CN105596357B - 桃叶珊瑚苷在制备治疗或预防癫痫药物中的应用 - Google Patents

Abstract

桃叶珊瑚苷在制备治疗或预防癫痫药物中的应用，本发明利用LiCl‑Pilo致癫痫大鼠模型对桃叶珊瑚苷进行药效学实验，结果显示桃叶珊瑚苷促进海马神经元自噬和抑制坏死性凋亡，降低癫痫发作诱导的神经元损伤。桃叶珊瑚苷是杜仲提取物，纯度为98％以上，可用于制备预防和治疗癫痫疾病的药物或者膳食补充剂。

Description

桃叶珊瑚苷在制备治疗或预防癫痫药物中的应用

技术领域

本发明属于中药提取物用途领域，特别涉及桃叶珊瑚苷在制备治疗或预防癫痫药物中新用途。

背景技术

癫痫是一种常见的神经系统疾病，是慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征，以脑神经元异常放电引起反复痫性发作为特征。目前，我国约有900多万癫痫患者，且发病人数正在逐年增加，对个人、家庭和社会造成了极大影响。癫痫已成为危害人类健康的重要神经系统疾病。因此，阐明癫痫发病机制和开发有效的癫痫病防治药物具有现实意义。

癫痫的治疗方法有手术、药物、饮食等，以药物治疗为主。当前临床常见的抗癫痫药物包括苯妥英钠、丙戊酸、卡马西平、奥卡西平、拉莫三嗪等，虽然大部分癫痫患者在使用上述癫痫药物后能取得较好疗效、痫性发作频率减少，但仍有约三分之一患者因药物不良反应和药物抵抗而无法得到有效控制，最终发展成为难治性癫痫。该类癫痫患者常由发热性惊厥、脑创伤、脑肿瘤、脑卒中、脑炎、癫痫持续状态等引起。难治性癫痫患者最常见的病理特征是海马神经元丢失和海马硬化，其发病机制有神经元损伤、炎症和胶质增生、异常神经再生、苔藓纤维发芽、病理性神经网络形成等，其中尤以海马神经元损伤作为最主要的始发因素。目前临床抗癫痫药物通过调控离子通道、提高γ-氨基丁酸(GABA)受体功能、抑制NMDA受体活性、降低兴奋性神经递质释放等发挥作用。然而，大多数临床抗癫痫药物仅以控制急性痫性发作为主要目的，而对癫痫发生过程本身、以及难治性癫痫的最主要始发因素等未能有效控制。因此，针对癫痫发生的主要机制、开发高效低毒抗癫痫药物、减少难治性癫痫发生已成为防治癫痫疾病的主要目标之一。

发明内容

本发明针对现有技术的问题，开发出了一种新的高效低毒抗癫痫药物，提供一种桃叶珊瑚苷在制备治疗或预防癫痫的药物中的应用。

桃叶珊瑚苷(aucubin,AU)是一种环烯醚萜类化合物，化学名为β-D-吡喃葡萄糖苷，分子式为C₁₅H₂₂O₉，分子量346.33，熔点181℃，易溶于水、甲醇和乙醇等极性溶剂，几乎不溶于氯仿、乙醚和石油醚等弱极性溶剂。该化合物主要存在于杜仲(Eucommia ulmoidesOliver)、山茱萸科植物桃叶珊瑚属(Aucubachinensis)、车前科植物车前属(Plantago)等植物中，是杜仲、车前草、地黄等中草药的有效成分之一，具有保肝解毒、抗炎、抗氧化、促进胶原合成、抗骨质疏松及营养神经元等多种药理作用。桃叶珊瑚苷结构式如下：

我们通过研究发现桃叶珊瑚苷可用于制备治疗或预防癫痫的药物。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

桃叶珊瑚苷在制备治疗癫痫药物中的应用。

所述桃叶珊瑚苷是以含桃叶珊瑚苷的植物提取物的形式使用。

本发明优选所述桃叶珊瑚苷以含桃叶珊瑚苷的杜仲提取物形式使用。

所述桃叶珊瑚苷可以是以含桃叶珊瑚苷的植物提取物为原料提取制备而成。

本发明的桃叶珊瑚苷是优选以杜仲翅果为原料提取制备而成。

本发明所制得的桃叶珊瑚苷纯度可达98％以上。

本发明的以桃叶珊瑚苷为主要活性成分可以与其他治疗或预防癫痫药物活性成分(如丙戊酸钠、拉莫三嗪、左乙拉西坦、卡马西平、奥卡西平、加巴喷丁、托吡酯等)配合使用制成药物，共同治疗或预防癫痫药物。

本发明得到的所述药物含有预防或治疗有效量的桃叶珊瑚苷以及任选的药学可接受的载体和/或辅料。

由于，杜仲是杜仲科植物杜仲的干燥树皮，是第三世纪冰川运动遗留下来的“活化石”，是我国特有的经济树种。具有补肝肾、强筋骨、降血压、安胎等功效，它是我国特有药材，药用历史悠久，在临床上广泛应用。桃叶珊瑚苷在杜仲树皮、叶、翅果中均有分布，其中杜仲翅果中含量高达7％-11％。桃叶珊瑚苷具有护肝解毒、抗炎、抗氧化、延缓衰老等多种药理活性，极具开发价值。然而，目前国内外均未见桃叶珊瑚苷对癫痫神经保护作用的报道。桃叶珊瑚苷具有烯醇式的缩醛结构，易受温度、氧化作用影响，在酸性和碱性条件下极易水解、聚合。因此，桃叶珊瑚苷合成困难，目前利用乙醇、甲醇等极性溶剂从植物中提取获得。杜仲翅果中含有丰富的桃叶珊瑚苷，是桃叶珊瑚苷的重要来源，从杜仲翅果中提取桃叶珊瑚苷的工艺方法较少。此外，现有的提纯工艺试剂消耗量大、生产周期长、收率低，严重浪费资源。

本发明的桃叶珊瑚苷的制备中，优选是以杜仲翅果为原料，通过杜仲翅果脱壳，果仁粉碎，经过石油醚脱脂，乙醇提取，加丙酮冷却结晶，再经硅胶柱纯化，重结晶或浓缩干燥，得到桃叶珊瑚苷单体。

进一步优选，所述桃叶珊瑚苷是通过以下制备方法得到，包括以下步骤：

①脱脂：将干燥的杜仲翅果脱壳得果仁，果仁粉碎，石油醚脱脂，得到脱脂粗料；

②提取：将所述脱脂粗料加入无水乙醇进行提取，过滤，合并提取液，40℃-60℃浓缩至提取液体积的1/5-1/12，得到浓缩提取液；

③结晶：将所述浓缩提取液加入丙酮饱和溶解，冷却结晶，得到桃叶珊瑚苷粗品；

④硅胶柱层析：将所述桃叶珊瑚苷粗品与硅胶拌样，再加入硅胶层析，然后用乙酸乙酯和甲醇组成的溶液依次洗脱，收集洗脱液；所述依次洗脱时所用乙酸乙酯和甲醇组成的溶液中乙酸乙酯的浓度由高至低逐渐降低；

⑤重结晶或浓缩干燥：将所述洗脱液室温下结晶，过滤，乙酸乙酯清洗结晶，干燥，得到桃叶珊瑚苷单体产品；或是将所述洗脱液40℃-60℃浓缩，冷冻干燥，得到桃叶珊瑚苷单体产品。

优选方案：步骤①中所述粉碎后为40-50目。

优选方案：步骤①中石油醚用量为杜仲翅果果仁的6-10倍量，脱脂次数为2-4次，脱脂时间为1.5-4小时。

优选方案：步骤②中无水乙醇用量为原料的6-12倍量，提取次数为3-5次，每次提取时间为2-5小时。

优选方案：步骤③中丙酮饱和溶解后，将溶解液置于4-10℃冷却，结晶12-72小时。

优选方案：步骤④中层析用硅胶与桃叶珊瑚苷粗品的质量比为6：1-11：1。

优选方案：步骤④中用乙酸乙酯和甲醇组成的溶液依次洗脱的顺序为：依次按体积比例乙酸乙酯比甲醇为1：0、10：1、6：1、4：1的次序洗脱，用量分别为3-5BV、3-6BV、4-6BV、3-5BV。

优选方案：步骤⑤中将洗脱液置于室温下结晶12-72小时，过滤后结晶用乙酸乙酯清洗三次。

下面对本发明做进一步解释和说明

本发明可以以含桃叶珊瑚苷的提取物为活性物质可制成药物制剂，所述提取物可以是浸膏形式的物质，可以是粉末状物质，根据制剂的不同需要制成不同的状态。含桃叶珊瑚苷的提取物优选为杜仲提取物，可以通过采用粉碎、压榨、研磨、过筛、萃取、水提、醇沉、酯提、层析、过滤等方法得到。

本发明所述药物是可以以桃叶珊瑚苷为主要活性成分或与其他活性成分配合使用制成药物，制备的药物可含有药物赋形剂或载体。所述药物赋形剂或载体包括抗氧化剂、螯合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、分散剂、润滑剂、肠溶材料、pH调节剂、矫味剂、色素等。

本发明所述药物是桃叶珊瑚苷经加工制备的适合服用的药物制剂，可以是以下任何剂型：注射剂、溶液剂、乳剂、口服液、混悬剂、栓剂、膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、冻干粉针剂、散剂、颗粒剂、冲剂、胶囊剂、丸剂、片剂、贴剂，需要时可制成缓释制剂。

本发明的应用可降低急性或反复痫性发作，用于各种形式的癫痫反复发作、癫痫持续状态和难治性癫痫等。所述癫痫可以是热性惊厥、脑外伤、脑肿瘤、脑炎、脑卒中等原因导致的癫痫或癫痫持续状态，以及由神经元损伤后炎症胶质增生、海马神经再生等引起的癫痫发生。本发明是通过桃叶珊瑚苷促进大脑海马区细胞自噬(autophagy)和抑制坏死性凋亡(necroptosis)进而保护神经元。癫痫或癫痫持续状态可引起急性和持久性中枢神经系统损害；癫痫持续状态后容易遗留严重甚至是永久性的神经系统病变，由于其复杂的发病机制，可进一步发展为慢性自发性癫痫而反复发作，严重威胁患者的健康。发明人通过研究发现，本发明中所用实验药物桃叶珊瑚苷可有效地缓解和减轻癫痫持续状态后的急性海马损伤，对海马各区(包括CA1区、CA3区、门(Hilus)区、齿状回(DG)区)的神经元损伤均可有效抑制，且这一效应可通过促进海马神经元中保护性自噬作用和抑制坏死性凋亡等特殊凋亡形式而达到。自噬(autophagy)是细胞溶酶体降解途径的重要形式，其主要指标包括Beclin-1蛋白的表达水平、以及LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达的比值(反应了LC3BⅠ向LC3BⅡ的转化状况)；坏死性凋亡(necroptosis)是细胞常规凋亡(apoptosis)途径之外的另一种重要凋亡途径，在程序性细胞死亡中具有重要作用，其主要指标包括MLKL和RIP-1蛋白的表达水平，有别于常规凋亡(apoptosis)途径中以Bax、Bcl-2等凋亡蛋白指标为主。桃叶珊瑚苷能缓解和减轻癫痫持续状态后急性海马损伤的效应，主要通过上调自噬指标(Beclin-1、LC3BⅡ/Ⅰ)、下调坏死性凋亡指标(MLKL、RIP-1)的表达获得，其独特的作用机制和途径，应区别于一般意义上的抗氧化应激、抗脂质过氧化损伤作用，以及常规的细胞凋亡(apoptosis)或坏死(necrosis)途径等，具有鲜明的独创性和新颖性。桃叶珊瑚苷具有对急性癫痫发作后的神经保护作用，并可藉此减轻癫痫持续状态后导致的海马病变，进而延缓或抑制慢性自发性癫痫的发生；因此，桃叶珊瑚苷可用于制备防治癫痫的药物。

本发明的桃叶珊瑚苷药物制剂可以是通过杜仲翅果经提取加工制成药物活性物质，基于该物质为原料制成适合服用的药物制剂。

附图说明

图1是桃叶珊瑚苷样品色谱图。甲醇与水梯度洗脱检测制备的桃叶珊瑚苷产品。

图2是桃叶珊瑚苷增加癫痫发作24h后存活神经元。Nissl染色：大鼠癫痫持续性发作终止24h后海马切片分析海马神经元存活变化。A、B、C、D为各组大鼠CA1区存活神经元分布图，E、F、G、H为各组大鼠CA3区存活神经元分布图，I、J、K、L为为各组大鼠DG区存活神经元分布图，M、N、O、P为为各组大鼠门区存活神经元分布图，Q、R、S、T分别为CA1区、CA3区、DG区、门区存活神经元定量统计图。###表示与正常对照组比较P<0.0001，*，**，***表示与癫痫模型组比较，P<0.05,0.01，0.0001。

图3是桃叶珊瑚苷增加癫痫发作72h后存活神经元。Nissl染色：大鼠癫痫持续性发作终止72h后海马切片分析海马神经元存活变化。A、B、C、D为各组大鼠CA1区存活神经元分布图，E、F、G、H为各组大鼠CA3区存活神经元分布图，I、J、K、L为为各组大鼠DG区存活神经元分布图，M、N、O、P为为各组大鼠门区存活神经元分布图，Q、R、S、T分别为CA1区、CA3区、DG区、门区存活神经元定量统计图。#，###表示与正常对照组比较P<0.05，0.0001，*,***表示与癫痫模型组比较，P<0.05，0.0001。

图4.桃叶珊瑚苷减轻癫痫发作24h后神经元凋亡。TUNEL染色：大鼠癫痫持续性发作终止24h后海马切片分析海马神经元凋亡变化。A、B、C、D为各组大鼠CA1区凋亡神经元分布图，E、F、G、H为各组大鼠CA3区凋亡神经元分布图，I、J、K、L为为各组大鼠DG区凋亡神经元分布图，M、N、O、P为为各组大鼠门区凋亡神经元分布图，Q、R、S、T分别为CA1区、CA3区、DG区、门区凋亡神经元定量统计图。###表示与正常对照组比较P<0.0001，***表示与癫痫模型组比较，P<0.0001。

图5.桃叶珊瑚苷减轻癫痫发作72h后神经元凋亡。TUNEL染色：大鼠癫痫持续性发作终止72h后海马切片分析海马神经元凋亡变化。A、B、C、D为各组大鼠CA1区凋亡神经元分布图，E、F、G、H为各组大鼠CA3区凋亡神经元分布图，I、J、K、L为为各组大鼠DG区凋亡神经元分布图，M、N、O、P为为各组大鼠门区凋亡神经元分布图，Q、R、S、T分别为CA1区、CA3区、DG区、门区凋亡神经元定量统计图。***表示与癫痫模型组比较，P<0.0001。

图6.桃叶珊瑚苷降低癫痫发作24h后海马MLKL水平。免疫组化：大鼠癫痫持续性发作终止24h后MLKL在海马中的分布和表达。A、B、C、D为各组大鼠CA1区MLKL表达分布图，E、F、G、H为各组大鼠CA3区MLKL表达分布图，I、J、K、L为为各组大鼠DG区MLKL表达分布图，M、N、O、P为为各组大鼠门区MLKL表达分布图，Q、R、S、T分别为CA1区、CA3区、DG区、门区MLKL表达定量统计图。###表示与正常对照组比较P<0.0001，**，***表示与癫痫模型组比较，P<0.01，0.0001。

图7.桃叶珊瑚苷降低癫痫发作72h后海马MLKL水平。免疫组化：大鼠癫痫持续性发作终止72h后MLKL在海马中的分布和表达。A、B、C、D为各组大鼠CA1区MLKL表达分布图，E、F、G、H为各组大鼠CA3区MLKL表达分布图，I、J、K、L为为各组大鼠DG区MLKL表达分布图，M、N、O、P为为各组大鼠门区MLKL表达分布图，Q、R、S、T分别为CA1区、CA3区、DG区、门区MLKL表达定量统计图。##，###表示与正常对照组比较P<0.01，0.0001，*，**，***表示与癫痫模型组比较，P<0.05,0.01，0.0001。

图8.桃叶珊瑚苷降低癫痫发作24h后海马RIP-1水平。免疫组化：大鼠癫痫持续性发作终止24h后RIP在海马中的分布和表达。A、B、C、D为各组大鼠CA1区RIP-1表达分布图，E、F、G、H为各组大鼠CA3区RIP-1表达分布图，I、J、K、L为为各组大鼠DG区RIP-1表达分布图，M、N、O、P为为各组大鼠门区RIP-1表达分布图，Q、R、S、T分别为CA1区、CA3区、DG区、门区RIP-1表达定量统计图。#，###表示与正常对照组比较P<0.05，0.0001，*，***表示与癫痫模型组比较，P<0.05,0.0001。

图9.桃叶珊瑚苷降低癫痫发作72h后海马RIP-1水平。免疫组化:大鼠癫痫持续性发作终止72h后RIP在海马中的分布和表达。A、B、C、D为各组大鼠CA1区RIP-1表达分布图，E、F、G、H为各组大鼠CA3区RIP-1表达分布图，I、J、K、L为为各组大鼠DG区RIP-1表达分布图，M、N、O、P为为各组大鼠门区RIP-1表达分布图，Q、R、S、T分别为CA1区、CA3区、DG区、门区RIP-1表达定量统计图。#，##，###表示与正常对照组比较P<0.05，0.01，0.0001，*，***表示与癫痫模型组比较，P<0.05,0.0001。

图10.桃叶珊瑚苷降低癫痫发作24h后海马MLKL和RIP-1蛋白表达。Western-blot分析：大鼠癫痫持续性发作终止24h后MLKL和RIP-1在海马中的蛋白表达。A为各组大鼠海马MLKL和RIP-1蛋白表达图谱，B为大鼠海马MLKL蛋白表达定量统计图，C为大鼠海马RIP-1蛋白表达定量统计图。##表示与正常对照组比较P<0.01，*，**表示与癫痫模型组比较，P<0.05，0.01。

图11.桃叶珊瑚苷增加癫痫发作24h后海马Beclin-1和LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达。Western-blot分析：大鼠癫痫持续性发作终止24h后Beclin-1和LC3BⅡ/Ⅰ在海马中的蛋白表达。A、B为各组大鼠海马Beclin-1蛋白表达图谱和定量统计图。C、D为各组大鼠海马LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达图谱和定量统计图。#表示与正常对照组比较P<0.05，*，**表示与癫痫模型组比较，P<0.05，0.01。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步的解释和说明。但是，本发明不限于这些实施例。

实施例1杜仲翅果提取物桃叶珊瑚苷的制备

将杜仲翅果脱壳，果仁粉碎至40目，取10kg投入提取罐，加60L石油醚脱脂，脱脂2次，每次3小时，滤出药渣为脱脂粗品。加80L无水乙醇至脱脂粗品超声提取2小时，提取3次，合并提取液。提取液40℃减压浓缩至原体积的1/8并回收乙醇。浓缩液加丙酮饱和溶解，7℃结晶48小时，所得粗品与硅胶1：1拌样。取10L硅胶装柱，将所拌样品加入硅胶柱，依次用3BV乙酸乙酯(体积比乙酸乙酯：甲醇＝1：0)、4BV乙酸乙酯/甲醇(体积比乙酸乙酯：甲醇＝10：1)、5BV乙酸乙酯/甲醇(体积比乙酸乙酯：甲醇＝6：1)、4BV乙酸乙酯/甲醇溶液洗脱(体积比乙酸乙酯：甲醇＝4：1)，同时用薄层色谱法检测，收集桃叶珊瑚苷组分，洗脱液置于室温下结晶48小时，过滤，结晶用乙酸乙酯清洗三次，冷冻干燥即得桃叶珊瑚苷单体，经HPLC法测定，纯度达99.8％(图1)。

实施例2

取实施例1所得的桃叶珊瑚苷用于抗癫痫保护实验研究。

1实验方法

1.1大鼠癫痫持续性发作模型的建立和实验分组

将6-8周龄，体重为230-270g，健康雄性SD大鼠210只，随机抽取30只作为正常对照组，余大鼠通过随机抽取后均分为癫痫模型组、桃叶珊瑚苷低剂量组、桃叶珊瑚苷高剂量组3组动物造模组，每组60只大鼠，包括癫痫持续性发作后2h、4h、8h、24h、72h共5个时间点，予以腹腔注射氯化锂(LiCl,125mg/kg,i.p.)，18-20h后腹腔注射新鲜配制的匹罗卡品(PILO,20mg/kg,i.p.)，密切观察大鼠行为学变化，按Racine’s评分标准评估大鼠癫痫发作强度和发作持续时间。每组动物造模过程中，只有发作强度达到4-5级并且4级或以上发作持续不间断达60min以上大鼠才有条件入选实验研究组，在每组动物造模过程中去除不符合入选条件的SD大鼠、并最终随机选取符合条件的6只大鼠入选各时间点的实验研究组。正常对照组大鼠腹腔注射相同体积的生理盐水代替匹罗卡品。实验分为正常对照组、癫痫模型组、桃叶珊瑚苷低剂量组(5mg/kg)、桃叶珊瑚苷高剂量组(10mg/kg)，时间点包括癫痫持续性发作终止后2h、4h、8h、24h、72h。

1.2分组给药实验

桃叶珊瑚苷低剂量组(5mg/kg)、高剂量组(10mg/kg)中，SD大鼠在造模及入选前应用桃叶珊瑚苷灌胃，一天一次，连续给药14d,并于最后一次灌胃后，腹腔注射氯化锂-匹罗卡品进行造模。正常对照组和癫痫模型组分别给予相同体积的生理盐水。具体给药方案见表1。

表1.实验分组、给药方式和剂量

1.3检测指标

大鼠终止发作后于2h、4h、8h、24h、72h，水合氯醛麻醉，断头，取脑组织置于4％多聚甲醛固定，Nissl染色检测存活神经元数量，TUNEL分析神经元死亡数量，免疫组织化学检测RIP-1、MLKL在脑组织中的分布和表达。在相应时间点麻醉、断头，分离大鼠海马，Western-blot检测LC3、Rip-1、Beclin-1、MLKL蛋白表达水平。

1.4统计方法

实验数据以Mean±SD形式表示，所有数据进行Newman–Keuls检验后，进行单因素方差分析。采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，P<0.05为有统计学差异。

2实验结果

2.1大鼠癫痫持续性发作后海马神经元存活和损伤变化

与对照组相比，癫痫持续性发作24h、72h后大鼠海马CA1区、CA3区、DG区、门区存活神经元数目(图2A,B,E,F,I,J,M,N和图3A,B,E,F,I,J,M,N)显著减少；大鼠癫痫持续性发作24h后死亡神经元数目(图4A,B,E,F,I,J,M,N)显著增加，实验结果表明癫痫持续性发作大鼠模型制备成功，且急性痫性发作可导致海马神经损伤可能参与了慢性癫痫发生。

2.2桃叶珊瑚苷减轻大鼠癫痫持续性发作诱导的神经元损伤

与癫痫模型组相比，桃叶珊瑚苷显著增加大鼠海马CA1区、DG区和门区存活神经元数目且呈剂量依赖性，而对发作24h后大鼠CA3区作用不显著(图2C,D,G,H,K,L,O,P,Q,R,S,T和图3C,D,G,H,K,L,O,P,Q,R,S,T)，表明桃叶珊瑚苷保护大鼠CA3区神经元呈现空间分布差异。桃叶珊瑚苷显著降低癫痫发作24h后凋亡神经元数目(图4C,D,G,H,K,L,O,P,Q,R,S,T)，而癫痫发作72h后海马凋亡神经元无显著改变(图5C,D,G,H,K,L,O,P,Q,R,S,T)。表明桃叶珊瑚苷能减轻癫痫持续性发作诱导的神经元损伤。

2.3桃叶珊瑚苷降低癫痫持续发作诱导的神经元坏死性凋亡

MLKL和RIP-1是神经细胞坏死性凋亡过程中的两个重要蛋白，是检测神经元坏死性凋亡的主要指标。癫痫持续性发作24h、72h后，大鼠海马CA1区、CA3区、DG区、门区中，MLKL表达显著增强(图6A,B,E,F,I,J,M,N和图7A,B,E,F,I,J,M,N)；桃叶珊瑚苷处理后，MLKL水平显著降低(图6C,D,G,H,K,L,O,P,Q,R,S,T和图7C,D,G,H,K,L,O,P,Q,R,S,T)。癫痫持续性发作72h后，RIP-1表达水平在海马CA1区、CA3区、DG区、门区中显著增加(图9A,B,E,F,I,J,M,N)，而在癫痫持续性发作24h后主要在DG区和门区表达显著增强(图8A,B,E,F,I,J,M,N)。与癫痫模型组比较，桃叶珊瑚苷能够显著降低大鼠海马各区中RIP-1表达水平(图8C,D,G,H,K,L,O,P,Q,R,S,T和图9C,D,G,H,K,L,O,P,Q,R,S,T)。Western-blot分析进一步证实，癫痫持续性发作24h和72h后海马神经元中MLKL和RIP-1蛋白表达显著增强，而桃叶珊瑚苷处理后显著降低MLKL和RIP-1蛋白表达(图10A,B,C)。上述实验结果表明，癫痫持续性发作可诱导海马神经元坏死性凋亡，桃叶珊瑚苷能通过降低MLKL和RIP-1表达水平保护癫痫发作后大鼠海马神经元。

2.4桃叶珊瑚苷上调海马神经元自噬相关蛋白表达

自噬参与营养循环、能量产生和清除受损蛋白。Beclin-1和LC3BⅠ转化成LC3BⅡ是自噬的两个重要标志物，参与细胞保护过程。癫痫持续性发作24h后大鼠海马神经元Beclin-1和LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白表达显著下降，而桃叶珊瑚苷处理后显著增加Beclin-1和LC3BⅡ/LC3BⅠ蛋白表达(图11A,B,C,D)，表明桃叶珊瑚苷可能通过促进海马神经元自噬、进而保护海马神经元。

3.实验小结

上述结果表明，桃叶珊瑚苷能减轻癫痫持续性发作诱导的神经元损伤，降低海马各区中MLKL和RIP-1蛋白表达，增加自噬相关蛋白Beclin-1和LC3表达水平。因此，桃叶珊瑚苷能促进海马神经细胞自噬和抑制坏死性凋亡、增加神经元存活，对癫痫持续发作后海马神经元有一定的保护作用。

Claims (9)

1.桃叶珊瑚苷用于制备促进大脑海马区细胞自噬和抑制坏死性凋亡进而保护神经元的癫痫药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征是，所述桃叶珊瑚苷是以含桃叶珊瑚苷的植物提取物的形式使用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征是，所述桃叶珊瑚苷是以含桃叶珊瑚苷的杜仲提取物形式使用。

4.根据权利要求1所述应用，其特征是，所述桃叶珊瑚苷是以含桃叶珊瑚苷的植物提取物为原料提取制备而成。

5.根据权利要求4所述应用，其特征是，桃叶珊瑚苷纯度为98%以上。

6.根据权利要求4所述应用，其特征是，以杜仲翅果为原料提取制备而成，所得的桃叶珊瑚苷纯度为98%以上。

7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征是，以桃叶珊瑚苷为主要活性成分与其他治疗或预防癫痫药物活性成分配合使用制成药物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述药物含有预防或治疗有效量的桃叶珊瑚苷以及任选的药学可接受的载体和/ 或辅料。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征是，所述药物的剂型选自注射剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、栓剂、膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、散剂、颗粒剂、冲剂、胶囊剂、丸剂、片剂、贴剂或缓释制剂。