO)中。DMSO的最终浓度为0.1％。细胞在这些物质中处理3天。
处理结束时，用0.1M柠檬酸钠和0.15M氯化钠溶液清洗并重新悬浮微珠。离心悬浮液，收集含有细胞的沉淀物，用于总RNA提取。
利用凯杰公司(Qiagen)的RNeasy试剂盒从40个微珠中提取总RNA。利用宝生物公司(Takara)的Primescript第一链cDNA合成试剂盒(Primescript1ststrandcDNASynthesiskit)反转录RNA，获得cDNA。通过实时定量PCR(SYBRGreen)进行ADAMTS-5、COX-2、MMP-13和GAPDH的mRNA表达的定量分析。所用引物(来自家牛(BosTaurus))如下表1所示：
表1引物
在患病条件下，添加OLP、HTY、QRC或CUR可拮抗IL-1α刺激的软骨细胞并降低MMP-13的表达。组合使用OLP、HTY、QRC或CUR中的三者具有协同效应。
结果如下所示。图1至图3示出了细胞培养3天后ADAMTS-5、COX-2和MMP-13的mRNA表达(以GAPDHmRNA表达进行归一化)。数据表示为相对于阴性对照(完全培养基中培养的细胞)的基因表达倍数变化。按照2-ΔΔCT方法计算结果。
CTL-：阴性对照
OLP：橄榄苦苷
HTY：羟基酪醇
QRC：槲皮素
CUR：姜黄素
IL1a：白细胞介素-1α(10ng/mL)
数据表示为中值±中值的标准误差(每一种进行两个实验，每个实验三次平行)。依次用KruskalWallis检验和MannWhitneyU检验(双尾检验)，将结果与阴性对照(CTL-)或白细胞介素-1α(IL1a)进行统计学分析，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图1A示出了不存在IL1a时(模拟正常细胞状态)ADAMTS-5mRNA相对于GAPDH的表达。各条件与CTL-进行了统计比较。图1B示出了存在IL1a时(模拟患病细胞状态)ADAMTS-5mRNA相对于GAPDH的表达。各条件与IL1a进行了统计比较，而IL1a与CTL-进行了比较(实验验证)。
在正常条件下，添加OLP、HTY、QRC或CUR可降低ADAMTS-5(软骨破坏的标志物)的表达。组合使用这些不同的多酚具有协同效应。
在患病条件下，添加OLP、HTY、QRC或CUR可拮抗IL-1α刺激的软骨细胞并降低ADAMTS-5的表达。组合使用这些不同的多酚具有协同效应。
图2A示出了不存在IL1a时(模拟正常细胞状态)COX-2mRNA相对于GAPDH的表达。各条件与CTL-进行了统计比较。
图2B示出了存在IL1a时(模拟患病细胞状态)COX-2mRNA相对于GAPDH的表达。各条件与IL1a进行了统计比较，而IL1a与CTL-进行了比较(实验验证)。
在正常条件下，添加QRC可降低COX-2(炎症状态的标志物)的表达。组合使用OLP、HTY、QRC或CUR中的两者或三者具有协同效应。在患病条件下，添加QRC或CUR可拮抗IL-1α刺激的细胞并降低COX-2的表达。组合使用OLP、HTY、QRC或CUR中的两者或三者具有协同效应。
图3A示出了不存在IL1a时(模拟正常细胞状态)MMP-13mRNA相对于GAPDH的表达。各条件与CTL-进行了统计比较。
图3B示出了存在IL1a时(模拟患病细胞状态)MMP-13mRNA相对于GAPDH的表达。各条件与IL1a进行了统计比较，而IL1a与CTL-进行了比较(实验验证)。
在正常条件下，单独或组合添加OLP、HTY、QRC或CUR可降低MMP-13(参与细胞外基质(与骨关节炎中的关节软骨转换有关)的分解)的表达。
实例2
在Dunkin-Hartley豚鼠中进行骨关节炎的自发性发展的体外研究。从巴黎查尔斯河实验室(CharlesRiverLaboratories)获得65只3周龄的雄性Dunkin-Hartley豚鼠。将豚鼠分为5只一组，关在底部坚固的笼子中，豚鼠可自由进食标准豚鼠饮食和水。在施用植物营养素之前，让所有动物适应居住条件一周。笼子加有PVC管，以改善居住条件并使应激尽可能小。
一周后，将65只4周龄的雄性Dunkin-Hartley豚鼠随机分为3个处理组，分别接受含有0.025％橄榄苦苷、0.5％芦丁、0.5％芦丁+0.25％姜黄素的饮食，对照组接受标准饮食，连续喂养31周。基本纯化的橄榄苦苷(>90％)从法国热奈的Extrasynthese公司(Extrasynthese(Genay,France))购得。基本纯化的芦丁(>94％)从瑞士布克斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Buchs,Switzerland)购得。基本纯化的姜黄素(>70％)从瑞士布克斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Buchs,Switzerland)购得。
A组(n＝15)在31周中接受日剂量的橄榄苦苷。
B组(n＝15)在31周中接受标准饮食(对照组)。
C组(n＝15)在31周中接受日剂量的芦丁。
D组(n＝15)在31周中接受日剂量的芦丁和姜黄素。
E组(n＝5，参照组)实施安乐死且不接受任何干预。
将橄榄苦苷、芦丁和姜黄素添加在饮食中。每周对动物进行称重并用微芯片进行鉴定。第9、15、21、26、34周时，每天对所添加食物和剩余食物进行称重，以控制豚鼠的食物摄入量。
在早晨对豚鼠注射氯胺酮/甲苯噻嗪使其保持镇定状态，在耳表静脉处采集空腹6小时的血液，每6周进行一次：第4周(＝T0)、第10周、第16周、第22周、第28周。第35周时，对豚鼠实施全身麻醉，通过心脏穿刺采集血液，然后对其实施安乐死。
完成心脏穿刺血液采集后，对豚鼠进行称重，然后以100mg/kg戊巴比妥钠对动物实施安乐死。观察主要器官(心脏、消化道和泌尿道、肾上腺)，检测是否有异样。对肝脏和肾上腺进行称重。将每只动物的右膝关节在4％多聚甲醛缓冲液中固定24小时，然后4℃下在盐酸(DC2，比利时Labonord公司)中脱钙4小时，最后用石蜡包埋。
按照国际骨关节炎研究学会(OARSI)推荐的Cushin平面(Cushinplane)，在未被半月板覆盖的中心区域，用超薄切片机(徕卡公司(Leica))将石蜡包埋后的右膝切为6μm厚的切片。将三个间距为200μm的切片用苏木精、固绿和番红O染色，另取一张中心切片，用甲苯胺蓝染色。盲选两位经过训练的专家，按照OARSI的推荐对切片的每个隔室(胫骨内侧、胫骨外侧、股骨内侧和股骨外侧)进行评分，并综合每个隔室的评分来评估软骨总评分。结果示于图4和图5中。两位盲选的经过训练的专家按照OARSI的推荐对外侧滑膜和内侧滑膜进行了评分，并计算外侧滑膜和内侧滑膜的平均值以评估滑膜总评分。结果示于图11至图13中。
如图5所示，与对照组相比，橄榄苦苷组、芦丁组和芦丁+姜黄素组的骨关节炎评分显著降低(p<0.01)。
明显地，如图11A、图12A和图13A所示，与对照组相比，橄榄苦苷组的滑膜评分显著降低(p<0.05)。在对照组中，滑膜评分与骨关节炎评分正相关(图11B、图12B和图13B)。
使用竞争法ELISA试剂盒(美国ArborAssays公司)测量豚鼠血清中的PGE2。结果示于图6中。用橄榄苦苷处理35周后，可降低血浆中的PGE2水平。但是，芦丁和姜黄素对PGE2水平仅具有非显著的影响，表明芦丁和姜黄素主要对软骨分解起作用。
血浆中的PGE2水平可与骨关节炎评分正相关。这表明，在豚鼠模型中，PGE2是与骨关节炎发生和发展有关的生物标志物，并且可用于评估处理效果。
亚硝基化表位Coll2-1NO2位于II型胶原的螺旋结构域，其在豚鼠血清中的含量通过兔多克隆抗血清的竞争法ELISA(D37)(比利时Artialis公司)来定量，进行三次平行实验。Coll2-1NO2免疫分析以高度的特异性和亲和性对硝化氨基酸序列进行定量。结果示于图7和图8中。
用橄榄苦苷、芦丁和芦丁+姜黄素处理可减少胶原降解(通过血浆中的Coll2-1NO2水平测定)。Coll2-1NO2含量与骨关节炎评分正相关。这表明，在豚鼠模型中，Coll2-1NO2是与骨关节炎发生和发展有关的生物标志物，并且可用于评估处理效果。
Fib3-1是Fibulin-3的片段，其含量在骨关节炎患者的血清中有所增加。Fib3-1在豚鼠血清中的含量通过兔多克隆抗血清的竞争法ELISA(AS88)(比利时Artialis公司)来定量，进行三次平行实验。结果示于图9和图10中。
用芦丁处理和用芦丁+姜黄素处理可降低血浆中的Fibulin3-1水平。血浆中的Fibulin3-1水平可与骨关节炎评分正相关。这表明，在豚鼠模型中，Fib3-1是与骨关节炎发生和发展有关的生物标志物，并且可用于评估处理效果。
批内和批间变异系数均小于10％，所有生物标志物分析的稀释曲线与标准曲线均呈平行关系。
计算每个参数的结果(平均值±标准偏差)。对所有实验数据进行正态性检验，然后利用Dunnett’s事后检验或皮尔逊相关系数进行参数方差分析(ANOVA)。*p<0.05；**<0.01；***p<0.001。橄榄苦苷、芦丁和芦丁+姜黄素处理可通过不同机制降低豚鼠的骨关节炎评分，但与对照组相比，只有橄榄苦苷能减轻滑膜炎。
实例3
研究成骨细胞的胶原合成和维生素D的增强作用。按照Declercq等人(2004年)所描述的方法，通过酶促消化从新生Wistar大鼠的头骨中分离原代成骨细胞。在所有实验中，在5％CO2和37℃条件下，将细胞保持在含有10％加热灭活的胎牛血清和1％青霉素/链霉素的α-最低必需培养基(α-MEM)中。然后将细胞以3500个细胞/孔的密度接种于胶原1包被的96孔板中，或以3×104个细胞/孔的密度接种于24孔板中，在α-MEM中培养2天直到细胞长满。然后使细胞暴露于不同的条件：基本培养基(C-)，含有50μg/mL抗坏血酸、5mMβ-甘油磷酸盐的基本培养基(C+；优化培养基)，添加1μM橄榄苦苷(OLP)和/或1μM羟基酪醇(HTy)和/或10-9M1,25-二羟基维生素D3(1,25(OH)2D3)的基本培养基。用二甲基亚砜(DMSO)溶解OLP和HTy，用乙醇溶解1,25(OH)2D3。DMSO和乙醇在培养基中的最终浓度均为0.1％。每两天更换一次培养基。
9天后，利用Biocolor公司的Sircol测定法测量细胞胶原的含量。该Sircol胶原测定法是一种定量染料结合方法，用于在体外培养过程中分析从哺乳动物组织和细胞中提取的胶原。该染色试剂特异性结合到哺乳动物胶原(I至V型)中的[Gly-X-Y]n螺旋结构。
图14示出了成骨细胞培养9天后的胶原合成情况，其中通过测定组合使用1,25(OH)2D3、OLP和HTy刺激细胞后，每毫克总蛋白中产生的胶原微克数来表示胶原合成量。
1,25(OH)2D3＝10-9M1,25-二羟基维生素D3
OLP＝1μM橄榄苦苷
HTY＝1μM羟基酪醇
C+＝优化培养基，用作阳性对照
数据表示为平均值±均值标准误差(三次平行实验)。统计学分析：依次用KruskalWallis检验和MannWhitneyU检验(双尾检验)，将结果与阴性对照(C-)进行统计学分析，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
如图14所示，向成骨细胞中添加1,25(OH)2D3、OLP和HTy的组合并培养9天后，显著刺激了成骨细胞的细胞胶原合成。
实例4
研究成骨细胞的碱性磷酸酶活性和维生素D的增强作用。按照Declercq等人(2004年)所描述的方法，通过酶促消化从新生Wistar大鼠的头骨中分离原代成骨细胞。在所有实验中，在5％CO2和37℃条件下，将细胞保持在含有10％加热灭活的胎牛血清和1％青霉素/链霉素的α-最低必需培养基(α-MEM)中。然后将细胞以3500个细胞/孔的密度接种于胶原1包被的96孔板中，或以3×104个细胞/孔的密度接种于24孔板中，在α-MEM中培养2天直到细胞长满。然后使细胞暴露于不同的条件：基本培养基(C-)，含有50μg/mL抗坏血酸、5mMβ-甘油磷酸盐的基本培养基(C+；优化培养基)，添加1μM橄榄苦苷(OLP)和/或1μM羟基酪醇(HTy)和/或10-9M1,25-二羟基维生素D3(1,25(OH)2D3)的基本培养基。用二甲基亚砜(DMSO)溶解OLP和HTy，用乙醇溶解1,25(OH)2D3。DMSO和乙醇在培养基中的最终浓度均为0.1％。每两天更换一次培养基。
在处理第0、5、9、12、15天时，对碱性磷酸酶(ALP)的酶活性进行动力学测量。用PBS冲洗成骨细胞两次，然后置于干冰上冻结。然后通过冻融循环，并均化到200μL1M二乙醇胺和0.24mM氯化镁缓冲液(pH9.8)(ALP缓冲液)中，从而裂解细胞。将细胞裂解物(10μL)加入200μL溶于ALP缓冲液的6mg/mL对硝基苯磷酸盐(p-NPP)溶液。使用VarioSklanFlash酶标仪测定405nm处的吸光度，具体条件是在30℃下，30分钟内每2分30秒测定一次。ALP活性表示为每毫克蛋白每小时的p-NPP微摩尔数。根据Bradford的方法，利用QuickStartBioRad蛋白测定法进行蛋白质测定。
图15示出了培养9天后的碱性磷酸酶(ALP)活性，其中通过测定使用1,25(OH)2D3、OLP和HTy的组合后，每毫克蛋白每小时的ALP微摩尔数来表示ALP活性。
C-＝基本培养基，用作阴性对照
1,25(OH)2D3＝10-9M1,25-二羟基维生素D3
OLP＝1μM橄榄苦苷
HTY＝1μM羟基酪醇
C+＝优化培养基，用作阳性对照
数据表示为平均值±均值标准误差。统计学分析：依次用KruskalWallis检验和MannWhitneyU检验(双尾检验)，将结果与阴性对照(C-)进行统计学分析，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图15进一步表明，向成骨细胞中添加1,25(OH)2D3、OLP和HTy的组合并培养9天后，显著刺激了成骨细胞的细胞胶原合成。图16至图19示出了在存在1,25(OH)2D3、橄榄苦苷(OLP)和羟基酪醇(Hyt)的情况下，所培养的成骨细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性；其中以时间进程模式示出了单独或组合添加以上物质的实验结果。
C-＝基本培养基，用作阴性对照
1,25(OH)2D3＝10-9M1,25-二羟基维生素D3
OLP＝1μM橄榄苦苷
HTY＝1μM羟基酪醇
C+＝优化培养基，用作阳性对照。
数据表示为平均值±均值标准误差。统计学分析：依次用KruskalWallis检验和MannWhitneyU检验(双尾检验)，将结果与阴性对照(C-)进行统计学分析，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
从图16所示的数据可以看出，单独添加维生素D3确实在第15天时诱导了AP活性的小幅但却具有统计学上的显著性的增加，这表明存在成骨细胞活性、骨骼形成和/或软骨合成代谢。同样，单独添加HTy或OLP也在第15天时导致了AP活性的小幅增加，与添加维生素D3的效果相当(分别见各图)。
组合使用HTy和OLP还增加了成骨细胞活性(仍在第15天时)，但不如组合使用维生素D和HTy或维生素D和OLP时的活性高。仍然，只有在第12天和第15天时才与对照组有统计学上的显著差异。早期测定结果(第5天和第9天)与阴性对照并无统计学差异。
因此，所示数据说明了添加维生素D具有两种效果。首先，将维生素D与HTy和OLP中的一者或两者一起添加可增加成骨细胞的响应。这可通过比较(例如)第15天的水平看出。其次，将维生素D与HTy和OLP中的一者或两者一起添加可比对照组更早地引发成骨细胞的活性。因此，结论是，添加维生素D可导致更早和更强的响应。由此可以断定，添加维生素D可加强由OLP和/或HTy引发的骨骼形成和/或软骨合成代谢响应。
应当理解，对本文所述的目前优选的实施例作出的各种变化和修改对于本领域的技术人员将是显而易见的。可在不脱离本发明主题的实质和范围、且不削弱其预期优点的前提下作出此类变化和修改。因此，这些变化和修改旨在由所附权利要求书涵盖。

Claims (15)

1.一种治疗滑膜炎的方法，所述方法包括将包含治疗有效量的植物营养素的组合物施用于患有滑膜炎的个体，所述植物营养素选自橄榄苦苷、芦丁、姜黄素以及它们的组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述滑膜炎与选自狼疮、痛风、关节炎以及它们的组合的病症相关。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述病症为关节炎，所述关节炎选自类风湿性关节炎、骨关节炎、骨软骨炎、骨关节病以及它们的组合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物营养素包含橄榄苦苷。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含另外的生物活性化合物，所述生物活性化合物选自槲皮素、羟基酪醇、维生素D以及它们的组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物营养素从植物提取物中分离。
7.一种预防滑膜炎的方法，所述方法包括将包含治疗有效量的植物营养素的组合物施用于具有患滑膜炎风险的个体，所述植物营养素选自橄榄苦苷、芦丁、姜黄素以及它们的组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述个体选自衰老的人和老年人。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物营养素从植物提取物中分离。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述组合物还包含另外的生物活性化合物，所述生物活性化合物选自槲皮素、羟基酪醇、维生素D以及它们的组合。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述组合物每天施用并持续至少一个月。
12.一种用于治疗或预防滑膜炎的组合物，所述组合物包含治疗有效量的植物营养素，所述植物营养素选自橄榄苦苷、芦丁、姜黄素以及它们的组合。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物为营养组合物。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述营养组合物包含选自蛋白质、碳水化合物、脂肪以及它们的组合的组分。
15.一种治疗或预防滑膜炎继发的关节软骨退化的方法，所述方法包括将包含治疗有效量的植物营养素的组合物施用于需要治疗或预防的个体，所述植物营养素选自橄榄苦苷、芦丁、姜黄素以及它们的组合。
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