CN105603116A - 一种诊治子宫肌瘤的分子标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于子宫肌瘤诊断的分子标志物。本发明利用QPCR和Western？blot方法证明SYBU基因在子宫肌瘤组织和正常组织中的表达存在显著差异。另外，本发明的体外细胞培养实验证明SYBU基因表达可以抑制子宫肌瘤细胞的增殖同时促进细胞凋亡，因此SYBU基因及其表达产物可以用于制备治疗子宫肌瘤的药物，广泛在临床上应用。

Description

一种诊治子宫肌瘤的分子标志物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及SYBU基因在子宫肌瘤的诊断、治疗中的用途。
背景技术
子宫肌瘤(别名：子宫良性肿瘤英文：myomaofuterus)，是女性生殖器最常见的一种良性肿瘤。多无症状，少数表现为阴道出血，腹部触及肿物以及压迫症状等。以多发性子宫肌瘤常见，本病确切病因不明，现代西医学采取性激素或手术治疗，尚无其他理想疗法，好发于卵巢功能较旺盛的30～45岁的妇女，待到患者50岁以后，由于卵巢功能明显衰退，肌瘤大多自行缩小。
子宫肌瘤诊断可以通过一些子宫肌瘤的症状而进行初步的判断，然后在做进一步的检查，但是不能仅靠妇科检查进行确诊。首先，患有子宫肌瘤会感觉到腹痛，其次女性的月经也会发生改变，甚至会引发不孕或多次流产。目前国内B超检查较为普遍，也是常见的子宫肌瘤的诊断方法，可以较明确显示肌瘤大小及部位。腹腔镜、宫腔镜、诊断性刮宫有助于子宫肌瘤的诊断。但是上述物理方法存在灵敏性差或者使患者感觉不适的缺陷，因此期待新的诊断方法的出现。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于子宫肌瘤早期诊断的分子标志物。使用基因标志物来诊断子宫肌瘤具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测SYBU基因表达的产品在制备诊断子宫肌瘤的工具中的应用。
进一步，所述检测SYBU基因表达的产品包括检测SYBU基因mRNA水平的产品、和/或检测SYBU蛋白水平的产品。
进一步，所述检测SYBU基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测SYBU基因及其表达产物的表达水平以诊断子宫肌瘤的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断子宫肌瘤的产品至少包括一对特异扩增SYBU基因的引物；所述用实时定量PCR诊断子宫肌瘤的产品至少包括一对特异扩增SYBU基因的引物；所述用免疫检测诊断子宫肌瘤的产品包括：与SYBU蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断子宫肌瘤的产品包括：与SYBU基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断子宫肌瘤的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与SYBU蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与SYBU基因的核酸序列杂交的探针。
所述用实时定量PCR诊断子宫肌瘤的产品至少包括的一对特异扩增SYBU基因的引物如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。
所述检测SYBU基因表达的产品可以是检测SYBU基因表达的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
所述诊断子宫肌瘤的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断子宫肌瘤的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知SYBU基因的异常与子宫肌瘤相关也属于SYBU基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断子宫肌瘤的工具，所述工具包括检测SYBU基因表达的试剂；所述试剂包括检测SYBU基因mRNA的引物和/或探针、检测SYBU蛋白的抗体。
所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测SYBU基因转录水平的针对SYBU基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的SYBU蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括SYBU基因在内的多个基因(例如，与子宫肌瘤相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括SYBU蛋白在内的多个蛋白质(例如与子宫肌瘤相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与子宫肌瘤的标志物同时检测，可大大提高子宫肌瘤诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测SYBU基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括SYBU蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测SYBU基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对SYBU基因的引物和/或探针。根据SYBU基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测SYBU基因表达水平的引物和探针。
所述试纸包括检测SYBU基因表达的试剂。
所述高通量测序平台包括检测SYBU基因表达的试剂。
与SYBU基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述SYBU蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述SYBU蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与SYBU蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述检测SYBU基因mRNA的引物包括SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物对。
本发明还提供了SYBU基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗子宫肌瘤的药物中的应用。
所述促进剂包括促进SYBU基因表达的试剂和促进SYBU基因表达产物的试剂；所述促进SYBU基因表达的试剂包括促进基因转录的试剂、促进基因翻译的试剂、促进SYBU蛋白含量的试剂；所述促进SYBU基因表达产物的试剂包括促进SYBU基因表达产物稳定性的试剂、促进SYBU基因表达产物活性的试剂、促进SYBU基因表达产物功能的试剂。
具体地，所述促进SYBU基因表达的试剂包括：含有SYBU基因的试剂、携带SYBU基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有SYBU蛋白质的试剂。
本发明的促进剂一方面可以用于补充内源性的SYBU蛋白的缺失或不足，通过提高SYBU蛋白的表达，从而治疗因SYBU蛋白缺乏导致的子宫肌瘤。另一方面可以用于促进SYBU蛋白的活性或者功能，从而治疗子宫肌瘤。
本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
本发明还提供了一种用于治疗子宫肌瘤的药物组合物，所述药物组合物包括上面所述的SYBU基因和/或其表达产物的促进剂。
进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。
本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有SYBU基因的药物或者含有SYBU蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有SYBU基因的药物或者含有SYBU蛋白质的药物注入体内组织中。
本发明的药物还可与其他治疗子宫肌瘤的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
在本发明的上下文中，“SYBU基因”包括SYBU基因以及SYBU基因的任何功能等同物的多核苷酸。SYBU基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中SYBU基因(NC_000008.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，SYBU基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
(1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述SYBU基因的编码序列是SEQIDNO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，SYBU基因表达产物包括SYBU蛋白以及SYBU蛋白的部分肽。所述SYBU蛋白的部分肽含有与子宫肌瘤相关的功能域。
“SYBU蛋白”包括SYBU蛋白以及SYBU蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括SYBU蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与SYBU的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，SYBU蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述SYBU蛋白是具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是SYBU蛋白的融合蛋白。对于与SYBU蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留SYBU蛋白的生物学活性即可。
本发明的SYBU蛋白也包括对SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留SYBU蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断子宫肌瘤”既包括判断受试者是否已经患有子宫肌瘤、也包括判断受试者是否存在患有子宫肌瘤的风险。
在本发明的上下文中，“治疗子宫肌瘤”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了SYBU基因表达与子宫肌瘤相关，通过检测受试者子宫组织中SYBU的表达，可以判断受试者是否患有子宫肌瘤、或者判断受试者是否存在患有子宫肌瘤的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-SYBU基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现子宫肌瘤的早期诊断。
附图说明
图1显示利用QPCR检测SYBU基因在子宫组织中的表达情况；
图2显示利用Westernblot检测SYBU蛋白在子宫组织中的表达情况；
图3显示利用QPCR在转录水平上检测SYBU基因的过表达情况；
图4显示利用Westernblot检测SYBU蛋白的过表达情况。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1正常肌层组织和子宫肌瘤组织中SYBU基因的表达差异
1、实验材料：
无菌取因子宫肌瘤行全子宫切除术者的子宫肌瘤组织和邻近的正常肌层组织，患者在术前3个月内未接受过激素治疗，术后均经病理确诊为子宫肌瘤，本实验材料取自5例子宫肌瘤患者，患者年龄在25-45岁间。
2、检测SYBU基因的差异表达
2.1组织RNA的提取
使用QIAGEN公司的RNApreppureTissueKit(动物组织总RNA提取试剂盒(DP431))按照操作说明提取。
2.2RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
2.3RNA样品的质量分析(AgilentTechnologies2100Bioanalyzer)
AgilentTechnologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28SrRNA和18SrRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。
2.4高通量转录组测序
(1)RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHatv1.3.1将清洁片段与UCSCH.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiensUCSChg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
(2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinksv1.0.3处理，Cufflinksv1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
(3)差异表达基因的检测
将下载的EnsemblGTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
3、结果
RNA-seq结果显示，与正常肌层组织相比，子宫肌瘤组织中SYBU基因的mRNA水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2差异表达基因的验证
1、实验材料：
无菌取因子宫肌瘤行全子宫切除术者的子宫肌瘤组织和邻近的正常肌层组织，患者在术前3个月内未接受过激素治疗，术后均经病理确诊为子宫肌瘤，本实验材料取自50例子宫肌瘤患者，患者年龄在25-45岁间。
2、检测SYBU基因的差异表达
2.1组织RNA的提取
使用QIAGEN公司的RNApreppureTissueKit(动物组织总RNA提取试剂盒(DP431))按照操作说明提取。
2.2逆转录
用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/LdNTP，0.1mmol/lDTT，30μmmol/lOligodT，200U/μlM-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
2.3QPCR
采用实时荧光检测方法对mRNA丰度进行定量。如上述获得的cDNA在ABIPrism7700序列检测器上进行扩增，SYBU基因引物、18S核糖体RNA基因引物设计如下：
SYBU基因
正向引物：5’-GGAGATAGCATAGCCAACA-3’(SEQIDNO.3)；
反向引物：5’-TCCAGGTCACCAGATTCT-3’(SEQIDNO.4)，
18SrRNA
正向引物：5’-AATCAGGGTTCGATTCCGGA-3’(SEQIDNO.5)；
反向引物：5’-CCAAGATCCAACTACGAGCT-3’(SEQIDNO.6)。
SYBU基因的表达使用18S核糖体RNA作内参。用12.5μl的2倍量SYBRGreenPCRmastermix(包括5μmol/L的正向引物和5μmol/L反向引物)进行PCR，终体积为25μl。PCR条件为：95℃10min，50个循环(95℃30s，56℃30s，72℃30s)。使用ABIprism7700型序列检测仪对报告荧光染料所发射的荧光进行实时监测。荧光发射量反映循环数，并由序列检测仪的软件读出，给出对PCR扩增有意义的循环数阈值，循环数的值与基因组DNA对数呈线性关系。
2.4统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，不同组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
2.5结果
结果如图1所示，与正常肌层组织相比，子宫肌瘤组织中SYBU基因的mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
3、在蛋白水平上检测SYBU基因的差异表达
3.1步骤
(1)进行总蛋白的提取，按照EpiQuik组织/细胞蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
(2)Westernblot检测
总蛋白用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30pg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，开始设为80V恒压，看见Marker后增加至120V；将电泳后的胶取出，使用Bio.Rad半干转印系统于100V转移50min；转膜完毕后，用1xPBS洗一次，浸入封闭液，40C过夜；倒掉封闭液，加入Western洗涤液洗涤5-10min，加入一抗摇床室温杂交2h；按照适当比例用Western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。
3.2统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用ImageJ软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3.3结果
结果如图2所示，与正常肌层组织相比，子宫肌瘤组织中SYBU蛋白含量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例3SYBU基因表达质粒构建
1、SYBU基因表达载体的构建
根据SYBU基因的编码序列(如SEQIDNO.1所示)设计扩增引物。从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的SYBU基因的编码序列，将上述cDNA序列插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-SYBU用于后续实验。
2、子宫肌瘤细胞的培养与转染
手术切除子宫肌瘤后，立即在无菌条件下取子宫肌瘤组织1cm，置于10mL3％双抗(青、链霉素)的PBS中，密闭冰浴尽快送入细胞培养室。子宫肌瘤组织用3％双抗的PBS液漂洗，在含有DMEM培养液的平皿中修剪成1mm；大小的组织块。将剪碎的组织小块用弯头吸管送入培养瓶中，每小块间距2.0-3.0mm左右。组织块摆好后，将培养液吸出，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入含15％胎牛血清的DMEM培养液2mL，盖好瓶盖，将培养瓶倒置放在37℃、5％CO2培养箱内。4h后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。每2-3d换液1次。待细胞达80％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化传代。
取第3-4代子宫肌瘤细胞按1×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为对照组(转染pcDNA3.1)和实验组(转染pcDNA3.1-SYBU)，转染质粒的工作浓度是0.5μg/ml。
3、利用QPCR实验检测质粒转染的效果。
3.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
3.2逆转录
步骤同实施例2。
3.3QPCR
步骤同实施例2。
3.4统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、Western检测
具体步骤同实施例2。
5、结果
如图3所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-SYBU的细胞中SYBU的mRNA水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)；如图4所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-SYBU的细胞中SYBU的蛋白水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4SYBU基因对子宫肌瘤细胞增殖的影响
使用CellCountingkit-8(cck-8)试剂盒(凯基生物公司生产)用于检测子宫肌瘤细胞增殖的检测
1、步骤
按照实施例3的步骤进行细胞的培养与转染
细胞分为两个实验组：
组1：细胞转染pcDNA3.1；
组2：细胞转染pcDNA3.1-SYBU；
转染24h后，以2×105/ml密度接种于96孔细胞培养板中，每个实验组设计三复孔，每孔100μl，放置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，24h细胞贴壁后，分别在所需检测的培养孔内每孔加入10μlCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1h，测定450nm处各孔吸光度值(OD值)。
2、结果
表1中的结果显示，转染pcDNA3.1-SYBU组的细胞生长速度明显低于转染pcDNA3.1空载体组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)上述结果表明SYBU基因高表达能够抑制子宫肌瘤细胞的生长。
表1子宫肌瘤细胞OD值
实验组 OD值(光密度)
pcDNA3.1 1.195±0.091
pcDNA3.1-SYBU 0.412±0.035
实施例5SYBU基因对子宫肌瘤细胞凋亡的影响
1、细胞培养步骤同实施例3。
2、细胞转染子宫肌瘤细胞悬液3.0×104/ml接种于预置盖玻片的6孔板，之后按照实施例3的步骤进行转染。
3、TUNEL法原位检测细胞凋亡：转染48h后，取出盖玻片用新鲜配制的4％多聚甲醛固定，按TUNEL试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)说明书进行操作，BLIP/NBT显色，核固红复染，甘油封片。用PBS代替TUNEL染色液作对照组，高倍镜下计数300个细胞。TUNEL凋亡指数计算公式为：阳性细胞数/总细胞数。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果：
转染pcDNA3.1的细胞凋亡指数为0.035±0.009，转染pcDNA3.1-SYBU的细胞凋亡指数为0.143±0.004，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，SYBU基因的高表达可以促进子宫肌瘤细胞的凋亡。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测SYBU基因表达的产品在制备诊断子宫肌瘤的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交芯片或高通量测序平台检测SYBU基因表达以诊断子宫肌瘤的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断子宫肌瘤的产品至少包括一对特异扩增SYBU基因的引物；所述用实时定量PCR诊断子宫肌瘤的产品至少包括一对特异扩增SYBU基因的引物；所述用免疫检测诊断子宫肌瘤的产品包括：与SYBU蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断子宫肌瘤的产品包括：与SYBU基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断子宫肌瘤的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与SYBU蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与SYBU基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断子宫肌瘤的产品至少包括的一对特异扩增SYBU基因的引物如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。
5.一种诊断子宫肌瘤的工具，其特征在于，所述工具包括检测SYBU基因表达的试剂；所述试剂包括检测SYBU基因mRNA的引物和/或探针、检测SYBU蛋白的抗体。
6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述检测SYBU基因mRNA的引物包括SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物对。
7.SYBU基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗子宫肌瘤的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进SYBU基因表达的试剂、促进SYBU基因表达产物稳定性的试剂、促进SYBU基因表达产物活性的试剂、促进SYBU基因表达产物功能的试剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，促进SYBU基因表达的试剂包括含有SYBU基因的试剂、携带SYBU基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有SYBU蛋白质的试剂。
10.一种用于治疗子宫肌瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括7-9中任一项所述的促进剂。
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