CN105561398A - 一种组织工程多孔细胞外基质支架制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种组织工程多孔细胞外基质支架的制备方法，该方法通过纳米或微米级聚合物支架埋植到宿主皮下或者腹腔，以聚合物支架为模板，利用宿主免疫保护机制制备具有可控孔结构，且体内植入无免疫原性的组织工程细胞外基质支架。本发明解决了细胞外基质支架材料致孔的问题；该多孔支架源于动物本身，用于修复自体损伤的组织或器官，无免疫排斥作用；同时由于自体修复没有复杂的脱细胞步骤，该支架的力学强度明显优于脱细胞支架材料；该细胞基质多孔支架可以进一步脱细胞，用于异体组织或器官修复，在器官修复领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种组织工程领域多孔支架制备方法，具体说是一种组织工程多孔细胞外基质支架的制备方法。
背景技术
组织工程的发展为人体组织器官缺损修复开辟了一条新的道路，目前科学家已研发多种组织工程产品并用于临床，取得了较好的效果。组织工程主要包括支架、细胞和信号因子三方面。组织工程支架材料植入体内能与相应组织器官吻合，其中包含有骨、软骨、神经、血管、皮肤和人工器官，如肝、肾、脾、尿道等的组织支架材料。支架材料需具备以下条件：较好的生物相容性；可控的降解速度；较高的孔隙率；足够的力学强度；易于制备和消毒等。支架材料按照来源分为两类：一类是合成材料，有聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)，聚己内酯(PCL)，聚氨酯(PU)等；另一类是天然材料包括胶原，明胶，丝素蛋白，细胞外基质等。来源于异体器官或组织脱细胞的细胞外基质支架是近年来研究和应用的热点，许多经脱细胞处理的细胞外基质材料临床上被用于外科支架或促进软组织修复。脱细胞的细胞外基质材料不仅可以提供力学支持，还可以作为一个模板引导组织原位再生。常见的几种生物组织来源的细胞外基质材料，包括小肠、心包、心脏瓣膜、膀胱、腹膜间皮、真皮等。这些脱细胞基质材料明显比合成材料生物相容性好，免疫排斥低，同时多种生长因子在脱细胞过程中未被破坏能够起到促进组织修复作用。
然而，这些异体或异种来源的脱细胞支架普遍存在孔径过小问题，导致细胞难以迁移到支架内部，进而影响组织重塑和修复。这些脱细胞基质支架也存在力学不足的缺点。另外，这些脱细胞基质的植入也会激发患者体内不同类型和不同程度的免疫反应。这些问题的存在也限制了脱细胞支架的进一步应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了具有可控孔结构，且体内植入无免疫原性的细胞外基质支架制备方法。本发明所采用的技术方案包括以下步骤：
步骤一，以生物可降解高分子为原料，通过静电纺丝，或湿法纺丝，或熔融纺丝，或3D打印技术中的一种或者几种制备纳米级或者微米级的有序或者无序的管状或者膜状支架；
步骤二，将上述支架植入到实验动物包括猪，狗，羊，兔子，大鼠，小鼠皮下或者腹腔部位2周到3个月时间，宿主启动免疫保护机制并动员体内细胞向支架内部迁移，从而将支架细胞化；将动物暂时麻醉后，在植入部位剪一个小的切口将步骤二植入的聚合物支架取出后，将切口缝合，动物继续饲养备用；
步骤三，将步骤二中取出的支架组织细胞复合物，依次用30-50％，50-90％和无水乙醇脱水后，再将其置于三氯甲烷或者二氯甲烷中振荡除去聚合物，得到多孔的管状或者膜状胞外基质复合物支架；
步骤四，将步骤三得到的管状或者膜状支架用于实验动物自体组织如血管，神经，软骨等组织修复，同时也可将这种支架经过脱细胞处理后，用于异体组织修复。
其中，生物可降解高分子可以是合成高分子聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)，聚己内酯(PCL)，聚羟基脂肪酸酯(PHA)，聚氨酯(PU)中的一种或几种。
本发明专利与现有脱细胞基质支架材料相比，突出的优点在于：1、目前的脱细胞基质支架结构致密，没有办法解决孔的问题，细胞迁移困难，从而影响组织修复，本发明利用聚合物支架为模板来制备多孔胞外基质支架，成功解决了细胞外基质支架材料致孔的问题；2、免疫排斥是目前所有组织工程支架都存在的问题，本发明利用宿主自体的免疫保护机制制备的多孔支架，源于动物本身，用于修复自体损伤的组织或器官，无免疫排斥作用；3、可以通过控制植入聚合物支架的孔径，形状，大小来制备不同的胞外基质支架用于修复受损的器官或组织，从而实现个性化治疗；4、由于自体修复没有复杂的脱细胞步骤，该支架的力学强度明显优于脱细胞支架材料；5、该细胞基质多孔支架可以进一步脱细胞，用于异体组织或器官修复，进而拓宽了其应用范围。
具体实施方式
实施例1：具有纳米孔径细胞基质支架材料的制备
PCL纳米纤维支架制备：称取1.0克分子量为80000的PCL，加入到10ml二氯甲烷，室温搅拌溶解至澄清，制得浓度分数为10％(m/v)的PCL溶液。静电纺丝在室温下进行，室内相对湿度为60％。将铝箔纸覆盖在静电纺丝滚筒接收装置上并接地，将10％(m/v)PCL纺丝溶液装入直径约为14.95mm的一次性注射器中，并将高压直流电源与注射器针头相连。调整注射器针头对准圆柱接收器的中央，设置针头与接收器之间的距离为12cm，溶液流速为1ml/h，直流电压为16千伏，纺丝时间为40min。制备完成后将得到的膜支架材料室温真空干燥48小时使溶剂彻底挥发。
PCL纳米纤维支架皮下植入：将上述得到的PCL纳米纤维支架裁剪成2cm×1cm的长条，用75％医用酒精灭菌后用无菌生理盐水置换备用。将大鼠用10％(m/v)水合氯醛麻醉后，背部两侧脱毛1.5cm×1.0cm大小面积，用剪刀加开1cm长切口，用平头剪刀将皮层与肌肉组织分离出2.5cm×1.5cm大小的空腔，将PCL纳米纤维支架材料平整放入到空腔中，将切口缝合后消毒饲养。
具有纳米孔径细胞基质支架材料的制备：在皮下埋植时间达到1个月时，将大鼠用异氟烷麻醉，在植入支架材料的另一侧脱毛切口，将材料与周围组织剥离后取出。将切口缝合消毒后饲养。将得到的支架依次用50％，70％，无水乙醇脱水各3小时，后置于三氯甲烷中振荡72小时，24小时换液一次，洗掉聚合物PCL。真空干燥，环氧乙烷灭菌备用。
具有纳米孔径细胞基质支架材料自体植入评价：将得到的纳米孔径细胞基质支架进行大鼠自体皮下埋植实验，通过苏木素伊红染色和免疫荧光染色评价其组织相容性。
具有纳米孔径细胞基质支架材料异体植入评价：将得到的纳米孔径细胞基质支架用1％SDS脱细胞24小时后，用生理盐水将残余SDS洗净，后用75％乙醇灭菌进行大鼠异体皮下埋植实验，通过苏木素伊红染色和免疫荧光染色评价其组织相容性。
实施例2：具有微米孔径细胞基质支架材料的制备
PLA微米纤维支架制备：该支架利用湿法纺丝在室温通风厨中制备。将1克聚乳酸溶解到10ml六氟异丙醇中，室温搅拌至溶液澄清。将直径为3cm圆柱与旋转电机相连。将聚乳酸纺丝溶液吸入注射器中，注射器针头置入到乙醇凝固浴中距离接收圆柱1cm位置。设定溶液流速为2ml/h，接收棒转速为500rpm，纺丝时间为40min。制备完成后将微米纤维支架真空干燥备用。
PLA微米纤维支架皮下植入：将上述得到的PLA微米纤维支架裁剪成4cm×2cm的长条，用75％医用酒精灭菌后用无菌生理盐水置换备用。将兔子麻醉后，背部两侧剃光2.5cm×1.5cm大小面积，用剪刀剪开2cm长切口，用平头剪刀将皮层与肌肉组织分离出4.5cm×2.5cm大小的空腔，将剪好的PLA微米纤维支架材料平整放入到空腔中，将切口缝合后消毒饲养。
具有微米孔径细胞基质支架材料的制备：在皮下埋植时间达到2个月时，将兔子麻醉，在植入支架材料的另一侧脱毛切口，将材料与周围组织剥离后取出。将切口缝合消毒后饲养。将得到的支架依次用50％，70％，无水乙醇脱水各2小时，后置于二氯甲烷中振荡48小时，24小时换液一次，洗掉聚合物PLA。真空干燥，环氧乙烷灭菌备用。
具有微米孔径细胞基质支架材料自体植入评价：将得到的微米孔径细胞基质支架进行兔子自体皮下埋植实验，通过苏木素伊红染色和免疫荧光染色评价其组织相容性。
具有微米孔径细胞基质支架材料异体植入评价：将得到的微米孔径细胞基质支架用1％SDS脱细胞48小时后，用生理盐水将残余SDS洗净，后用75％乙醇灭菌进行兔子异体皮下埋植实验，通过苏木素伊红染色和免疫荧光染色评价其组织相容性。
实施例3：具有大孔径细胞基质支架材料的制备
PCL粗纤维支架制备：该支架利用熔融纺丝在室温条件下制备。将20克PCL加入到料筒中。将料筒升温到90℃恒温5小时，调整料筒针头与接收板的距离，设定料筒推进速度流速为6ml/h，接收板x轴和y轴的移动速度为1mm/s，移动距离为15cm，纺丝时间为60min。制备完成后将粗纤维支架真空干燥备用。
PCL粗纤维支架皮下植入：将上述得到的PCL粗纤维支架裁剪成10cm×8cm的矩形，用环氧乙烷灭菌后备用。将羊麻醉后，背部两侧剃光12cm×2cm大小面积，用剪刀剪开11cm长切口，用平头剪刀将皮层与肌肉组织分离出11cm×9cm大小的空腔，将PCL粗纤维支架材料平整放入到空腔中，将切口缝合后消毒饲养。
具有大孔径细胞基质支架材料的制备：在皮下埋植时间达到一个月时，将羊麻醉后，在植入支架材料的另一侧脱毛切口，将材料与周围组织剥离后取出。将切口缝合消毒后饲养。将得到的支架用60％，80％，无水乙醇依次脱水各4小时，后置于二氯甲烷中振荡72小时，24小时换液一次，洗掉聚合物PCL。真空干燥，环氧乙烷灭菌备用。
具有大孔径细胞基质支架材料自体植入评价：将得到的大孔径细胞基质支架进行羊自体皮下埋植实验，通过苏木素伊红染色和免疫荧光染色评价其组织相容性。
具有大孔径细胞基质支架材料异体植入评价：将得到的大孔径细胞基质支架用2％SDS脱细胞12小时后，用生理盐水将残余SDS洗净，后用75％乙醇灭菌进行羊异体皮下埋植实验，通过苏木素伊红染色和免疫荧光染色评价其组织相容性。
实施例4：具有梯度孔径细胞基质支架材料的制备
PLGA纳米纤维层支架制备：称取1.2克PLGA，加入到10ml四氢呋喃中，室温搅拌溶解至澄清，制得浓度分数为12％(m/v)的PLGA溶液。静电纺丝在室温下进行，室内相对湿度为50％。将静电纺丝滚筒安装在接收装置上并接地，将12％(m/v)PLGA纺丝溶液装入直径约为14.95mm的一次性注射器中，并将高压直流电源与注射器针头相连。调整注射器针头对准圆柱接收器的中央，设置针头与接收器之间的距离为14cm，溶液流速为1.5ml/h，直流电压为18千伏，纺丝时间为40min。制备完成后将包裹有静电纺丝膜的滚筒室温真空干燥48小时使溶剂完全挥发。
PLGA粗纤维层支架制备：该支架外层利用熔融纺丝在室温条件下制备。将上一步骤制备的包裹有PCL纳米纤维层的滚筒安装在熔融纺丝仪器上，将10gPLGA加入到料筒中。将料筒升温到200℃恒温4小时，调整料筒针头与滚筒的距离为1cm，设定推进速度流速为4ml/h，接受滚筒旋转速度为20rpm，移动距离为10cm，纺丝时间为20min。制备完成后将双层纤维支架真空干燥备用。
PLGA双层支架皮下植入：将上述得到的PLGA双层纤维支架裁剪成12cm×10cm的矩形，用环氧乙烷灭菌后备用。将狗麻醉后，背部两侧剃光12cm×2cm大小面积，用剪刀剪开11cm长切口，用平头剪刀将皮层与肌肉组织分离出13cm×11cm大小的空腔，将双层纤维支架材料平整放入到皮下空腔中，将切口缝合后消毒饲养。
具有梯度孔径细胞基质支架材料的制备：在皮下埋植时间达到1个月时，将狗麻醉后，在植入支架材料的另一侧脱毛切口，将材料与周围组织剥离后取出。将切口缝合消毒后饲养。将得到的支架依次用60％，80％，无水乙醇脱水各4小时，后置于二氯甲烷中振荡96小时，24小时换液一次，洗掉聚合物PLGA。真空干燥，环氧乙烷灭菌备用。
具有梯度孔径细胞基质支架材料自体植入评价：将得到的梯度孔径细胞基质支架进行狗自体皮下埋植实验，通过苏木素伊红染色和免疫荧光染色评价其组织相容性。
具有梯度孔径细胞基质支架材料异体植入评价：将得到的梯度孔径细胞基质支架用1％SDS脱细胞36小时后，用生理盐水将残余SDS洗净，后用75％乙醇灭菌进行狗异体皮下埋植实验，通过苏木素伊红染色和免疫荧光染色评价其组织相容性。
Claims (2)
1.一种组织工程多孔细胞外基质支架制备方法，其特征在于该方法所采用的技术方案包括以下步骤：
步骤一，以生物可降解高分子为原料，通过静电纺丝，或湿法纺丝，或熔融纺丝，或3D打印技术中的一种或者几种制备纳米级或者微米级的有序或者无序的管状或者膜状支架；
步骤二，将上述支架植入到实验动物包括猪，狗，羊，兔子，大鼠，小鼠皮下或者腹腔部位2周到3个月时间，宿主启动免疫保护机制并动员体内细胞向支架内部迁移，从而将支架细胞化；将动物暂时麻醉后，在植入部位剪一个小的切口将步骤二植入的聚合物支架取出后，将切口缝合，动物继续饲养备用；
步骤三，将步骤二中取出的支架组织细胞复合物，依次用30-50％，50-90％和无水乙醇脱水后，再将其置于三氯甲烷或者二氯甲烷中振荡除去聚合物，得到多孔的管状或者膜状胞外基质复合物支架；
步骤四，将步骤三得到的管状或者膜状支架用于实验动物自体组织如血管，神经，软骨等组织修复，同时也可将这种支架经过脱细胞处理后，用于异体组织修复。
2.根据权利要求1所述的组织工程多孔细胞外基质支架制备方法，其中，所述的生物可降解高分子可以是合成高分子聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)，聚己内酯(PCL)，聚羟基脂肪酸酯(PHA)，聚氨酯(PU)中的一种或几种。
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