CN105603034A - 使用rib7启动子下调基因表达的假囊酵母属的遗传修饰 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在生物体中生产核黄素的方法，所述生物体被遗传修饰为用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一个基因的天然启动子，所述方法包括在合适的培养基中生长所述生物体和从培养基分离核黄素。本发明还涉及属于假囊酵母属的被遗传修饰的生物体，以及这种遗传修饰的生物体在提高核黄素的累积中的用途。

Description

使用RIB7启动子下调基因表达的假囊酵母属的遗传修饰

发明领域

本发明涉及在被遗传修饰的假囊酵母属的生物体中生产核黄素的方法，所述遗传修饰是用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一个基因的天然启动子，所述方法包括在合适的培养基中培养所述生物体和从培养基分离核黄素。本发明还涉及属于假囊酵母属的遗传修饰的生物体，以及这种遗传修饰的生物体在提高核黄素的累积中的用途。

背景技术

所有植物以及许多微生物都生产核黄素。核黄素是细胞代谢的重要组分，因为它充当黄素辅酶黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前体，这两者是氧化还原反应中的重要电子载体并参与感光，DNA保护等。包括人类在内的高等真核生物不能合成核黄素，故而核黄素是以维生素(维生素B2)的状态获得的。人类的维生素B2缺乏导致口腔和咽部粘膜炎症，瘙痒和皮肤褶皱的炎症以及皮肤损伤，结膜炎，视力敏锐度减退和角膜混浊。在婴儿和儿童中，可能会出现生长抑制和体重减轻。因此，必须向人或动物膳食中补充核黄素。因而核黄素被添加到饲料和食品中并且也可以用作食品色素，例如在蛋黄酱或冰淇淋中。

核黄素可通过化学或生物技术生产。化学方法合成核黄素是基于使用例如D-核糖作为起始原料的多步骤过程。生物技术方法生产核黄素是基于几种微生物自然合成核黄素(特别是在合适的原料如植物油的存在下)的潜能。被称为核黄素生产者的微生物包括无名假丝酵母(Candidafamata)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和假囊酵母属物种(Stahmann，2010，IndustrialApplications，TheMycotaX，第二版，Springer，Berlin，Heidelberg，第235-247页)。

特别地，假囊酵母属(先前的棉阿舒囊霉属(Ashbya)；属于酵母科(Saccharomycetaceae)家族)的丝状半子囊菌(hemiascomycete)真菌被鉴定为有效的核黄素生产者。在过去几年中，已对生产核黄素的物种棉假囊酵母(Eremotheciumgossypii)进行了深入研究和分析，并且已对其基因组测序。

在棉假囊酵母(E.gossypii)中，发现核黄素生产阶段与几个核黄素生物合成基因(例如RIB基因RIB1、2、3、4、5和7)的转录的强劲增加相关联。因此，例如通过整合另外的拷贝，已经开发出过表达这些基因的核黄素生产菌株，如在WO95/26406或WO99/61623中所概述的。

此外，已经阐明了假囊酵母属的核黄素生物合成途径(FischerandBacher(2005)Nat.Prod.Rep.22：324-350)。根据对生物合成途径的更佳理解，可通过过表达编码苏氨酸醛缩酶的GLY1(Monschau等人(1998)Appl.Environ.Microbiol.64(11)：4283-4290)以及破坏编码胞质丝氨酸羟甲基转移酶的基因SHM(Schlüpen等人(2003)BiochemJ.369：263-273)来提高在假囊酵母属中的核黄素生产，这两者都干扰对生产核黄素是至关重要的GTP代谢(也参见图1和图2)(Stahmann，2010，IndustrialApplications，TheMycotaX，第二版，Springer，Berlin，Heidelberg，235-247)。发现经由干扰磷酸核糖胺合成来影响核黄素生产的再一个重要的调节基因是编码磷酸核糖基焦磷酸酰胺转移酶的ADE4，其可以被提供为反馈抗性版本(Jimenez等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71：5743-5751)。

然而，尽管有这些发展，但合成效率和生产的核黄素的量(特别是在假囊酵母属真菌的遗传背景下)仍非最佳，而对于食品级和饲料级核黄素的需求不断提高。

因此，需要允许在合适的生物体如假囊酵母属的真菌中进一步增加核黄素产量和累积的手段和方法。

发明目的和内容

本发明解决了这一需要并提供了在假囊酵母属的遗传修饰的生物体中生产核黄素的方法，其中所述修饰是用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一个基因的天然启动子，并使得相比于不具有遗传修饰且与所述被遗传修饰的生物体在相同条件下培养的生物体的核黄素生产增加。

因此，本发明在第一方面提供了在被遗传修饰的假囊酵母属的生物体中生产核黄素的方法，所述遗传修饰是用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一个基因的天然启动子，所述方法包括在合适的培养基中生长所述被遗传修饰的生物体和从培养基分离核黄素。

本发明人出人意料地发现，通过使用RIB7启动子替代基因的天然启动子来调控它们的表达而下调所述基因的表达，核黄素的生产或累积的显著增加成为可能。

使用假囊酵母属比使用其它微生物提供了若干优点。已经深入研究并分析了代表性的物种棉假囊酵母，其基因组已被测序，并存在若干可用的允许其遗传操作和工程改造的分子工具。此外，可以证实假囊酵母属能够在不同的油源和含油废物(Park等人(2004)J.Amer.OilChem.Soc.81：57-62)，以及甘油(Ribeiro等人(2012)J.BasicMicrobiol.52：582-589)中生长，从而允许高效率使用这些廉价的能源作为生产核黄素的原料。

在又一个方面，本发明涉及一种假囊酵母属的累积核黄素的生物体，其被遗传修饰为用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的基因的天然启动子。

在如上定义的方法或生物体的优选实施方案中，被遗传修饰的生物体相比于不具有遗传修饰且与所述被遗传修饰的生物体在相同条件下培养的生物体能够累积更多的核黄素。

在本发明的进一步优选的实施方案中，编码负面影响核黄素生产的蛋白质的基因选自ade12、shm2和bas1组成的组。

在本发明的再进一步优选实施方案，ade12基因的编码序列选自下组：

(a)根据SEQIDNo.10的核酸序列或其功能性部分；

(b)编码根据SEQIDNo.9的多肽的核酸序列或其功能性部分；和

(c)与根据SEQIDNo.10的核酸序列具有至少70％的序列同一性的核酸序列；和/或

shm2基因的编码序列选自下组：

(a)根据SEQIDNo.12的核酸序列或其功能性部分；

(b)编码根据SEQIDNo.11的多肽的核酸序列或其功能性部分；和

(c)与根据SEQIDNo.12的核酸序列具有至少70％的序列同一性的核酸序列；和/或

bas1基因的编码序列选自下组：

(a)根据SEQIDNo.14的核酸序列或其功能性部分；

(b)编码根据SEQIDNo.13的多肽的核酸序列或其功能性部分；和

(c)与根据SEQIDNo.14的核酸序列具有至少70％的序列同一性的核酸序列。

在本发明的另一优选实施方案中，RIB7启动子包括选自下组的核酸序列：

(a)包括根据SEQIDNo.1的核酸序列的核酸序列或其功能性部分，和

(b)与根据SEQIDNo.1的核酸序列具有至少70％的序列同一性的核酸序列或其功能性部分。

在本发明的另一优选实施方案中，如上文所定义的所述遗传修饰的生物体包括至少一种另外的遗传修饰。

在一个特别优选的实施方案中，所述另外的遗传修饰导致选自下组的至少一种活性的改变：

(i)GLY1；

(ii)SHM2；

(iii)ADE4；

(iv)PRS2，4；

(v)PRS3；

(vi)MLS1；

(vii)BAS1

(viii)RIB1；

(ix)RIB2；

(x)RIB3；

(xi)RIB4；

(xii)RIB5；

(xiii)RIB7；

(xiv)FAT1；

(xv)POX1；

(xvi)FOX2；

(xvii)POT1/FOX3；

(xviii)GUA1；

(xix)ADE12；和

(xx)IMPDH。

在进一步优选的实施方案中，所述另外的遗传修饰导致至少一种下述改变：

(i)GLY1活性增加；和/或

(ii)SHM2活性降低或消除；和/或

(iii)ADE4活性增加和/或提供作为反馈抑制抗性的版本；和/或

(iv)PRS2，4活性增加；和/或

(v)PRS3活性增加；和/或

(vi)MLS1活性增加；和/或

(vii)BAS1活性降低或消除；和/或

(viii)RIB1活性增加；和/或

(ix)RIB2活性增加；和/或

(x)RIB3活性增加；和/或

(xi)RIB4活性增加；和/或

(xii)RIB5活性增加；和/或

(xiii)RIB7活性增加；和/或

(xiv)FAT1活性增加；和/或；

(xv)POX1活性增加；和/或；

(xvi)FOX2活性增加；和/或；

(xvii)POT1/FOX3活性增加；和/或；

(xviii)GUA1活性增加；和/或；

(xix)ADE12活性降低或消除；和/或

(xx)IMPDH活性增加。

在进一步的方面，本发明涉及RIB7启动子在降低假囊酵母属的生物体中的至少一种基因的表达中的用途。

在所述用途的优选实施方案中，RIB7启动子包括选自以下组的核酸序列：

(a)包括根据SEQIDNo.1的核酸序列的核酸序列或其功能性部分，和

(b)与根据SEQIDNo.1的核酸序列具有至少70％的序列同一性的核酸序列或其功能性部分。

在所述用途的进一步优选的实施方案中，表达被降低的基因选自ade12、shm2和bas1组成的组。

在另一个方面，本发明涉及使用如上文所定义的生物体生产核黄素。

在如上文所定义的方法、用途或生物体的特别优选实施方案中，所述属于假囊酵母属的生物体是物种阿舒假囊酵母(Eremotheciumashbyi)，榛针孢酵母(Eremotheciumcoryli)，Eremotheciumcymbalariae，棉假囊酵母，Eremotheciumsinecaudum或假囊酵母属物种CID1339。

附图的简要说明

图1绘示了靶向核黄素(维生素B2)的代谢通量。核黄素是从脂肪酸通过乙醛酸循环，糖异生，戊糖磷酸途径以及嘌呤和核黄素合成途径来生产(根据Kato和Park(2012)Biotechnol.Letters34：611-618进行修改)。

图2示出了测定在棉假囊酵母菌株ATCC10895中六个RIB基因和GPD1基因的mRNA水平的定量实时PCR(qRT-PCR)分析。测量在指数生长期(24h)和静止期(120h)期间的RIB基因的相对转录水平。使用棉假囊酵母ACT1基因作为基准来归一化转录水平。结果是一式两份进行的三个独立实验的平均值，并表示为靶基因的cDNA丰度相对于ACT1mRNA水平的比率。

图3示出了为整合到棉假囊酵母基因组而产生的核酸构建体

a)为整合到棉假囊酵母基因组而产生的核酸构建体，以便特异性地降低腺苷酸琥珀酸合成酶的活性。

简称：KanMX4，遗传霉素抗性标记；homA/homB，基因组整合位点；loxP1和loxP2，Cre重组酶的重组位点；RIB7p，棉假囊酵母RIB7基因的启动子；ADE12，编码腺苷酸琥珀酸合成酶的基因的5′-部分

b)为整合到棉假囊酵母基因组而产生的核酸构建体，以便特异性地降低酶活性。

简称：KanMX4，遗传霉素抗性标记；homA/homB，基因组整合位点；loxP1和loxP2，Cre重组酶的重组位点；RIB7p，棉假囊酵母RIB7基因的启动子；RIB1，编码RIB1的基因的5′-部分

图4示出了在RIB7启动子(pRIB7)控制下，RIB1和ADE12基因在棉假囊酵母中表达的定量实时PCR(qRT-PCR)分析。为了比较，测定在指数生长期(24h)和静止期(120h)期间，两种基因在它们的天然启动子(RIB1，ADE12)控制下的表达。使用棉假囊酵母ACT1基因作为基准来归一化转录水平。结果是一式两份进行的三个独立实验的平均值，并表示为靶基因的cDNA丰度相对于ACT1mRNA水平的比率。

图5示出了在RIB7启动子的控制下，在表达ADE12或RIB1的棉假囊酵母中的生物量(空心符号)和核黄素生产(实心符号)的分析。作为参照，使用野生型菌株(wt)ATCC10895。数据是一式两份进行的三个独立实验的平均值。

发明详述

本发明涉及允许通过使用属于假囊酵母属(先前的棉阿舒囊霉属(Ashbya))的被遗传修饰的生物体来生产核黄素的改进的方法和手段，所述遗传修饰是用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一个基因的天然启动子。

虽然将针对特定实施方案来描述本发明，这种描述不应在局限的意义上进行解释。

在详细描述本发明示例性的实施方案之前，给出对于理解本发明重要的定义。如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”和“一个”也包括相应的复数形式，除非上下文另有明确说明。在本发明的上下文中，术语“大约”和“近似”表示本领域技术人员能够理解的仍确保所讨论特征的技术效果的精确度的区间。该术语通常表示从所指示的数值偏差±20％，优选±15％，更优选±10％，甚至更优选±5％。但应该理解的是，术语“包括”不是限制性的。出于本发明的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包括”的优选实施方案。如果在下文中将一个组定义为包括至少某个数量的实施方案，这意味着还包括优选仅由这些实施方案组成的组。此外，在说明书和在权利要求中的术语“第一”，“第二”，“第三”或“(a)”，“(b)”，“(c)”，“(d)”等之类的被用来区分相似的要素并且不一定描述次序或时序。应当理解的是，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的并且在此描述的本发明的实施方案能够以除了本文描述或说明以外的其他次序来操作。如果术语“第一”，“第二”，“第三”或“(a)”，“(b)”，“(c)”，“(d)”，“i”，“ii”等涉及方法或用途或测定法的步骤，那么在步骤之间没有时间或时间间隔连贯性，即步骤可以同时进行或者这些步骤之间有可以存在几秒钟，几分钟，几小时，几天，几周，几个月甚至几年的时间间隔，除非在本申请中另有说明，如在上下文中提出。但是应当理解，本发明并不限于在此描述的具体方法，方案，反应试剂等，因为这些都可以变化。也可以理解的是，本文所使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不意图限制本发明，其仅由所附的权利要求限定。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常的理解相同的含义。

正如上文提到的，本发明在一个方面涉及在假囊酵母属的被遗传修饰的生物体中生产核黄素的方法，其中所述遗传修饰是用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一个基因的天然启动子，所述方法包括：

(i)在合适的培养基中生长所述生物体；和

(ii)从培养基分离核黄素。

如本文所用的术语“核黄素”指的是化合物7，8-二甲基-10-(D-1′-核糖醇基(ribityl)-)异咯嗪及其衍生物。术语“衍生物”指的是7，8-二甲基-10-(D-1′-核糖醇基-)异咯嗪的任何化学修饰形式。这样的衍生物可以是，例如酯、醚、酸、脂质、糖基化形式或盐形式。这些衍生物可以由假囊酵母属生物体本身提供，例如在另外的生化反应中，或可以形成在培养基中，例如由存在于所述培养基中的反应物提供。在具体的实施方案中，核黄素可以以结晶形式提供。这种核黄素晶体可以典型地在细胞中累积。

如本文所用的术语“生产核黄素”意指假囊酵母属生物体能够合成并累积核黄素。术语“累积核黄素”意指合成的核黄素被存储在细胞内和/或排出到周围介质中，在这两种情况下导致在细胞培养物中的核黄素浓度的整体增加。在具体的实施方案中，累积可在合适的分离工艺之后变得可辨别，在所述工艺中获得由细胞产生的所有核黄素，即包括储存在细胞内的核黄素和排出的核黄素。这样的工艺已经如上文所述。

在本发明的上下文中，核黄素生产指的是相比假囊酵母属的野生型菌株是核黄素高产。假囊酵母属的野生型菌株通常每升细胞培养物产生约50至100mg核黄素，特别是在如本文中定义或在实施例中的细胞培养条件下。如本文所用的术语“高产”指的是每升细胞培养物的核黄素生产超过约50至100mg。术语“核黄素高产生物体”或“核黄素高产菌株”相应地指的是每升细胞培养物生产超过约50至100mg核黄素的假囊酵母属生物体或菌株。

假囊酵母属细胞(或任何其它微生物细胞，例如其他来源的对照细胞)的核黄素含量的测定，以及在培养基中的核黄素含量的测定，可以通过领域技术人员已知的任何合适的方法来进行。

在细胞培养物中的核黄素含量的测定(因而也指示每升培养物中以mg计的核黄素的量或累积(包括细胞中的核黄素量)，如上文或下文所述)在优选的测定方法中是基于培养过程和随后的测试过程，该过程包括以下步骤：通常将10ml预培养培养基(55g酵母提取物50，0.5gMgSO₄，用NaOH调节至pH值7.0，并装入950mlH₂O；9.5ml该培养基+0.5ml菜籽油)装入100ml没有挡板的锥形瓶中。烧瓶通常接种在SP培养基板生长了3-4天的遗传修饰的棉假囊酵母或野生型菌株的菌丝体(1cm²)。随后将烧瓶在约30℃和200rpm下孵育约40h。随后，用1ml预培养物接种在250ml有平挡板的锥形瓶中的约25ml主培养培养基(30g酵母提取物50，20g大豆粉，10g甘氨酸，7g谷氨酸钠，2gKH₂PO₄，0.5gMgSO₄，1.1gDL-甲硫氨酸，0.2g肌醇，2.1g甲酸钠，用NaOH调节至pH7.0并装入965mlH₂O；21.2ml主培养培养基+2.8ml菜籽油+0,83ml尿素溶液)。通常称量所有烧瓶以确定孵育前的质量。典型地将培养物在约30℃和200rpm培养约6天。孵育后，通常再次称量烧瓶以确定孵育后的质量，因此，能够计算在培养期间的蒸发效果。该方法可以以多个并行的次序进行，优选5个或更多，更优选10或更多个平行培养物或克隆。测量和进一步培养可优选以三个重复进行，或者至少两个重复以将在培养物中的统计差异考虑在内。

随后，可以通过合适的光度测定法来确定整个生产培养物的核黄素含量，即细胞的核黄素含量(也包括核黄素的任何结晶形式)以及从细胞排出的并存在于培养基中的核黄素。在优选的测定法中，可采用光度测定法，其基于根据上述过程(或根据任何其他培养过程)获得的培养基与烟酰胺溶液的反应。优选地，将250μL的培养物与约4.75mL的40％烟酰胺溶液混合。随后，可在升高的温度，如在约60至80℃，优选在约70℃，孵育混合物例如约30至60min，优选40min。培养优选在黑暗中进行。随后，可以冷却样品(例如约5min)，并与水(例如3ml水)混合。消光的光度测定可在440或450nm的波长进行。

在进一步的实施方案中，可以通过HPLC执行核黄素测定，例如按Schmidt等人(1996)Microbiology142：419-426所描述的。

本发明也设想这种方法的替代和变型，以及与上面公开的方法不同的核黄素测定方法。这种进一步的替代法是本领域技术人员已知的并且可以从适合的教科书或文献来源获取。

如本文所用的术语“假囊酵母属的生物体”或“假囊酵母属生物体”意指任何属于假囊酵母属的生物体，假囊酵母属以前被称为棉阿舒囊霉属和/或与棉阿舒囊霉属同义。这个组至少包括物种阿舒假囊酵母，榛针孢酵母，Eremotheciumcymbalariae，棉假囊酵母(先前的Ashbyagossypii)，Eremotheciumsinecaudum和假囊酵母属物种CID1339。进一步包括这些物种的变体、克隆或基于这些物种的修饰的生物体。

如本文所用的术语“修饰的生物体”指的是假囊酵母属的野生型物种通过诱变和选择和/或基因工程改造的修饰，或者指的是已被遗传修饰的生物体的进一步修饰，例如为改变一个或多个基因的表达来增加核黄素生产而之前工程改造过的假囊酵母属菌株，但是其没有使用RIB7启动子，或者为任何其他目的被修饰或工程改造过的假囊酵母属菌株。该术语具体包括通过普通的诱变方法如化学或UV诱变或差异诱变获得的假囊酵母属物种。在优选的实施方案中，假囊酵母属的生物体是棉假囊酵母而在更优选的实施方案中是棉假囊酵母的菌株ATCC10895。

如本文使用的术语“不具有遗传修饰的生物体”指的是没有用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一个基因的天然启动子所进行遗传修饰，并且除此之外，与本发明的被遗传修饰的生物体具有相同的遗传组成的生物体，即与本发明的被遗传修饰的生物体的唯一的遗传差异是本发明的遗传修饰。因此，不具有遗传修饰的生物体是引入本发明遗传修饰的亲本菌株，优选是棉假囊酵母菌株ATCC10895。亲本菌株可以不包括任何遗传修饰，或者可以包括除本发明以外的遗传修饰。

如本文使用的术语“在合适的培养基中生长所述遗传修饰的生物体”指的是使用任何本领域技术人员已知的、允许如本文所限定的生物体生长并且适合在所述生物体中合成和/或累积核黄素的合适的手段和方法。生长可以按分批工艺或连续发酵工艺进行。优选地，生物体是在脂肪酸油的存在下和任选在非脂质碳源存在下生长。

进行分批或连续发酵工艺的方法是本领域技术人员公知的，并在文献中有描述。培养可以在特定的温度条件下进行，如在15℃和45℃之间，优选在20℃至40℃或15℃和30℃，更优选在20℃和30℃之间，最优选在28℃。在另一个实施方案中，培养可以在广泛的pH范围进行，例如，在pH6和pH9之间，优选在pH6.5和8.5之间，更优选在6.7和7.5之间，最优选在6.8和7之间。

如本文所用的术语“脂肪酸油”指的是废油、非食用油或廉价的种子油。这样的油的优选例子是大豆油或菜籽油。脂肪酸油可以任何合适的量或浓度存在于培养基中，例如以5％(v/v)至40％(v/v)的浓度，例如以5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、22.5％、25％、27.5％、30％、32.5％、35％、37.5％或40％的浓度。优选使用约10％的浓度。

如本文所用的术语“在非脂质碳源存在下”指的是培养是在尽管不属于脂质的组却提供碳原子源的营养物质的存在下进行。优选的是，培养可以在糖营养物质存在下进行，如在葡萄糖、蔗糖或果糖等存在下进行。

在进一步具体的实施方案中，培养基可包含附加物质。这种附加物质的一个例子是大豆粉。大豆粉可优选以1％(w/v)-5％(w/v)的浓度来提供，例如1％、2％、3％、4％、5％(w/v)的浓度。大豆粉具有复合组成，其典型地包括蛋白质、碳水化合物和盐。

附加物质的另一个例子是甘氨酸。甘氨酸优选以1％(w/v)-5％(w/v)的浓度来提供，例如1％、2％、3％、4％、5％(w/v)的浓度。

在一个非常具体的实施方案中，培养基可包含以下成分：酵母提取物、大豆粉、甘氨酸、谷氨酸钠、KH₂PO₄、MgSO₄、DL-甲硫氨酸、肌醇、甲酸钠、尿素和大豆油。在特别优选的实施方案中，培养基可包含以如下面实施例中所述的浓度和量的成分。

如本文所用的术语“从细胞和培养基中分离核黄素”指的是任何用于从细胞中提取核黄素并将核黄素与细胞碎片和培养基成分分离的适当的方法。在优选的实施方案中，分离可以按在Stahmann，IndustrialApplications，第二版，TheMycotax，M.Hofrichter(编辑)，SpringerVerlagBerlinHeidelberg，2010，第235-247页中所述来进行。纯化方法也描述于US4,165,250；Kale等人(2008)BiotechnologyandFermentationProcess，OspreyPublishing；EP0730034A1以及WO2005/014594。

如本文所用的术语“遗传修饰假囊酵母属生物体”或“假囊酵母属的遗传修饰的生物体”意指假囊酵母属生物体通过本领域技术人员已知的任何合适的遗传手段和方法被改变以生产核黄素，特别是增加核黄素的生产。类似地，如本文所用的术语“遗传修饰的假囊酵母属生物体”意指假囊酵母属生物体已通过本领域技术人员已知的任何合适的遗传手段和方法被修饰或改变，使得其合成并累积核黄素，尤其使得其增加核黄素的合成和累积。在本发明中，假囊酵母属生物体被遗传修饰为用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一个基因的天然启动子。

遗传修饰属于假囊酵母属的生物体的方法是本领域技术人员已知的，并且在文献中有描述。它们包括通常使用的用于向假囊酵母属引入遗传元件或材料以便其被容纳在假囊酵母属细胞中，整合到染色体或在染色体外的方法(参见，例如，Jimenez等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71：5743-5751)，或者除去或破坏或修饰存在于假囊酵母属基因组中的遗传元件或序列的方法(参见，例如.Wendland等人(2000)Gene242：381-391和Mateos等人(2006)Appl.Environ.Microbiol.72：5052-5060)。

如本文所用的术语“遗传元件”意指任何能够输送遗传信息的分子单元。它相应地涉及基因，优选天然基因、嵌合基因、外源基因或转基因。术语“基因”指的是表达特定蛋白的核酸分子或其片段，优选指的是包括编码序列上游(5′非编码序列)和下游(3′非编码序列)的调控序列的核酸分子。术语“天然基因”指的是在自然界(如在假囊酵母属的野生型菌株中)发现的具有自己的调控序列的基因。术语“嵌合基因”指的是任何不是天然基因且包括未在自然界中一起发现的调控序列和编码序列的基因。因此，嵌合基因可包括来自不同来源的调控序列和编码序列，以及来自相同来源但以不同于天然存在方式排列的调控序列和编码序列，从而调控序列和编码序列是来自相同生物体的不同基因。根据本发明，“外源基因”指的是通常未在假囊酵母属宿主生物中发现、但通过遗传操作被引入到假囊酵母属宿主生物中的基因。外源基因可以包括生物体天然的而不是被引入到其中的基因，或嵌合基因。术语“转基因”指的是已通过转化方法被引入到基因组中的基因。

术语“编码序列”指的是编码特定的氨基酸序列的DNA序列。术语“调控序列”指的是位于编码序列上游(5’非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性，或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、增强子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

术语“启动子”指的是能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3′。启动子可以整个源于天然基因，或者由源于在自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA节段。通常情况下，由于调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。本领域技术人员应理解的是，不同的启动子可以指导在不同发育阶段的基因表达或应答不同的环境或生理条件。致使基因在大部分时间、在大多数细胞类型中被表达的启动子通常被称为组成型启动子。另一方面，致使基因只在特定情况下，如基于特定因子的存在、生长阶段、温度、pH或特定代谢物等的存在下，才表达的启动子被理解为调控型启动子。

术语“3′非编码序列”指的是位于编码序列下游的DNA序列。它包括多腺苷酸化识别序列和其他编码能影响mRNA加工或基因表达的调控信号的序列。聚腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′端。3′非编码序列可以影响转录，即RNA转录本的存在，RNA加工或稳定性，或相关编码序列的翻译。术语“RNA转录本”指的是从RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所得到的产物。当RNA转录本是DNA序列的完全互补拷贝时，它被称为初级转录本，或者它可以是源自初级转录本的转录后加工的RNA序列并且被称为成熟RNA。术语“mRNA”指的是信使RNA，即无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。

术语“有效连接”指的是在单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得一个的功能受到另一个的影响。在启动子的上下文中，该术语意指编码序列是在启动子的转录控制之下使得该启动子调控编码序列的转录以及因此调控编码序列的表达。用于驱动在假囊酵母属的生物体中的基因表达的调控元件是本领域技术人员已知的，并且在文献中被广泛描述(参见，例如，Jimenez等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71：5743-5751或Maeting等人(1999)FEBSLetters444：15-21)。在本发明的方法中，使用RIB7启动子来下调其基因表达产物对核黄素生产有负面影响的基因的表达。

在本发明的核心实施方案中，假囊酵母属生物体的遗传修饰为用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一个基因的天然启动子。

术语“天然启动子”意在指的是有效连接到在野生型生物体中编码负面影响核黄素生产的蛋白质的基因的启动子，所述野生型生物体即不具有遗传修饰并且具有比RIB7启动子更高启动子活性的假囊酵母属的生物体。天然启动子的活性比RIB7启动子的活性高至少10％、20％、30％或40％，优选至少50％、60％或70％，更优选至少80％、90％或100％，最优选至少150％、200％或250％。

在本发明的含义中，术语“负面影响核黄素生产的蛋白质”旨在包括这样的蛋白质，其在过表达时导致核黄素生产减少和/或在该蛋白质活性降低或消除时导致核黄素生产增加。这样的蛋白质通常由过表达或缺失编码该蛋白质的基因并测量核黄素生产来识别。如果核黄素生产在缺失该基因时增加和/或核黄素生产在过表达该基因时降低，那么由该基因编码的蛋白质是负面影响核黄素生产的蛋白质。特别是，该术语包括作为与核黄素合成途径竞争诸如甘氨酸或肌苷单磷酸的底物的途径的一部分的蛋白质。更具体地，术语“负面影响核黄素生产的蛋白质”包括选自ADE12、SHM2和BAS1组成的组中的一种或多种蛋白质。具体地，该术语不包括RIB7蛋白。

在本发明的意义中，术语“RIB7启动子”旨在包括rib7基因的调控序列，rib7基因编码具有2，5-二氨基-6-核糖胺-4(3H)-嘧啶酮-5′-磷酸(DARPP)还原酶活性的酶。在优选的实施方案中，RIB7启动子包括选自以下组中的核酸序列：

(a)包括根据SEQIDNo.1的核酸序列的核酸序列或其功能性部分，和

(b)与根据SEQIDNo.1的核酸序列具有至少70％的序列同一性的核酸序列或其功能性部分。

本文所公开的所有序列已从棉假囊酵母菌株ATCC10895获得。

RIB7启动子可包括在根据SEQIDNo.1的核酸序列的5′端的一个或多个额外的核苷酸，但在根据SEQIDNo.1的核酸序列的3’端没有额外的核苷酸。

术语“功能性片段”或“功能性部分”旨在指的是根据SEQIDNo.1的启动子序列的小的连续的部分，它基本上具有与根据SEQIDNo.1的启动子相同的活性。对根据SEQIDNo.1的启动子序列的分析揭示了在SEQIDNo.1的位置61-67上存在CCAAT盒并且在SEQIDNo.1的位置85-91上存在TATA盒。因此，任何功能性片段应包括这些元件，使得功能性片段包括至少SEQIDNo.1的核苷酸60至102或50至102，优选至少SEQIDNo.1的核苷酸40至102或30至102，更优选至少SEQIDNo.1的核苷酸20至102或15至102以及最优选至少SEQIDNo.1的核苷酸10至102或5至102。

在替代实施方案中，RIB7启动子包含与SEQIDNO：1的核酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核酸序列，基本上由其组成或由其组成，并且其包括在对应于SEQIDNO：1的启动子序列的核苷酸61-67的位置上的CCAATCA序列，在对应于SEQIDNO：1的启动子序列的核苷酸85-91的位置上的TATAATA序列，其与根据SEQIDNO：1的启动子具有基本上相同的活性。

在本发明的含义中，“序列同一性”表示一个核酸分子中相比于另一核酸分子在5′-3′序列的一致性程度。序列同一性可使用基于各种算法的一系列的程序来测定，如BLASTN，ScanProsite，激光基因软件等等。作为替代方案，可以默认参数使用美国国家生物技术信息中心的BLAST程序包(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。此外，可采用使用“dirtydata”-算法进行序列比较的程序Sequencher(GeneCodesCorp.，AnnArbor，MI，USA)。

序列同一性指的是在根据SEQIDNo.1的核酸序列中超过50、55或60个核苷酸，优选65、70、75、80或85个核苷酸，更优选90、95或100个核苷酸长度，最优选全长的序列同一性程度。

本领域技术人员知晓如何测定启动子活性，并比较不同的启动子的活性。为了这个目的，启动子通常被有效连接到编码报告蛋白例如萤光素酶、绿色荧光蛋白或β-葡萄糖醛酸酶的核酸序列并且测定报告蛋白的活性，任选地，与一个以上的其他启动子的活性进行比较。备选地或额外地，可以例如通过定量实时PCR或NorthernBlot来对有效连接到野生型生物体的启动子的内源性基因的mRNA水平进行相互比较。

术语“基本相同的活性”指的是具有根据SEQIDNo.1的启动子的启动子活性的至少50％或55％，优选至少60、65或70％，更优选至少75、80％、85％或90％，最优选至少92、94、96、98或99％的启动子序列。即，在与SEQIDNo.1的启动子具有基本相同的活性的启动子控制之下的报告蛋白的活性是在根据SEQIDNo.1的启动子控制下的报告蛋白的活性的至少50％或55％，优选至少60、65或70％，更优选至少75％、80％、85％或90％，最优选至少92、94、96、98或99％。

用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一个基因的天然启动子将导致有效连接到RIB7启动子的编码序列(即编码负面影响核黄素生产的蛋白质的序列)的表达减少。

在优选的实施方案中，如上所述的表达减少可以导致有效连接到RIB7启动子的基因的转录率比对照生物体降低约5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或在这些值之间的任何值。在优选的实施方案中，这种基因转录率的降低可以提供用于编码ADE12、SHM2和BAS1中至少其一的核苷酸序列的转录，更优选根据SEQIDNo.10、12和14的核苷酸序列中至少之一或如本文所定义的同源序列。

在进一步优选的实施方案中，表达减少可以导致有效连接到RIB7启动子的基因的mRNA的量比对照生物体减少约5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或在这些值之间的任何值。在优选的实施方案中，这种基因的mRNA的量减少可以提供用于编码ADE12、SHM2和BAS1中至少其一的核苷酸序列的转录，更优选根据SEQIDNo.10、12和14的核苷酸序列中至少之一或如本文所定义的同源序列。

在又一个优选的实施方案中，表达减少可以导致由有效连接到RIB7启动子的基因所编码的多肽或蛋白质的量比对照生物体减少约5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％或在这些值之间的任何值。在优选的实施方案中，这样的由基因所编码的多肽或蛋白质的量的减少可以提供用于ADE12、SHM2和BAS1中至少其一，更优选根据SEQIDNo.9、11和13的氨基酸序列中至少之一或如本文所定义的同源序列。

如本文所用的术语“对照生物体”旨在包括野生型生物体，即不具有任何遗传修饰的生物体，和具有一个或多个除了本发明的遗传修饰之外的遗传修饰的生物体。优选地，对照生物体是用作本发明的遗传修饰的起始生物体的生物体。

为了用RIB7启动子替代基因的天然启动子所进行的遗传修饰可以通过本领域技术人员公知的任何适当的方法来进行。

可用于此上下文中的典型的方法是靶向同源重组。例如，RIB7启动子的侧翼可以是与内源性靶多核苷酸序列(即基因的天然启动子，在其位置应该发生插入)同源的DNA。这样的构建体可以具有或没有选择标记和/或具有或没有阴性选择标记来转化假囊酵母属细胞。通过靶向同源重组而进行的DNA构建体的插入导致RIB7启动子替代基因的天然启动子被插入。

术语“转化”指的是遗传元件，通常是核酸分子(例如包含用于同源重组的构建体的特定盒)，或者是染色体外元件(例如载体或质粒)转移到假囊酵母属细胞，即进入如上文所限定的假囊酵母属的生物体中，其中所述转移造成基因稳定的遗传。假囊酵母属细胞转化条件和相应的技术是本领域技术人员已知的。这些技术包括化学转化，优选乙酸锂转化，如，例如，获取自Jimenez等人(2005)Appl.Environ.Microbiol.71：5743-5751，原生质体融合，弹道冲击转化，电穿孔，显微注射，或任何其他将目的基因或核酸分子导入真菌细胞的方法。

优选地，转化的细胞可以通过选择在引入的遗传元件上包含的标记来进行鉴定。备选地，单独的标记构建体可以与所需的遗传元件共转化。通常，可选择被转化的细胞在选择培养基上生长的能力。选择培养基可掺入抗生素或缺乏对未转化的细胞生长所必需的因子，例如营养或生长因子。导入的标记基因可赋予抗生素抗性，或编码必需的生长因子或酶，从而当在转化的宿主中表达时，允许在选择培养基上生长。如果可以直接或间接地检测被表达的标记蛋白，那么可通过检测标记蛋白来选择转化的细胞。

标记蛋白可以单独表达或与另一种蛋白质融合表达。标记蛋白可以被检测，例如，通过其酶活性。备选地，抗体可用于检测标记蛋白，或者例如，目的蛋白上的分子标签。表达标记蛋白或标签的细胞可以例如通过视觉，或通过诸如FACS或使用抗体的淘选技术来选择。优选地，也可以使用任何在假囊酵母属的细胞中发挥功能的适当的标记，如本领域技术人员已知的。更优选地，可采用提供抗卡那霉素、潮霉素、氨基糖苷G418或诺尔丝菌素(也称为NTC或ClonNAT)抗性，以及具有在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸或色氨酸的培养基上生长能力的标记。

当使用如上所述的选择标记，如G418或ClonNAT抗性标记，或者任何其他合适的标记时，可使用Cre-lox体系的序列，其是标记两端的侧翼。在Cre重组酶表达时，该体系允许在构建体插入后的选择标记消除和随后的再利用。还设想的是使用本领域技术人员公知的其他类似的重组酶体系。

在具体的实施方案中，标记也可以与位点特异性核酸酶的靶位点结合，如锌指核酸酶(ZFN)或能够在体内切割特异的DNA靶序列的大范围核酸酶。这种体系的具体的例子是TALEN(转录激活子样效应子核酸酶)体系，即人工限制酶，它是由将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域融合产生的。TAL效应子是通常由黄单胞菌或相关物种分泌的，或由其衍生的并已被修饰的蛋白质。TAL效应子的DNA结合结构域可包含高度保守的序列，例如约33-34个氨基酸，除了高度可变的第12和第13个氨基酸(重复可变区(RepeatVariableDiresidue)或RVD)，并且通常显示出与特定核苷酸识别的很强的相关性。在这个原则的基础上，DNA结合结构域可以通过选择含有对应于靶基因DNA序列的重复可变区的重复节段的组合来设计。TALENDNA切割结构域可以衍生自合适的核酸酶。例如，可使用来自FokI内切核酸酶或者来自FokI内切核酸酶变体的DNA切割结构域来构建杂交核酸酶。由于以二聚体发挥功能的FokI结构域的特殊性，TALEN可以优选地提供为独立的实体。

在具体的实施方案中，TALENDNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基数目和两个个体TALEN结合位点之间的碱基数目可以根据插入到假囊酵母属基因组中的构建体的序列进行修饰或优化，以提供高水平的活性。TALENS或TALEN组分可被工程改造或修饰，以靶向任何所需的DNA序列，如包括在要插入到生物体的基因组中的基因的同源端之间的选择标记的DNA序列。重组所需的酶活性可以或者按这样提供(例如类似于在假囊酵母属中已建立的REMI法)，或者它可以与在构建体中的选择盒一起提供，导致其在核酸酶活性开始时被除去。工程改造可以按照适当的方法进行，例如描述于Zhang等人(2011)NatureBiotechnol29：143-148或Reyon等人(2012)NatureBiotechnol30：460-465。

另一种用于从假囊酵母属细胞的基因组中除去标记序列的系统是CRISPR(规律成簇间隔短回文重复)/CAS(CRISPR关联的)系统，其已经显示出促进RNA指导的位点特异性DNA切割并且其可以用于基因组工程改造(参见，例如，SanderandYoung(2014)NatureBiotechnol.32：347-355)。该系统采用Cas9作为核酸酶，其由crRNA和tracrRNA指导来切割特定的DNA序列。成熟的crRNA：tracrRNA复合物经由在crRNA上的间隔序列和在靶DNA上的前间区序列(protospacer)之间的碱基配对，将Cas9引导至靶DNA，所述靶DNA毗邻前间区序列邻近基序(PAM)。Cas9然后介导靶DNA的切割以产生前间区序列内的双链断裂。代替crRNA和tracrRNA，可将导向RNA设计成包括模仿tracrRNA-crRNA复合物的发夹(Jinek等人(2012)Science337(6096)：816-821)。

在本发明的一个优选实施方案中，可以按在下文的实施例中的描述进行同源重组。特别优选的是使用转化盒，其包含G418或ClonNAT抗性标记与loxP序列的组合，如下所述。

典型地，遗传元件可以在转化盒或表达盒的帮助下被引入到假囊酵母属细胞中。按照本发明，术语“转化盒”指的是含有外源基因，并且除了外源基因外还具有促进假囊酵母属细胞转化的元件的特定载体。术语“表达盒”指的是含有外源基因并且除了外源基因外还具有使该基因在外源宿主(特别是在假囊酵母属细胞)中的表达的元件的特定载体。

可在采用如上文定义的表达盒或转化盒的形式的遗传元件上相应地提供RIB7启动子，特别是制备用于通过同源重组而进行基因组整合的表达盒或转化盒。还设想的是提供质粒或载体。术语“质粒”和“载体”指的是经常携带不属于细胞中心代谢部分的基因，并且常常是环状双链DNA片段形式的染色体外元件。更优选地，术语质粒指的是适于本领域技术人员已知的假囊酵母属转化，特别是适合于在假囊酵母属中表达蛋白质的任何质粒，例如能够在其他生物体(优选细菌，特别是大肠杆菌)中自主复制的质粒，并且其可以被制备，例如被消化用于假囊酵母属的基因组插入转化。

在具体的实施方案中，遗传元件可以包括微生物表达系统。此类表达系统和表达载体可以包含指导外源蛋白的高水平表达的调控序列。

在本发明的优选的实施方案中，如上文所定义的遗传修饰的生物体，例如，包括用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的基因的天然启动子的修饰的生物体，能够比没有本发明的遗传修饰的对照生物体累积更多的核黄素。如本文所用的术语“对照生物体”指的是与用作遗传修饰的起始生物体的生物体具有相同或非常相似的遗传背景的生物体。优选地，对照生物体可以是用于如本文所述的遗传修饰的生物体。如果遗传修饰是在野生型生物体中进行，该野生型生物体可以被认为是对照生物体。在进一步的实施方案中，如果遗传修饰是在任何其他或相同的野生型生物体中进行，那么任何野生型生物体都可以被认为是对照生物体。如果遗传修饰是在如上文定义的核黄素高产生物体或菌株中进行，没有本发明的遗传修饰的所述核黄素高产生物体可以被认为是对照生物体。

如本文所述的基因修饰可导致由生物体生产或累积的核黄素量比对照生物体的量增加。在具体的实施方案中，增加可取决于在其中进行修饰的生物体的遗传背景，和/或修饰的数量，和/或降低或消除活性的技术，和/或其它因素，例如培养条件，培养基条件等，或任何上述参数和因素的组合。在具体的实施方案中，由该生物体所生产或积累的核黄素的量相比不具有遗传修饰且与所述被遗传修饰的生物体在相同条件下培养的生物体，增加可以是至少0.3％、0.5％、0.7％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％或大于300％。

核黄素生产或累积以及因此相比于对照生物体，该生产在修饰的生物体中的增加的测定可以按上述进行，即通过基于特定的培养条件及使用如上文所述的基于烟酰胺的光度测定法，遵照细胞培养核黄素测定方法。在具体的实施方案，测定可以按在下面提供的实施例中的描述来执行。本发明也设想了进一步的测定方法或程序，包括可能在将来被开发的方法或方法的改善。

在进一步的实施方案中，本发明涉及如上文定义的遗传修饰的生物体或使用所述遗传修饰的生物体生产或累积核黄素的方法，其中所述生物体包含用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一种基因的天然启动子的遗传修饰，并且其中所述生物体包括至少一个另外的遗传修饰。

如本文所用的术语“另外的遗传修饰”指的是除了本发明的遗传修饰外的生物体的任何进一步的遗传或生化修饰，如，例如基因或基因组区域的缺失，基因或基因片段的过表达等修饰。此另外的遗传修饰可以已经存在于根据本发明遗传修饰的生物体中，或者可以在对生物体进行本发明的遗传修饰之后引入。

在一个优选的实施方案中，如上所定义的生物体的另外的遗传修饰涉及影响核黄素生产的的元件。这样的元件可能已经是公知的，或者可能在将来被发现。优选地，另外的遗传修饰可以涉及对在假囊酵母属，更优选棉假囊酵母中生产核黄素有公知影响的活性。已知具有这样的影响的活性的例子，包括GLY1；SHM2；ADE4；PRS2，4；PRS3；MLS1；BAS1；RIB1；RIB2；RIB3；RIB4；RIB5；RIB7；FAT1；POX1；FOX2；POT1/FOX3；GUA1；ADE12；和IMPDH。

相应地，遗传修饰可对假囊酵母属优选棉假囊酵母的基因gly1；shm2；ade4；prs2，4；prs3；mls1；bas1；rib1；rib2；rib3；rib4；rib5；rib7；fat1；pox1；fox2；pot1/fox3；gua1；ade12和/或imd3中的一个或多个进行遗传修饰。

应该理解的是，如果本发明的遗传修饰涉及用RIB7启动子替代天然ADE12启动子，那么另外的遗传修饰不包括ADE12活性的降低或消除。类似地，如果本发明的遗传修饰涉及用RIB7启动子替代天然SHM2启动子，那么另外的遗传修饰不包括SHM2活性的降低或消除。此外，如果在本发明的遗传修饰涉及用RIB7启动子替代天然BAS1启动子，那么另外的遗传修饰不包括BAS1活性的降低或消除。

在进一步优选的实施方案中，另外的遗传修饰可以导致以下改变中的至少一种：(i)GLY1活性增加；和/或(ii)SHM2活性降低或消除；和/或(iii)ADE4活性增加和/或提供作为反馈抑制抗性的版本；和/或(iv)PRS2，4活性增加；和/或(v)PRS3活性增加；和/或(vi)MLS1活性增加；和/或(vii)BAS1活性降低或消除；和/或(viii)RIB1活性增加；和/或(ix)RIB2活性增加；和/或(x)RIB3活性增加；和/或(xi)RIB4活性增加；和/或(xii)RIB5活性增加；和/或(xiii)RIB7活性增加；和/或(xiv)FAT1活性增加；和/或(xv)POX1活性增加；和/或(xvi)FOX2活性增加；和/或(xvii)POT1/FOX3活性增加；和/或(xviii)GUA1活性增加；(xix)ADE12活性降低或消除；和/或(xx)IMPDH活性增加。

在进一步优选的实施方案中，ADE12的活性是由包含SEQIDNO：9的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：10的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：9的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：10的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，SHM2的活性是由包含SEQIDNO：11的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：12的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：11的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：12的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，BAS1的活性是由包含SEQIDNO：13的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：14的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：13的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：14的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，GLY1的活性是由包含SEQIDNO：15的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：16的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：15的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：16的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，ADE4的活性是由包含SEQIDNO：17的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：18的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：17的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：18的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，PRS2，4的活性是由包含SEQIDNO：19的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：20的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：19的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：20的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，PRS3的活性是由包含SEQIDNO：21的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：22的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：21的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：22的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，MLS1的活性是由包含SEQIDNO：23的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：24的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：23的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：24的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，RIB1的活性是由包含SEQIDNO：25的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：26的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：25的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：26的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，RIB2的活性是由包含SEQIDNO：27的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：28的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：27的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：28的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，RIB3的活性是由包含SEQIDNO：29的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：30的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：29的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：30的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，RIB4的活性是由包含SEQIDNO：31的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：32的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：31的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：32的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，RIB5的活性是由包含SEQIDNO：33的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：34的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：33的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：34的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，RIB7的活性是由包含SEQIDNO：35的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：36的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：35的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：36的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在优选的实施方案中，FAT1的活性是由包含SEQIDNO：37的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：38的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：37的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：38的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在优选的实施方案中，POX1的活性是由包含SEQIDNO：39的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：40的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：39的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：40的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，FOX2的活性是由包含SEQIDNO：41的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：42的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：41的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：42的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，POT1/FOX3的活性是由包含SEQIDNO：43的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：44的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：43的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：44的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，GUA1的活性是由包含SEQIDNO：45的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：46的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：45的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：46的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

在进一步优选的实施方案中，IMPDH的活性是由包含SEQIDNO：47的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者是由包含SEQIDNO：48的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码，或者由包括与SEQIDNO：47的氨基酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成的多肽或其功能性部分或片段提供，或者由包括与SEQIDNO：48的核苷酸序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，基本上由其组成或由其组成的核酸或其功能性部分或片段编码。

如在本文描述的序列的上下文中使用的术语“其功能性部分或片段”指的是多肽和编码核苷酸序列的连续节段或部分，它们分别是能够执行与全长多肽基本相同的酶反应或是编码能够执行与全长多肽基本相同的酶反应的多肽。多肽的功能性部分或片段的酶活性是全长多肽的酶活性的至少10％、20％、30％或40％、优选至少45％、50％、55％或60％、更优选至少65％、70％、75％或80％、甚至更优选至少82％、85％、88％或90％，最优选至少92％、94％、96％、98％或100％。

为按上文所述测定酶的活性，通常是将纯化的酶或含有酶的细胞裂解物，与酶的底物一起孵育，并最终测定在适当缓冲液中的对于其活性所需的任何辅助因子以及酶反应产物的量。

在具体的实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，或(ii)PRS2，4活性，或(iii)PRS3活性，或(iv)MLS1，或(v)FAT1活性，或(vi)POX1活性，或(vii)FOX2活性；或(viii)POT1/FOX3活性或(ix)IMPDH活性；或(x)GUA1可以增加。

在进一步的具体实施方案中，GLY1活性和(i)RIB1活性，或(ii)RIB2活性，或(iii)RIB3活性，或(iv)RIB4活性，或(v)RIB5活性，或(vi)RIB7活性可以增加。

在进一步的具体实施方案中，GLY1活性可以增加和(i)SHM2活性，(ii)BAS1，或(iii)ADE12活性可以降低或消除。

在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，和/或(ii)PRS2，4活性，和/或(iii)PRS3活性，和/或(iv)MLS1活性可以增加。在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)RIB1活性，和/或(ii)RIB2活性和/或(iii)RIB3活性，和/或(iv)RIB4活性，和/或(v)RIB5活性，和/或(vi)RIB7活性可以增加。

在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，和/或(ii)PRS2，4活性，和/或(iii)PRS3活性，和/或(iv)MLS1活性和/或(v)RIB1活性，和/或(vi)RIB2活性和/或(vii)RIB3活性，和/或(viii)RIB4活性，和/或(ix)RIB5活性，和/或(x)RIB7活性可以增加。

在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，和/或(ii)PRS2，4活性，和/或(iii)PRS3活性，和/或(iv)MLS1活性和/或(v)RIB1活性，和/或(vi)RIB2活性和/或(vii)RIB3活性，和/或(viii)RIB4活性，和/或(ix)RIB5活性，和/或(x)RIB7活性可以增加和/或(x)SHM2活性可以降低或消除，和/或(xi)BAS1活性和/或(x)ADE12活性可以降低或消除。

在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，和(ii)PRS2，4活性，以及(iii)PRS3活性可以增加。

在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，和(ii)PRS2，4活性，以及(iii)PRS3活性可以增加，和(iv)SHM2活性可以降低或消除，和(v)BAS1活性和(vi)ADE12活性可以降低或消除。

在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)RIB1活性，和(ii)RIB2活性和(iii)RIB3活性，和(iv)RIB4活性，和(v)RIB5活性，以及(vi)RIB7活性可以增加。

在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)RIB1活性，和(ii)RIB2活性和(iii)RIB3活性，和(iv)RIB4活性，和(v)RIB5活性，以及(vi)RIB7活性可以增加，和(vii)SHM2活性可以降低或消除，和(viii)BAS1和(ix)ADE12活性活性可以降低或消除。

在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，和(ii)PRS2，4活性，以及(iii)PRS3活性可以增加，和(iv)MLS1活性和(v)RIB1活性，和(vi)RIB2活性和(vii)RIB3活性，和(viii)RIB4活性，和(ix)RIB5活性，以及(x)RIB7活性可以增加。

在另一组实施方案中，GLY1活性和(i)ADE4活性，和(ii)PRS2，4活性，以及(iii)PRS3活性可以增加，(iv)MLS1活性和(v)RIB1活性，和(vi)RIB2活性和(vii)RIB3活性，和(viii)RIB4活性，和(ix)RIB5活性，以及(x)RIB7活性可以增加并且(x)SHM2活性可以降低或消除，以及(xi)BAS1活性和(x)ADE12活性可以降低或消除。

GLY1活性的增加可能是由于编码GLY1的核酸分子的过表达。ADE4活性的增加可能是由于编码ADE4的核酸分子的过表达。PRS2，4活性的增加可能是由于编码PRS2，4的核酸分子的过表达。PRS3活性的增加可能是由于编码PRS3的核酸分子的过表达。MLS1活性的增加可能是由于编码MLS1的核酸分子的过表达。RIB1活性的增加可能是由于编码RIB1的核酸分子的过表达。RIB2活性的增加可能是由于编码RIB2的核酸分子的过表达。RIB3活性的增加可能是由于编码RIB3的核酸分子的过表达。RIB4活性的增加可能是由于编码RIB4的核酸分子的过表达。RIB5活性的增加可能是由于编码RIB5的核酸分子的过表达。RIB7活性的增加可能是由于编码RIB7的核酸分子的过表达。FAT1活性的增加可能是由于编码FAT1的核酸分子的过表达。POX1活性的增加可能是由于编码POX1的核酸分子的过表达。FOX2活性的增加可能是由于编码FOX2的核酸分子的过表达。POT1/FOX3活性的增加可能是由于编码POT1/FOX3的核酸分子的过表达。IMPDH活性的增加可能是由于编码的IMPDH的核酸分子的过表达。SHM2活性的降低或消除可能是由于shm2基因的失活。BAS1活性的降低或消除可能由于bas1基因的失活。GUA1活性的增加可能由于编码GUA1的核酸分子的过表达。ADE12活性的降低或消除可能由于ade12基因的失活。

编码GLY1、ADE4、PRS2、4、PRS3、MLS1、RIB1、RIB2、RIB3、RIB4、RIB5、RIB7、FAT1、POX1、FOX2、POT1/FOX3、GUA1和/或IMPDH的核酸分子的过表达可本领域技术人员已知的过程、方法和工艺来进行。

在一个实施方案中，编码目的蛋白质的核酸的过表达是通过用强启动子替代有效连接到要在野生型生物体中过表达的核酸分子的启动子，例如内源性gly1启动子来完成的。在本发明的意义中，术语“强启动子”旨在指的是活性比有效连接到要在野生型生物体中过表达的核酸分子的启动子高的启动子，如具有比内源性gly1基因的启动子更高的活性的启动子。优选地，强启动子的活性比有效连接到要在野生型生物体中过表达的核酸分子的启动子的活性高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或大于1000％，例如具有比内源性gly1基因的启动子更高的活性的启动子。测定启动子活性并比较不同的启动子的活性的方法在本文中讨论。用于本发明中的强启动子的例子是TEF1启动子、CTS2启动子、RIB3启动子、GPD启动子、FBA1启动子、PGK1启动子、MET3启动子、ICL1启动子和RIB4启动子。特别优选GPD启动子。

如上文所定义的过表达，在进一步的实施方案中，可通过在基因组中提供一个以上拷贝的遗传元件来完成。这样的第二、第三、第四、第五或更多拷贝的核酸序列可以是与内源的遗传结构完全或几乎相同的拷贝，或者它们可以构成其重组修饰。例如，待过表达的核酸序列如编码GLY1的核酸序列可与其基因组环境一起获取，优选包括其启动子结构，任选地还包含如上文所定义的3′非编码序列或如上文所定义的额外的5′非编码序列，如增强子元件等，它们来自靶标假囊酵母属生物体的基因组，或来自近亲，例如如果靶标不是棉假囊酵母则来自棉假囊酵母。同源侧翼可以在大约100到500bp的范围内使用。然而，原则上也可以使用更小的侧翼或更大的侧翼，如高达1000bp或大于1000bp。

如上所述的第二或更多拷贝的基因可以随后被重新引入生物体中并放置在染色体上。整合位点可以是在原始拷贝附近，或者，优选地，在不同的位置。可以通过对整合所必需的同源侧翼的选择来预先选定插入。插入位点可以相应地根据基因组中已知的特征来确定，例如染色体区域的转录活性，染色体区域的甲基化状态，与第一拷贝(原始基因)的潜在距离，第一拷贝(原始基因)的方向，更多的插入基因的存在等等。优选的是插入位点是在基因间区域和/或使用转录活性位点。在某些实施方案中，优选不修饰已知基因(尤其是必需基因)的ORF和/或调节区。

如上文所定义的过表达，在进一步的实施方案中，可由密码子使用的优化来完成，例如通过如上文定义的基因的密码子使用对在生物体中被转录或表达最多，或者最高度表达的基因(相比于持家基因如β-肌动蛋白或β-微管蛋白)的密码子使用进行改编。此类高度表达的基因的密码子使用的实例可以包括假囊酵母属生物体，优选棉假囊酵母的一组5、10、15、20、25或30或更多的最高度表达的基因的密码子使用。

过表达可进一步通过相对于假囊酵母属生物体，优选棉假囊酵母，的所有或几乎所有，或90％或80％或75％或70％的转录基因的整体密码子使用来优化密码子使用而实现。这样的方法可以涉及基因的密码子使用的检查和与衍生自假囊酵母属生物体优选棉假囊酵母的基因组序列(特别是生物体如棉假囊酵母的注释的基因组序列)的整体密码子使用的比较。

如本文所用的术语“失活”指的是编码酶活性的遗传元件的修饰，如在分子基础上，由遗传元件表达的转录本或由所述遗传元件编码的蛋白质或酶活性的修饰，所述修饰导致活性功能的全部或部分丧失。部分失活或活性功能的部分丧失，例如，可导致野生型或全酶活性的约95％、90％、85％、80％、75％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％或小于3％或在所提及数值之间的任何值的残余酶活性。设想的失活的实例是SHM2、ADE12和BAS1中的至少一个的至少一个基因组拷贝，优选全部基因组拷贝的功能性破坏或缺失。在优选的实施方案中，待删除的遗传元件或基因组拷贝包括SEQIDNO：10、12和/或14的核苷酸序列或其如上文所定义的同源序列，部分地包含SEQIDNO：10、12和/或14的核苷酸序列或其如上文所定义的同源序列，基本上由SEQIDNO：10、12和/或14的核苷酸序列或其如上文所定义的同源序列组成，或由SEQIDNO：10、12和/或14的核苷酸序列或其如上文所定义的同源序列组成。删除可以包括遗传元件的编码区(ORF)或非编码部分的两个或更多个残基的任何区域，例如来自两个残基到整个基因或基因座。在具体的实施方案中，缺失也可以影响较小的区域，如结构域，蛋白质子部分，重复序列或少于约50个连续碱基对的片段，但是也可以出现较大的缺失。删除可以包括一个蛋白质亚基或一个蛋白质亚基以上的区域，例如在蛋白质或酶是由几个亚基组成的情形下。缺失或功能破坏优选在SHM2、ADE12或BAS1的编码序列或ORF中发生。也设想的是，如上文所定义的SHM2、ADE12或BAS1的3′非编码序列，如上文所定义的SHM2、ADE12或BAS1的启动子序列(也是5′非编码区)，或如上文所定义的与SHM2、ADE12或BAS1相关联的调控序列被功能破坏。这样的功能破坏或修饰可导致，例如，转录本的表达降低或不稳定性，转录起始困难等，从而提供减少量的酶活性的或完全不存在酶活性。在进一步的实施方案中，失活也可以是由于SHM2、ADE12或BAS1的遗传元件的编码区(ORF)和/或非编码区中的突变、重排和/或插入，例如在调控序列中。突变可以，例如是点突变或2-或3-核苷酸交换，这导致所编码的氨基酸序列的修饰，或将一个或多个移框引入ORF，或引入过早终止密码子，或从ORF中除去终止密码子，和/或引入用于细胞机制(machinery)的识别信号，例如聚腺苷酸化机制或引入用于蛋白质降解机制的破坏信号等。这样的修饰的序列部分可以产生不再提供蛋白质的野生型版本的活性的蛋白。蛋白质可以相应地，例如，在相关的酶核心区中具有取代，从而导致功能丧失，或可以由不同的氨基酸(由于移框)组成，因而不能正常工作。所述修饰的序列部分可以进一步引起不稳定的转录而易于降解。此外，蛋白质的靶向可能会受到影响。

如上概述的遗传元件的功能破坏或缺失，以及在这些遗传元件中引入点突变可以通过本领域技术人员公知的任何适当的方法来执行，例如，通过如上文所述的同源重组。

在进一步的具体实施方案中，失活可能是由于发生在RNA转录本水平的特定失活过程。这样的失活可能是由于SHM2、ADE12和/或BAS1的RNA转录本的序列特异性识别以及这些转录本的随后降解。对于这种方法，可使用来自高等真核生物的已知的RNA干扰或反义方法。虽然真菌如假囊酵母属被假定为缺乏RNAi的必要活性，本发明设想通过基因工程引入所需活性。如何能够类似于酿酒酵母的情况，建立用于假囊酵母属的RNAi的一个例子获自Drinnenberg等人(2009)Science326(5952)：544-550。因此，本发明设想提供特异于SHM2、ADE12或BAS1，或它们的组合的任何一个转录本的siRNA种类。

术语“siRNA”指的是特定类型的反义分子，即诱导RNA干扰(RNAi)途径的小抑制RNA双链。这些分子的长度可以变化，并且可以是在长度，例如约18-28个核苷酸之间，例如具有18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个核苷酸的长度。优选地，该分子具有21、22或23个核苷酸的长度。根据本发明的siRNA分子可与它们的靶mRNA，优选在反义链上含有不同程度的互补性。siRNA可能在有义链和/或反义链的5′或3′端具有未配对的突出碱基。术语“siRNA”包括两个独立链的双链，以及可以形成包含双链区的发夹结构的单链。优选地，siRNA可以是双链，其中双链的siRNA分子包含第一和第二条链，siRNA分子的每条链长度为约18至约23个核苷酸的长度，siRNA分子的第一条链包含通过RNA干扰与靶RNA具有足够的互补性的核苷酸序列，并且siRNA分子的第二条链包括与第一条链互补的核苷酸序列。这种干扰分子的生产可以通过从调节型启动子生产siRNA而进一步受到控制和调节。

在本发明的又一个具体实施方案中，失活可能是由于在蛋白质或酶水平发生的特异性失活过程。这种失活可能是由于特异性结合分子，如小分子与SHM2、ADE12和/或BAS1的酶或蛋白质的结合。

在本发明的上下文中的“小分子”指的是有机小化合物，优选具有生物活性的，即生物分子，但优选不是聚合物。这样的有机化合物可具有任何合适的形式或化学性质。所述化合物可以是天然化合物，例如次级代谢物或从头设计并生成的人工化合物。在本发明的一个实施方案中，小分子能够阻断SHM2、ADE12和/或BAS1与底物的结合，或能够阻断SHM2、ADE12和/或BAS1的活性。例如，小分子可以结合到SHM2、ADE12和/或BAS1并由此诱导分子和蛋白质之间的紧密的或不可逆的相互作用，从而导致蛋白质或酶的正常(野生型)功能的丧失或减少，例如，如果涉及酶的核心或结合口袋。鉴定和制备此种小分子的方法和技术，以及检测小分子的检测法是本领域技术人员公知的并且也是本文设想的。

如果假囊酵母属的生物体被遗传修饰为通过独立的复制载体减少或增加一种以上的蛋白质的活性，理想的是每一个载体或质粒具有不同的筛选手段并且应该与其他构建体缺乏同源性，以保持稳定的表达并防止构建体之间的元素重排。

本发明还设想使用RIB7启动子来降低在假囊酵母属的生物体中的一个或多个基因的表达。基因或每个基因的表达可降低至少10％、20％、30％或40％，优选至少50％、60％或70％，更优选至少75％、80％、85％或90％，并且最优选至少92％、94％或96％。

优选地，通过用RIB7启动子替代所述一个或多个基因的天然启动子来降低表达。术语“天然”启动子和“RIB7启动子”已经如上文所定义。

在另一个实施方案中，本发明涉及使用如本文所讨论的假囊酵母属的经遗传修饰的生物体来生产核黄素。

生物体可以是如上文所述的任何假囊酵母属物种，优选棉假囊酵母。使用假囊酵母属来增加核黄素的累积可以包括使用适宜的发酵环境，营养，自发酵容器的核黄素提取等。本发明因此设想了相应的生产核黄素，或其如上文所定义的衍生物的方法。在具体的实施方案中，作为用于本发明遗传修饰的起始生物体的假囊酵母属物种是每升培养基能够累积50-100mg核黄素，更优选超过每升培养基50-100mg核黄素的生物体。在进一步的实施方案中，假囊酵母属物种可以是已被遗传修饰的生物体。遗传修饰可以是如本文所述的修饰，例如对核黄素的生产或累积有直接的影响，或者可以具有不同的效果，例如在其它途径中，或关注于生产除了核黄素以外的其它生化实体如PUFA、脂肪酸、氨基酸、糖等，关注于使用某些碳源的可能性，关注于使用某些氮源等的可能性，关注于基因组或基因组区域的稳定性，允许或改善同源重组的步骤，允许异源基因或启动子等的表达，提高细胞培养行为如成丝，菌丝体片段化，pH耐受性，密度耐受性，盐的使用，盐耐受性，关注于细胞的生产速率，关注于对抗生素的抗性或其他任何可能对核黄素生产或核黄素和其他产品共生产有利的性状。

在进一步的方面，本发明涉及使用如上文定义的用于核黄素生产的生物体，特别是被遗传修饰的生物体，包括上述用RIB7启动子替代编码负面调控核黄素生产的蛋白质的基因的天然启动子的遗传修饰，以及任选地其他的遗传修饰，例如，如上文所定义的基因gly1；shm2；ade4；prs2，4；prs3；mls1；bas1；rib1；rib2；rib3；rib4；rib5；fat1；pox1；fox2；pot1/fox3；ade12；gua1；imd3；和/或rib7的修饰。

来自如上文定义的至少一种生物体的核黄素产品可以是为符合其用途而已被修饰和调整的制品。这样的制品可以包括适合作为动物饲料或作为人类食品产品，作为膳食补充剂或药物制剂，真菌片剂，婴儿和儿童食品产品等的可食用制品。核黄素制品可进一步包括用于工业化生产的核黄素。进一步设想用于化学合成工艺，药理用途等的核黄素制品。

以下实施例和附图是用于说明的目的。因此可以理解，所述实施例和附图不应被解释为限制。本领域技术人员将显然能够设想本文中提出的原则的进一步的变形。

实施例1

RIB7基因表达的表征及在棉假囊酵母中相应的RIB7启动子

在棉假囊酵母中负责正确的核黄素生产的所有RIB基因(RIB1、RIB2、RIB3、RIB4、RIB5、RIB7)的转录分析表明，RIB7基因在野生型菌株ATCC10895中呈现出非常低的mRNA水平。定量实时PCR(qRT-PCR)分析表明RIB7的转录率比GPD基因低约200倍(图2)。因此，RIB7启动子可以是用作在棉假囊酵母中靶向降低基因表达的工具。

因此，鉴定了RIB7基因的启动子序列(RIB7p)，其中包括核苷酸-1到-102(SEQIDNo.1)，并将其克隆到质粒JR3573(SEQIDNo.2)，该质粒可被用作产生所有低表达构建体的模板。该质粒含有融合到kanMX4标记的3′端的RIB7启动子序列。标记盒还包含两个lox序列，其使抗性标记基因在CRE介导的重组后有效的回收(Guldener等人(1996)Nucl.AcidsRes.24：2519-2524)。

实施例2

使用RIB7启动子特异降低在棉假囊酵母中的基因表达的构建体的产生

对于ADE12基因表达的靶向降低，将天然的ADE12基因放在上面描述的棉假囊酵母的弱RIB7启动子(RIB7p)的控制下。

为设计相应的低表达盒，将质粒JR3573用作PCR模板，用寡核苷酸loxPK-RIB7p-ADE12-ins5(SEQIDNo.3)和loxPK-RIB7p-ADE12-ins3(SEQIDNo.4)提供在基因组的正确位点用于整合PCR扩增子的同源重组端(homA及homB)。在这种情况下，5′重组序列被设计为替代天然ADE12启动子序列的核苷酸-1至-50。将所得的1962bp的PCR扩增子(图3a，SEQIDNo.5)纯化并用于棉假囊酵母属株ATCC10895的转化。

为了进一步支持RIB7启动子是适合用于特异降低基因表达的工具这一理论，将强转录的RIB1基因放在这种弱启动子的控制之下。RIB1基因编码核黄素生物合成酶，该酶催化合成的限速步骤。因此，特异降低基因表达应该导致较低的酶活性，从而导致明显降低但不完全抑制的核黄素合成。

为设计相应的低表达盒，将质粒JR3573用作PCR模板，用寡核苷酸RIB7p-RIB1-ins5(SEQIDNo.6)和RIB7p-RIB1-ins3(SEQIDNo.7)提供在基因组的正确位点用于整合PCR扩增子的同源重组端(homA及homB)。在这种情况下，5′重组序列被设计为替代天然RIB1启动子序列的核苷酸-1至-42。将所得的1962bp的PCR扩增子(图3b，SEQIDNo.8)纯化并用于棉假囊酵母属株ATCC10895的转化。通过分析PCR和DNA测序来确认低表达模决的正确的基因组整合以及相应的启动子替代(还参见实施例3)。

实施例3

基于使用RIB7启动子的携带低表达构建体的棉假囊酵母属株的产生和分子分析

如上所述(参见实施例2)生成携带在弱棉假囊酵母RIB7启动子控制下的相应基因的ADE12和RIB1下调构建体。使用棉假囊酵母属株ATCC10895的孢子，按照Schlüpen等人(2003)Biochem.J.369：263-273andJimenez等人(2005)Appl.Environm.Microbiol.71：5743-5751提供的方案转化经纯化的片段。将所得的转化体在28℃生长并在含有250μg/mL遗传霉素(G418，SigmaAldrich)的MA2培养基(10g/L细菌用蛋白胨，10g/L葡萄糖，1g/L酵母提取物，0.3g/LMyoinosit，20g/L琼脂)中筛选。

随后，使用DNeasyPlantMaxiKit(Qiagen，Germany)，根据制造商的推荐，分离每一转化体的基因组DNA。然后将基因组DNA用于不同的PCR分析，检测在5′-和3′-整合位点处的正确的启动子替代。此外，对所有扩增子进行DNA测序以验证正确的整合事件。

针对单孢子分离选择阳性转化体以确保获得同核型菌株。单孢子分离如下：在将转化体的菌丝体溶解于500μL盐水-Triton溶液(9g/LNaCl，600μL/LTritonX-100)后，加入500μL正己烷并混合。将混合物在14000rpm离心1min，并且将包含于上层相中的单孢子于含有250μg/mL遗传霉素(G418)的SP培养基平板(3g/L大豆粉，3g/L酵母提取物，3g/L麦芽提取物，20g/L玉米面，1g/L消泡剂，10g/L葡萄糖，30g/L琼脂，pH6.8)上铺板。

再次如上所述用PCR分析来测试从单孢子分离得到的菌株。阳性菌株用于CRE重组以消除KanMX选择标记。按照Guldener等人(1996)Nucl.AcidsRes.24：2519-2524所述进行用于CRE重组的转化。所得的菌株进行PCR分析以确认选择标记删除事件。选择已显示出删除了选择标记并且同时正确整合相应的低表达模决的菌株，用于ADE12和RIB1的mRNA水平的qRT-PCR分析，并与野生型菌株ATCC10895的ADE12和RIB1的mRNA水平比较。此外，将这些菌株在摇瓶实验中生长以测试核黄素生产，并测定与参照棉假囊酵母属株ATCC10895相比的相应产率(参见实施例4)。

实施例4

携带基于使用RIB7启动子的低表达构建体的棉假囊酵母属株的mRNA水平分析和相应的核黄素生产

进行ADE12以及RIB1基因表达的下调以显示RIB7启动子在棉假囊酵母中特异性下调基因表达的适用性，因此，产生具有期望特性(例如在ADE12的情况下，原养型和更高的核黄素生产)的菌株。通过qRT-PCR实验分析RIB7启动子的适用性，以显示特异性下调基因表达。此外，在摇瓶实验中测试上述菌株，并且测定核黄素滴度。作为参照，在所有实验并行地分析亲本菌株ATCC10895。

用LightCycler480实时PCR仪(Roche，德国)，使用SYBRgreenImastermix(Roche，德国)并按照制造商的说明进行qRT-PCR。如先前所述(Mateos等人(2006)Appl.Environm.Microbiol.72：5052-5060)获得总RNA样品，使用TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit(Roche，德国)制备cDNA样品并且选择RIB1和ADE12基因的特异性引物序列。所有的实时PCR反应都一式两份进行并且有至少两个独立的实验。使用LightCycler480软件进行定量分析。

使用分光光度法测定法来测量总(细胞内和细胞外的)核黄素生产水平。在28℃，150rpm下，在MA2培养基中以回转振荡培养用于核黄素分析的菌株。向1mL培养物中加入1M体积的HCl并在100℃培养30min。冷却样品后，用0.5mm玻璃珠(Sigma-Aldrich)和剧烈涡流来裂解菌丝体。离心后，在Varioskan微量滴定板读数器(ThermoScientific)上通过分光光度(λexc＝450nm)来测定上清液中的核黄素(含有细胞外和细胞内核黄素)浓度。校准曲线是用纯的核黄素(Sigma-Aldrich)进行，并以与样本相同的方式处理。

如图4所示的qRT-PCR结果表明在携带RIB7p-ADE12构建体的菌株中的ADE12基因的mRNA水平极度降低。ADE12基因表达比携带在天然启动子控制下的ADE12基因的野生型菌株中低约70倍。然而，这些转录水平足以维持没有腺嘌呤补充的突变体的生长。

通过使用RIB7启动子下调RIB1基因获得类似的结果。在这种情况下，RIB1基因表达比在野生型ATCC10895中降低了3倍。这些结果表明，RIB7启动子的确是适合用于在棉假囊酵母中靶向下调基因表达的工具。

为了说明使用RIB7启动子下调特异性基因表达可用作靶向修饰核黄素生产的工具，分析携带ADE12和RIB1表达不足的构建体的菌株中的核黄素合成。如图5所示，在孵育7天后，携带在棉假囊酵母的弱RIB7启动子控制下的ADE12基因的菌株ATCC10895：：RIB7p-ADE12显示出比野生型菌株ATCC10895的核黄素生产增加超过2倍。正如预期的，携带RIB7p-RIB1构建体的菌株ATCC10895显示出核黄素生产的显著降低(约3倍的降低)。因此，替换RIB1天然启动子导致酶活性降低从而明显降低核黄素生物合成。

这两个例子表明，通过使用RIB7启动子特异性下调基因表达可以有助于产生具有用于工业发酵过程所需特性的棉假囊酵母属株。因此，RIB7启动子是适合用于棉假囊酵母菌株的代谢工程的新的工具。

Claims (15)

1.一种在假囊酵母属的生物体中生产核黄素的方法，所述生物体被遗传修饰为用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一个基因的天然启动子，所述方法包括：

(i)在合适的培养基中生长所述被遗传修饰的生物体；和

(ii)从培养基分离核黄素。

2.一种假囊酵母属的累积核黄素的生物体，其被遗传修饰为用RIB7启动子替代编码负面影响核黄素生产的蛋白质的至少一个基因的天然启动子。

3.权利要求1的方法或权利要求2的生物体，其中与没有遗传修饰且与所述被遗传修饰的生物体在相同的条件下培养的生物体相比，所述被遗传修饰的生物体能够累积更多的核黄素。

4.权利要求1或3的方法，或权利要求2或3的生物体，其中所述负面影响核黄素生产的基因选自ade12、shm2和bas1组成的组。

5.权利要求4的方法或生物体，其中ade12基因的编码序列选自下组：

(a)根据SEQIDNo.10的核酸序列或其功能性部分；

(b)编码根据SEQIDNo.9的多肽的核酸序列或其功能性部分；和

(c)与根据SEQIDNo.10的核酸序列具有至少70％的序列同一性的核酸序列；和/或

shm2基因的编码序列选自下组：

(a)根据SEQIDNo.12的核酸序列或其功能性部分；

(b)编码根据SEQIDNo.11的多肽的核酸序列或其功能性部分；和

(c)与根据SEQIDNo.12的核酸序列具有至少70％的序列同一性的核酸序列；和/或

bas1基因的编码序列选自下组：

(a)根据SEQIDNo.14的核酸序列或其功能性部分；

(b)编码根据SEQIDNo.13的多肽的核酸序列或其功能性部分；和

(c)与根据SEQIDNo.14的核酸序列具有至少70％的序列同一性的核酸序列。

6.权利要求1或3至5中任一项的方法或权利要求2至5中任一项的生物体，其中RIB7启动子包括选自下组的核酸序列：

(a)包括根据SEQIDNo.1的核酸序列的核酸序列或其功能性部分，和

(b)与根据SEQIDNo.1的核酸序列具有至少70％的序列同一性的核酸序列或其功能性部分。

7.权利要求1或3至6中任一项的方法或权利要求2至6中任一项的生物体，其中所述生物体包括至少一个另外的遗传修饰。

8.权利要求7的方法或生物体，其中所述另外的遗传修饰导致选自下组的至少一种活性的改变：

9.权利要求7或8的方法或生物体，其中所述另外的遗传修饰导致以下改变中的至少一种：

(i)GLY1活性增加；和/或

(ii)SHM2活性降低或消除；和/或

(iii)ADE4活性增加和/或提供作为反馈抑制抗性的版本；和/或

(iv)PRS2，4活性增加；和/或

(v)PRS3活性增加；和/或

(vi)MLS1活性增加；和/或

(vii)BAS1活性降低或消除；和/或

(viii)RIB1活性增加；和/或

(ix)RIB2活性增加；和/或

(x)RIB3活性增加；和/或

(xi)RIB4活性增加；和/或

(xii)RIB5活性增加；和/或

(xiii)RIB7活性增加；和/或

(xiv)FAT1活性增加；和/或；

(xv)POX1活性增加；和/或；

(xvi)FOX2活性增加；和/或；

(xvii)POT1/FOX3活性增加；和/或；

(xviii)GUA1活性增加；和/或；

(xix)ADE12活性降低或消除；和/或

(xx)IMPDH活性增加。

10.RIB7启动子在降低假囊酵母属的生物体中的至少一种基因的表达中的用途。

11.权利要求10的用途，其中RIB7启动子包括选自以下组的核酸序列：

(a)包括根据SEQIDNo.1的核酸序列的核酸序列或其功能性部分，和

(b)与根据SEQIDNo.1的核酸序列具有至少70％的序列同一性的核酸序列或其功能性部分。

12.权利要求10或11的用途，其中所述基因选自ade12、shm2和bas1组成的组。

13.权利要求10至12中任一项的用途，其中所述表达通过用RIB7启动子替代基因的天然启动子而被降低。

14.权利要求2至9中任一项所限定的生物体在生产核黄素中的用途。

15.权利要求1或3至9中任一项的方法，权利要求2至9中任一项的生物体，或者权利要求10至14中任一项的用途，其中所述假囊酵母属的生物体是物种阿舒假囊酵母(Eremotheciumashbyi)，榛针孢酵母(Eremotheciumcoryli)，Eremotheciumcymbalariae，棉假囊酵母(Eremotheciumgossypii)，Eremotheciumsinecaudum或假囊酵母属物种CID1339。