CN109197597A - 利用黑蕊猕猴桃花药诱导单倍体愈伤组织的方法 - Google Patents

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张莹
吴永鹏
张燕
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    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
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Abstract

本发明公开了一种利用黑蕊猕猴桃花药诱导单倍体愈伤组织的方法，该方法以黑蕊猕猴桃花药为材料离体培养，以MS培养基为基础，添加玉米素、生长素、椰汁或玉米须汁、蔗糖、琼脂，或以B5培养基为基础，添加萘乙酸、激动素、马铃薯汁、蔗糖、琼脂，作为诱导愈伤培养基，用时一周左右即可成功获得单倍体黑蕊猕猴桃的愈伤组织。该方法平均诱导率为72.95％，最高可达88.64％，显著高于自然发生途径的单倍体发生概率，并且操作简便、用时较短，是一种较有效的获得黑蕊猕猴桃单倍体愈伤组织的途径，为快速获得纯合子、为黑蕊猕猴桃基因转化、细胞培养、以及基因组研究奠定了基础。

Description

利用黑蕊猕猴桃花药诱导单倍体愈伤组织的方法
技术领域
本发明属于猕猴桃栽培技术领域，具体涉及一种利用黑蕊猕猴桃花药诱导单倍体愈伤组织的方法。
背景技术
猕猴桃是一种多年生攀缘性落叶藤本果树，质地柔软，属猕猴桃科，猕猴桃属植物，原产于我国，又名阳桃、毛桃、奇异果等。猕猴桃果实肉肥汁多，清香鲜美，富含维生素C、膳食纤维、多种矿物质营养和氨基酸，因其营养高，具有医疗、保健功效，有“长生果”和“水果之王”的美誉。近年来，紫果猕猴桃(黑蕊猕猴桃)因其果实味美、特征受到了人们的喜爱。但黑蕊猕猴桃野外贮藏量较少、未大量果实中富含花青素而呈紫色、表皮光滑等人工栽培、以及其育种工作相对欠缺，制约了黑蕊猕猴桃的产业化进程。
公布号为CN 107306793 A的发明专利申请公开了《一种软枣猕猴桃花药培养成单倍体植株的方法》，该方法耗时较长，仅预处理就需要2～10天，黑暗培养需要20天，整体用时约为45天左右。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用黑蕊猕猴桃花药快速、高诱导率诱导单倍体愈伤组织的方法。
针对上述目的，本发明所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、选择生长良好、无病虫害的黑蕊猕猴桃枝条上未成熟的花蕾，采集后先置于-25～-10℃低温速冻20～90min，再置于2～6℃冷藏处理10～15h。
2、将冷藏处理后的花蕾用质量分数为5％～8％的次氯酸钠水溶液消毒3～10min，然后用灭菌的蒸馏水清洗4～10遍，将花蕾表面水分吸干后，剥开花蕾，取出花药，将花药接种在诱导愈伤培养基中，在24±2℃、16/8h光照下培养4～9天，即产生单倍体愈伤组织。
上述步骤1中，选择生长良好、无病虫害的黑蕊猕猴桃枝条上未成熟的花蕾，采集后优选先置于-20℃低温速冻30～60min，再置于4℃冷藏处理12h。
上述步骤2中，所述的诱导愈伤培养基是以MS培养基为基础，添加0.7～1.5mg/L玉米素、3.0～6.0mg/L生长素、10～30mL/L椰汁、25～30g/L蔗糖、4.5～6.0g/L琼脂，pH为5.8～6.0；优选以MS培养基为基础，添加1.0～1.5mg/L玉米素、5.0～6.0mg/L生长素、15～20mL/L椰汁、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
上述的诱导愈伤培养基也可以是以B5培养基为基础，添加1.5～2.5mg/L萘乙酸、2.0～3.5mg/L激动素、10～30mL/L马铃薯汁、25～30g/L蔗糖、4.5～6.0g/L琼脂，pH为5.8～6.0；优选以B5培养基为基础，添加2.0mg/L萘乙酸、3.0mg/L激动素、20mL/L马铃薯汁、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
上述的诱导愈伤培养基还可以是以MS培养基为基础，添加0.8～1.5mg/L玉米素、3.0～5.0mg/L生长素、15～25mL/L玉米须汁、25～30g/L蔗糖、4.5～6.0g/L琼脂，pH为5.8～6.0；优选以MS培养基为基础，添加1.2mg/L玉米素、4.0mg/L生长素、20mL/L玉米须汁、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
本发明以黑蕊猕猴桃花药为材料离体培养，总用时一周左右即可成功获得单倍体黑蕊猕猴桃的愈伤组织。该方法平均诱导率为72.95％，最高可达88.64％，显著高于自然发生途径的单倍体发生概率和以软枣猕猴桃花药诱导单倍体的诱导率，并且操作简便、用时较短，是一种较有效的获得黑蕊猕猴桃单倍体愈伤组织的途径。本发明的花药离体培养诱导愈伤组织的方法为快速获得纯合子、为黑蕊猕猴桃基因转化、细胞培养、以及基因组研究奠定了基础。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、选择生长良好、无病虫害的黑蕊猕猴桃枝条上未成熟的花蕾(直径约2～3mm)，采集后先置于-20℃低温速冻30min，之后再置于4℃冷藏处理12h。
2、将冷藏处理后的花蕾用质量分数为6％的次氯酸钠水溶液消毒6min，然后用灭菌的蒸馏水清洗5遍，将花蕾表面水分吸干后，置于平皿中，剥开花蕾，取出花药，将花药接种在盛有25mL诱导愈伤培养基的培养瓶中，每瓶接种10枚花药，所述的诱导愈伤培养基是以MS培养基为基础，添加0.8mg/L玉米素、4.5mg/L生长素、15mL/L椰汁、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂，pH为5.8。将接种后的培养基放置在24±2℃、16/8h光照下培养5天。取出诱导后形成的愈伤组织，用流式细胞仪进行鉴定单倍体愈伤组织。该方法愈伤组织诱导率为76.31％。
实施例2
1、选择生长良好、无病虫害的黑蕊猕猴桃枝条上未成熟的花蕾(直径约2～3mm)，采集后先置于-20℃低温速冻30min，之后再置于4℃冷藏处理12h。
2、将冷藏处理后的花蕾用质量分数为8％的次氯酸钠水溶液消毒6min，然后用灭菌的蒸馏水清洗5遍，将花蕾表面水分吸干后，置于平皿中，剥开花蕾，取出花药，将花药接种在盛有25mL诱导愈伤培养基的培养瓶中，每瓶接种10枚花药，所述的诱导愈伤培养基是以MS培养基为基础，添加1.0mg/L玉米素、5.0mg/L生长素、20mL/L椰汁、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂，pH为6.0。将接种后的培养基放置在24±2℃、16/8h光照下培养5天。取出诱导后形成的愈伤组织，用流式细胞仪进行鉴定单倍体愈伤组织。该方法愈伤组织诱导率为88.64％。
实施例3
1、选择生长良好、无病虫害的黑蕊猕猴桃枝条上未成熟的花蕾(直径约2～3mm)，采集后先置于-20℃低温速冻60min，之后再置于4℃冷藏处理15h。
2、将冷藏处理后的花蕾用质量分数为8％的次氯酸钠水溶液消毒6min，然后用灭菌的蒸馏水清洗5遍，将花蕾表面水分吸干后，置于平皿中，剥开花蕾，取出花药，将花药接种在盛有25mL诱导愈伤培养基的培养瓶中，每瓶接种10枚花药，所述的诱导愈伤培养基是以MS培养基为基础，添加1.5mg/L玉米素、6.0mg/L生长素、30mL/L椰汁、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂，pH为6.0。将接种后的培养基放置在24±2℃、16/8h光照下培养6天。取出诱导后形成的愈伤组织，用流式细胞仪进行鉴定单倍体愈伤组织。该方法愈伤组织诱导率为83.25％。
实施例4
1、选择生长良好、无病虫害的黑蕊猕猴桃枝条上未成熟的花蕾(直径约2～3mm)，采集后先置于-20℃低温速冻30min，之后再置于4℃冷藏处理12h。
2、将冷藏处理后的花蕾用质量分数为10％的次氯酸钠水溶液消毒5min，然后用灭菌的蒸馏水清洗6遍，将花蕾表面水分吸干后，置于平皿中，剥开花蕾，取出花药，将花药接种在盛有25mL诱导愈伤培养基的培养瓶中，每瓶接种10枚花药，所述的诱导愈伤培养基是以B5基础培养基为基础，添加2.0mg/L萘乙酸、3.0mg/L玉米素、20mL/L马铃薯汁、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂，pH为6.0。将接种后的培养基放置在24±2℃、16/8h光照下培养5天。取出诱导后形成的愈伤组织，用流式细胞仪进行鉴定单倍体愈伤组织。该方法愈伤组织诱导率为76.67％。
实施例5
1、选择生长良好、无病虫害的黑蕊猕猴桃枝条上未成熟的花蕾(直径约2～3mm)，采集后先置于-20℃低温速冻40min，之后再置于4℃冷藏处理10h。
2、将冷藏处理后的花蕾用质量分数为8％的次氯酸钠水溶液消毒5min，然后用灭菌的蒸馏水清洗7遍，将花蕾表面水分吸干后，置于平皿中，剥开花蕾，取出花药，将花药接种在盛有25mL诱导愈伤培养基的培养瓶中，每瓶接种10枚花药，所述的诱导愈伤培养基是以MS培养基为基础，添加1.2mg/L玉米素、4.0mg/L生长素、20mL/L玉米须汁、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂，pH为6.0。将接种后的培养基放置在24±2℃、16/8h光照下培养5天。取出诱导后形成的愈伤组织，用流式细胞仪进行鉴定单倍体愈伤组织。该方法愈伤组织诱导率为64.0％。

Claims (5)

1.一种利用黑蕊猕猴桃花药诱导单倍体愈伤组织的方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：
(1)选择生长良好、无病虫害的黑蕊猕猴桃枝条上未成熟的花蕾，采集后先置于-25～-10℃低温速冻20～90min，再置于2～6℃冷藏处理10～15h；
(2)将冷藏处理后的花蕾用质量分数为5％～8％的次氯酸钠水溶液消毒3～10min，然后用灭菌的蒸馏水清洗4～10遍，将花蕾表面水分吸干后，剥开花蕾，取出花药，将花药接种在诱导愈伤培养基中，在24±2℃、16/8h光照下培养4～9天，即产生单倍体愈伤组织；
上述的诱导愈伤培养基是以MS培养基为基础，添加0.7～1.5mg/L玉米素、3.0～6.0mg/L生长素、10～30mL/L椰汁、25～30g/L蔗糖、4.5～6.0g/L琼脂，pH为5.8～6.0；
或者上述的诱导愈伤培养基是以B5培养基为基础，添加1.5～2.5mg/L萘乙酸、2.0～3.5mg/L激动素、10～30mL/L马铃薯汁、25～30g/L蔗糖、4.5～6.0g/L琼脂，pH为5.8～6.0；
或者上述的诱导愈伤培养基是以MS培养基为基础，添加0.8～1.5mg/L玉米素、3.0～5.0mg/L生长素、15～25mL/L玉米须汁、25～30g/L蔗糖、4.5～6.0g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
2.根据权利要求1所述的利用黑蕊猕猴桃花药诱导单倍体愈伤组织的方法，其特征在于：步骤(1)中，选择生长良好、无病虫害的黑蕊猕猴桃枝条上未成熟的花蕾，采集后先置于-20℃低温速冻30～60min，再置于4℃冷藏处理12h。
3.根据权利要求1所述的利用黑蕊猕猴桃花药诱导单倍体愈伤组织的方法，其特征在于：所述的诱导愈伤培养基是以MS培养基为基础，添加1.0～1.5mg/L玉米素、5.0～6.0mg/L生长素、15～20mL/L椰汁、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
4.根据权利要求1所述的利用黑蕊猕猴桃花药诱导单倍体愈伤组织的方法，其特征在于：所述的诱导愈伤培养基是以B5培养基为基础，添加2.0mg/L萘乙酸、3.0mg/L激动素、20mL/L马铃薯汁、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
5.根据权利要求1所述的利用黑蕊猕猴桃花药诱导单倍体愈伤组织的方法，其特征在于：所述的诱导愈伤培养基是以MS培养基为基础，添加1.2mg/L玉米素、4.0mg/L生长素、20mL/L玉米须汁、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。
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