CN105567783B - 一种软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物花粉贮藏及离体培养活力检测领域，具体而言，涉及一种软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，包括：采集软枣猕猴桃大蕾期花苞并取出花药；将所述花药干燥并过筛以收集花粉；将收集到的花粉密封并于‑85～‑75℃低温贮藏；将低温贮藏的花粉取出，置于室温下复温；将复温好的花粉均匀播撒于固体培养基上培养，随后在显微镜下镜检并统计花粉萌发率。该贮藏方法花粉经长时间保持后活力依旧保存良好，该花粉离体培养检测方法可用于软枣猕猴桃花粉活力检测，简单、迅速、精确。

Description

一种软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法
技术领域
本发明涉及植物花粉贮藏及离体培养活力检测领域，具体而言，涉及一种软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法。
背景技术
软枣猕猴桃(Actinidia arguta(Sieb.&Zucc)Planch.ex Miq.)，又名软枣子、猕猴梨、藤瓜、藤梨，属于猕猴桃科，猕猴桃属大型落叶藤本植物。其果实较小，表面光滑，整果可食，是猕猴桃属中最耐寒的种之一。软枣猕猴桃享有“水果之王”的美誉，以其优良的品质、风味、丰富的营养成分、较高的医疗保健功效及良好的加工适性等特点，备受消费者青睐。软枣猕猴桃是世界很多地区尤其是寒冷地区极具发展前景的小浆果树种。
常规杂交育种是作物育种的重要途径之一，而花粉活力生活力决定了杂交的有效性。在自然状态下，软枣猕猴桃的生活力最多维持2周，如果杂交亲本之间花期不育或远距离杂交，育种工作者就需要采用一定的方法进行花粉贮藏，并保持花粉活力。因此研究软枣猕猴桃花粉贮藏条件及花粉活力检测方法对育种工作具有重要的应用价值。
软枣猕猴桃为雌雄异株植物，栽培生产中需同时配置雌株和雄株。但由于一些种植者对软枣猕猴桃特性缺乏了解，栽培过程中没有配置授粉植株，开花期授粉不良，降低了果实的产量及品质，严重者可导致绝产。因此研究软枣猕猴桃花粉的贮藏方法，可结合人工授粉方式，在不配置雄株的情况下仍能获得高品质的果实，同时由于减少了雄株的占地面积，可显著提高土地利用率，提高单位面积产量。
目前关于猕猴桃花粉贮藏方法有低温贮藏的报道，但研究最低温度仅限在-20℃条件，贮藏1年后花粉活力下降明显，而关于软枣猕猴桃花粉贮藏方法鲜有报道。
此外，目前测定花粉活力的方法主要有离体培养法、田间授粉法和染色法等3种。田间授粉法费事费力，染色法误差较大。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，所述方法贮藏温度较传统方法更低，且花粉活力保持时间长，可解决贮藏1年后花粉活力下降明显的问题，适应软枣猕猴桃的花粉离体培养活力检测方法可解决现有方法费时费力，误差较大，操作复杂，不够精确的问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，包括以下步骤：
1)、采集软枣猕猴桃大蕾期花苞并取出花药；
2)、将所述花药干燥并过筛以收集花粉；
3)、将收集到的花粉密封并于-85～-75℃低温贮藏；
4)、将低温贮藏的花粉取出，置于室温下复温后，将花粉均匀播撒于固体培养基上培养，随后在显微镜下镜检并统计花粉萌发率。
本发明提供的软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，贮藏温度较传统方法更低，且花粉活力保持时间长，花粉活力保持的时间更久；后续的检测方法操作便捷，省时省力，且计数精确，易于操作。
具体的，花粉密封可置于密封的玻璃瓶或离心管中。
优选的，如上所述的软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，在步骤1)中，所述采集软枣猕猴桃大蕾期花苞在晴天进行，且采集时间为早晨9:00～10:30。
晴天收集到的花粉不易受潮，且萌发率最高。选择在早晨9:00～10:30期间进行采集大蕾期花苞，可避免花苞开放使花粉被污染。
优选的，如上所述的软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，在步骤2)中，将所述花药干燥的具体操作为：
将所述花药置于硫酸纸袋中，再将硫酸纸袋置于盛有变色硅胶的干燥器中，使花药含水量达到4.5～6％。
目前关于猕猴桃花粉干燥贮藏的方法中，有研究认为将自然晾干的花粉置于青霉素小瓶中贮藏在-15℃效果最好，但软枣猕猴桃花粉在贮藏1年后，花粉活力明显降低，降为贮藏前的15％，效果仍不是很理想。本发明利用变色硅胶对花粉进行干燥后密封贮藏，干燥效果更为彻底，放入-85～-75℃进行贮藏，花粉活力保存良好，仅比贮藏前降低1.91％。
进一步优选的，在所述干燥器中干燥的温度为20～25℃，干燥时间为20～28小时。
优选的，如上所述的软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，在步骤2)中，所述过筛具体为过60～80目筛。
优选的，如上所述的软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，在步骤4)中，所述复温时间为5～10min。
优选的，如上所述的软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，将软枣猕猴桃花粉播撒于固体培养基时，播撒密度为：
在10×10倍显微镜下镜检时，每个视野下花粉粒数为50～100粒。
应注意花粉播撒均匀，尽量少重叠。具体操作时，可用接种环轻沾一下花粉将花粉吸附在接种环上，再轻轻拍打接种环让花粉均匀散落于固体培养基上。
优选的，如上所述的软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，在步骤4)中，所述固体培养基主要由以下原料组份组成：
硼酸250～350mg/L、蔗糖45～55g/L、琼脂9.5～10.5g/L；所用溶剂为水。
进一步优选的，所述固体培养基主要由以下原料组份组成：
硼酸290～310mg/L、蔗糖48～52g/L、琼脂9.8～10.2g/L；所用溶剂为水。
硼酸与蔗糖在一定浓度范围内能促进花粉萌发。花粉离体萌发需要碳源。蔗糖对花粉萌发和花粉管生长具有重要的作用，是花粉萌发及花粉管壁合成的主要营养物质来源。硼酸可以促进花粉对蔗糖的吸收和代谢，与蔗糖结合能极大地提高花粉的萌发率，增加氧气的含量和吸收，参与果胶物质的合成，利于花粉管的建造、萌发。但针对不同物种的花粉，硼酸与蔗糖并不同，且二者之间的比例需要控制得当。
优选的，如上所述的软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，所述培养的条件为：
19～21℃暗培养5.5～6.5h。
温度也是影响花粉萌发的重要条件。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、本发明利用变色硅胶对花粉进行干燥后密封贮藏，干燥效果更为彻底，放入-85～-75℃进行贮藏，花粉活力保存良好，仅比贮藏前降低1.91％。
2)、本发明提供的软枣猕猴桃花粉离体培养活力检测方法，操作便捷，省时省力，且计数精确，易于操作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为不同贮藏温度下贮藏360天后花粉萌发率；
图2为不同蔗糖浓度对花粉萌发率的影响；
图3为不同硼酸浓度对花粉萌发率的影响；
图4为不同培养温度对花粉萌发率的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法：
S11、采集软枣猕猴桃大蕾期花苞并取出花药；
S12、将所述花药干燥并过筛以收集花粉；
S13、将收集到的花粉密封并于-85～-75℃低温贮藏；
S14、将低温贮藏的花粉取出，置于室温下复温后，将花粉均匀播撒于固体培养基上培养，随后在显微镜下镜检并统计花粉萌发率。
实施例2
一种软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法：
S21、于晴天早晨9:00采集软枣猕猴桃大蕾期即将开放的花朵，用镊子扒出花药；
S22、将所述花药置于硫酸纸袋中，再将硫酸纸袋置于盛有变色硅胶的干燥器中，在所述干燥器中干燥的温度为20～25℃，干燥时间为20小时，使花药含水量达到6％；
S23、过60目筛以收集花粉；
S24、将收集到的花粉放入密封的玻璃瓶或离心管中并于-85低温贮藏；
S25、将低温贮藏的花粉取出，置于室温下复温5min；
S26、将复温好的花粉均匀播撒于固体培养基上培养，随后在显微镜下镜检并统计花粉萌发率；
花粉在培养基上的密度为，在10×10倍显微镜下镜检时，每个视野下花粉粒数为50～100粒；
固体培养基的配方为：硼酸250mg/L、蔗糖45g/L、琼脂9.5g/L；配置时所用溶剂为水。
实施例3
一种软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法：
S31、于晴天早晨10:30采集软枣猕猴桃大蕾期即将开放的花朵，用镊子扒出花药；
S32、将所述花药置于硫酸纸袋中，再将硫酸纸袋置于盛有变色硅胶的干燥器中，在所述干燥器中干燥的温度为20～25℃，干燥时间为28小时，使花药含水量达到4.5％；
S33、过80目筛以收集花粉；
S34、将收集到的花粉放入密封的玻璃瓶或离心管中并于-75低温贮藏；
S35、将低温贮藏的花粉取出，置于室温下复温10min；
S36、将复温好的花粉均匀播撒于固体培养基上培养，随后在显微镜下镜检并统计花粉萌发率；
花粉在培养基上的密度为，在10×10倍显微镜下镜检时，每个视野下花粉粒数为50～100粒；
固体培养基的配方为：硼酸310mg/L、蔗糖52g/L、琼脂10.2g/L，配置时所用溶剂为水。
实施例4
一种软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法：、
S41、于晴天早晨10:30采集软枣猕猴桃大蕾期即将开放的花朵，用镊子扒出花药；
S42、将所述花药置于硫酸纸袋中，再将硫酸纸袋置于盛有变色硅胶的干燥器中，在所述干燥器中干燥的温度为20～25℃，干燥时间为26小时，使花药含水量达到4.8％；
S43、过80目筛以收集花粉；
S44、将收集到的花粉放入密封的玻璃瓶或离心管中并于-81低温贮藏；
S45、将低温贮藏的花粉取出，置于室温下复温8min；
S46、将复温好的花粉均匀播撒于固体培养基上培养，随后在显微镜下镜检并统计花粉萌发率；
花粉在培养基上的密度为，在10×10倍显微镜下镜检时，每个视野下花粉粒数为50～100粒；
固体培养基的配方为：硼酸290mg/L、蔗糖48g/L、琼脂9.8g/L，配置时所用溶剂为水。
实施例5
软枣猕猴桃品种“绿王”花粉贮藏及离体培养活力检测方法。
试验材料：软枣猕猴桃品种“绿王”
试验地点：中国农业科学院特产研究所软枣猕猴桃试验园中。
S51、于晴天早晨10:00采集软枣猕猴桃大蕾期即将开放的花朵，用镊子扒出花药；
S52、将所述花药置于硫酸纸袋中，再将硫酸纸袋置于盛有变色硅胶的干燥器中，在所述干燥器中干燥的温度为20～25℃，干燥时间为24小时，使花药含水量达到5％；
S53、过80目筛以收集花粉；
S54、将收集到的花粉放入密封的玻璃瓶或离心管中并于-80低温贮藏；
S55、贮藏360天后，将低温贮藏的花粉取出，置于室温下复温5min；
S56、将复温好的花粉均匀播撒于固体培养基上培养，随后在显微镜下镜检并统计花粉萌发率；
花粉在培养基上的密度为，在10×10倍显微镜下镜检时，每个视野下花粉粒数为50～100粒；
固体培养基的配方为：硼酸300mg/L、蔗糖50g/L、琼脂10g/L；配置时所用溶剂为水。
实验例1
不同贮藏温度下贮藏360天后对花粉萌发率的影响
以实施例5为实验对象，温度变量的设置方式为：
花粉密封后贮藏的温度分布为常温、4℃、-20℃，-80℃，其余操作与实施例5完全一致。
按照实施例5记载的方法统计花粉萌发率，花粉萌发率(％)＝(花粉萌发数/花粉总数)×100％。
不同贮藏温度贮藏360天后，花粉萌发率如图1所示。常温和4℃下花粉萌发率为0，-20℃花粉萌发率为83.49％，较贮藏前94.38％降低了11.58％；-80℃条件下贮藏条件最好，仅比贮藏前降低1.91％。
实验例2
蔗糖浓度、硼酸浓度及培养温度对花粉萌发率的影响
将实验变量分别设置为固体培养基中的蔗糖浓度、硼酸浓度及培养温度，其余操作均与实施例5相同，变量设置具体如下：
将“绿王”花粉均匀播于不同配方的培养基中，蔗糖浓度(0g/L、25g/L、50g/L、100g/L、150g/L、300g/L)，硼酸浓度(0mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、500mg/L)，培养温度为15、20、25、30、35、40℃条件下进行培养。
以上变量分别在基础条件上进行变动，基础培养基为蔗糖100g/L，硼酸100mg/L，琼脂10g/L。基础培养条件25℃，黑暗培养。每次仅变动蔗糖浓度、硼酸浓度或培养温度中的一个参数。
1)、不同蔗糖浓度下花粉萌发率见图2。
由图2可以看出50g/L的蔗糖的培养基的花粉萌发率最高，其次为25g/L和100g/L的蔗糖浓度的培养基。
2)、不同硼酸浓度下花粉萌发率见图3。
由图3可以看出300mg/L的硼酸浓度的培养基的花粉萌发率最高，其次为500mg/L和200mg/L的硼酸浓度的培养基。
3)、不同培养温度下花粉萌发率见图4。
由图4可以看出花粉的最佳培养温度为20℃，其次为25℃。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (6)

1.一种软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）、采集软枣猕猴桃大蕾期花苞并取出花药；
2）、将所述花药干燥并过筛以收集花粉；
3）、将收集到的花粉密封并于-85~-75℃低温贮藏；
4）、将低温贮藏的花粉取出，置于室温下复温后，将花粉均匀播撒于固体培养基上培养，随后在显微镜下镜检并统计花粉萌发率；
在步骤2）中，将所述花药干燥的具体操作为：
将所述花药置于硫酸纸袋中，再将硫酸纸袋置于盛有变色硅胶的干燥器中，使花药含水量达到4.5~6%；
在所述干燥器中干燥的温度为20~25℃，干燥时间为20~28小时；
在步骤4）中，所述固体培养基由以下原料组份组成：
硼酸250~350 mg/L、蔗糖45~55 g/L、琼脂9.5~10.5 g/L；所用溶剂为水；
在步骤4）中，所述培养的条件为：
19~21℃暗培养5.5~6.5h。
2.如权利要求1所述的软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，其特征在于，在步骤1）中，所述采集软枣猕猴桃大蕾期花苞在晴天进行，且采集时间为早晨9:00~10:30。
3.如权利要求1所述的软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，其特征在于，在步骤2）中，所述过筛具体为过60~80目筛。
4.如权利要求1所述的软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，其特征在于，在步骤4）中，所述复温时间为5~10min。
5.如权利要求1所述的软枣猕猴桃花粉贮藏方法，其特征在于，将软枣猕猴桃花粉播撒于固体培养基时，播撒密度为：
在10×10倍显微镜下镜检时，每个视野下花粉粒数为50~100粒。
6.如权利要求1所述的软枣猕猴桃花粉贮藏及离体培养活力检测方法，其特征在于，所述固体培养基由以下原料组份组成：
硼酸290~310 mg/L、蔗糖48~52 g/L、琼脂9.8~10.2 g/L；所用溶剂为水。
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