CN105561287A - 抗鸭肝炎病毒转移因子的体外制备方法 - Google Patents
抗鸭肝炎病毒转移因子的体外制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法。本发明将鸭肝炎病毒接种于9-11日龄鸡胚或鸭胚的尿囊液制备病毒抗原，提取鸭肝炎病毒抗原；然后以鸡脾脏或外周血为原料，制成淋巴细胞单层，然后用植物血凝素和鸭肝炎病毒诱导培养淋巴细胞，体外生产抗鸭肝炎病毒特异性转移因子。本发明所制备的特异性转移因子可以用于预防和治疗鸭肝炎病，同时可以提高鸭的免疫力。本发明具有特异性强、成本低、产出率高、效果好等优点，是一种较为理想的鸭肝炎病毒转移因子制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及兽药领域，更具体的说，是一种抗鸭肝炎病毒转移因子的体外制备方法。
背景技术
鸭病毒性肝炎简称鸭肝炎，是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种传播迅速和高度致死性传染病，是一种肝脏呈现出血炎症状态的急性烈性传染病。该病的主要特征为肝脏肿大呈斑点状出血，胆囊肿大，胆汁颜色变淡，有出血斑点和神经症状。在初次感染疫区，该病的死亡率很高，可达90％以上。
鸭病毒性肝炎主要发生于4～20日龄雏鸭，中成鸭一般不发病，鸡和鹅也不能自然发病。该病的主要传染源是病鸭和带毒鸭，主要通过消化道和呼吸道感染，饲养管理不良，如缺乏维生素和矿物质，鸭舍潮湿、拥挤等，均可促使本病发生。本病发生于雏鸭孵化季节，一旦爆发，传播很快，发病率可达100％，给养殖业带来了很大的经济损失。
转移因子(Transferfactor,TF)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的可透析小分子物质-多肽核苷酸复合物，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体正常的淋巴细胞，从而增强受体的免疫功能。可以抵抗真菌、病毒等非细菌性感染，也可以是否白介素与干扰素作用于免疫应答过程。TF含多种成分，分子量小，无热原，无抗原性，无毒副作用，是一种新型而又安全的免疫制剂。此外，转移因子无种属特异性，动物来源的转移因子可用于人体。
目前转移因子的生产工艺主要是通过研磨动物脏器等，反复冻融并经半透膜透析得到，工艺复杂，无特异性，回收率低。本发明通过体外制备抗鸭肝炎病毒特异性转移因子特异性强、产出率高，对转移因子的大规模工厂化生产以及大范围应用具有很好的促进作用。
发明内容
本发明的目的是克服现有转移因子技术中制备以及针对疾病没有特异性，治疗效果不稳定等缺点，提供一种体外免疫方法生产特异性强、成本低、产出率高、效果更好的抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的制备方法。
本发明抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，按照以下步骤进行:
(1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血20-30ml，加0.8％肝素溶液0.3m1抗凝，静置30-60min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7.2)液反复洗涤2-3次，离心速度800-1200rpm，然后用含30％犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经2-3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层，备用；
(2)将步骤(1)制备的淋巴细胞单层进行传代培养，显微镜下观察步骤(1)制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；
(3)鸭肝炎病毒的制备与提取：将鸭肝炎病毒接种于9-11日龄的鸡胚或鸭胚尿囊液中，33℃-37℃温箱孵育，24h内死亡的鸡胚或鸭胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚或鸭胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，反复冻融3-5次后，装入厚壁小瓶子内，超声15-20min，4℃、5000rpm离心20-30min，弃去沉淀，收集上清液，将上清液经4℃、7000rpm离心20-30min，弃去沉淀，收集上清液，经4℃、25000rpm离心20-30min，弃去上清液，取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15％、30％、45％、60％及80％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4℃、15000-20000rpm离心2-4h，根据鸭肝炎病毒的分子量确定鸭肝炎病毒所在位置，吸出并置于-20℃—-40℃冰箱内保存备用；
(4)抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的制备：将步骤(2)传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素(终浓度为100mg/L)和步骤(3)所得鸭肝炎病毒(终浓度为1000-1500血凝单位/ml)诱导培养，离心培养2-3天后，8000rpm、20-30min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析18-24h，超滤除菌，即得到抗鸭肝炎病毒特异性转移因子成品。
所述的抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，刺激鸡脾细胞和鸡血淋巴细胞增殖的植物血凝素剂的质量浓度为50-100mg/L。
所述的抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，制备淋巴细胞单层以及细胞培养均在无菌状态下进行。
所述的抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，离心时均需在4℃进行。
所述的抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，超滤除菌所需滤膜为0.22μm滤膜。
本发明的优点及有益效果是：
1、本发明所需鸡脾脏或外周血等原料较少，用植物血凝素和鸭肝炎病毒诱导培养诱导淋巴细胞单层即可体外生产出大量抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的混合体。
2、本发明的方法制备的抗鸭肝炎病毒特异性转移因子无需进一步的提纯，直接将混合体用于鸭。
3、本发明所得到的特异性转移因子即可起到抗鸭肝炎病毒及抗菌的作用，同时又可以提高鸭的免疫力。
4、本发明具有特异性强、成本低、产出率高、效果好等优点，是一种较为理想的鸭肝炎病毒转移因子制备方法。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1
一种抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，其步骤如下：
(1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血30ml，加0.8％肝素溶液0.3m1抗凝，静置60min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7.2)液反复洗涤3次，离心速度1200rpm，然后用含30％犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层，备用；
(2)将步骤(1)制备的淋巴细胞单层进行传代培养，显微镜下观察步骤(1)制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；
(3)鸭肝炎病毒的制备与提取：将鸭肝炎病毒接种于10日龄的鸡胚尿囊液中，37℃温箱孵育，24h内死亡的鸡胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，反复冻融3次后，装入厚壁小瓶子内，超声15min，4℃、5000rpm离心20min，弃去沉淀，收集上清液，将上清液经4℃、7000rpm离心20min，弃去沉淀，收集上清液，经4℃、25000rpm离心20min，弃去上清液，取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15％、30％、45％、60％及80％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4℃、15000离心4h，根据鸭肝炎病毒的分子量确定鸭肝炎病毒所在位置，吸出并置于-20℃冰箱内保存备用；
(4)抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的制备。将步骤(2)传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素(终浓度为100mg/L)和步骤(3)所得鸭肝炎病毒(终浓度为1250血凝单位/ml)诱导培养，离心培养3天后，8000rpm、30min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析24h，超滤除菌，即得到抗鸭肝炎病毒特异性转移因子成品。
实施例2
一种抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，其步骤如下：
(1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血20ml，加0.8％肝素溶液0.3m1抗凝，静置30min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7.2)液反复洗涤3次，离心速度800rpm，然后用含30％犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经2天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层，备用；
(2)将步骤(1)制备的淋巴细胞单层进行传代培养，显微镜下观察步骤(1)制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；
(3)鸭肝炎病毒的制备与提取：将鸭肝炎病毒接种于11日龄的鸭胚尿囊液中，33℃温箱孵育，24h内死亡的鸭胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸭胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，反复冻融5次后，装入厚壁小瓶子内，超声20min，4℃、5000rpm离心30min，弃去沉淀，收集上清液，将上清液经4℃、7000rpm离心30min，弃去沉淀，收集上清液，经4℃、25000rpm离心30min，弃去上清液，取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15％、30％、45％、60％及80％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4℃、20000rpm离心4h，根据鸭肝炎病毒的分子量确定鸭肝炎病毒所在位置，吸出并置于-20℃冰箱内保存备用；
(4)抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的制备。将步骤(2)传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素(终浓度为100mg/L)和步骤(3)所得鸭肝炎病毒(终浓度为1000血凝单位/ml)诱导培养，离心培养2天后，8000rpm、20min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析18h，超滤除菌，即得到抗鸭肝炎病毒特异性转移因子成品。
实施例3：
一种抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，其步骤如下：
(1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血25ml，加0.8％肝素溶液0.3m1抗凝，静置45min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7.2)液反复洗涤2次，离心速度1200rpm，然后用含30％犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层，备用；
(2)将步骤(1)制备的淋巴细胞单层进行传代培养，显微镜下观察步骤(1)制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；
(3)鸭肝炎病毒的制备与提取：将鸭肝炎病毒接种于9日龄的鸭胚尿囊液中，33℃温箱孵育，24h内死亡的鸭胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸭胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，反复冻融5次后，装入厚壁小瓶子内，超声20min，4℃、5000rpm离心30min，弃去沉淀，收集上清液，将上清液经4℃、7000rpm离心230min，弃去沉淀，收集上清液，经4℃、25000rpm离心30min，弃去上清液，取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15％、30％、45％、60％及80％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4℃、20000rpm离心3h，根据鸭肝炎病毒的分子量确定鸭肝炎病毒所在位置，吸出并置于-40℃冰箱内保存备用；
(4)抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的制备。将步骤(2)传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素(终浓度为100mg/L)和步骤(3)所得鸭肝炎病毒(终浓度为1500血凝单位/ml)诱导培养，离心培养2天后，8000rpm、30min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析24h，超滤除菌，即得到抗鸭肝炎病毒特异性转移因子成品。
实施例4：
一种抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，其步骤如下：
(1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血30ml，加0.8％肝素溶液0.3m1抗凝，静置30min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7.2)液反复洗涤3次，离心速度800rpm，然后用含30％犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经2天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层，备用；
(2)将步骤(1)制备的淋巴细胞单层进行传代培养，显微镜下观察步骤(1)制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；
(3)鸭肝炎病毒的制备与提取：将鸭肝炎病毒接种于10日龄的鸡胚尿囊液中，35℃温箱孵育，24h内死亡的鸡胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，反复冻融5次后，装入厚壁小瓶子内，超声18min，4℃、5000rpm离心25min，弃去沉淀，收集上清液，将上清液经4℃、7000rpm离心30min，弃去沉淀，收集上清液，经4℃、25000rpm离心25min，弃去上清液，取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15％、30％、45％、60％及80％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4℃、20000rpm离心3h，根据鸭肝炎病毒的分子量确定鸭肝炎病毒所在位置，吸出并置于-40℃冰箱内保存备用；
(4)抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的制备。将步骤(2)传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素(终浓度为100mg/L)和步骤(3)所得鸭肝炎病毒(终浓度为1000血凝单位/ml)诱导培养，离心培养2天后，8000rpm、20min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析18h，超滤除菌，即得到抗鸭肝炎病毒特异性转移因子成品。
实施例5:
对本发明所述工艺制备的抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的检测对实施例1所述体外制备的抗鸭肝炎病毒转移因子(下称“本品”)进行以下检测:
(1)标准液为黄色澄明液体，pH值在6.1-7.0之间。
(2)多肽含量测定：本品经双缩脉法测定多肽含量为0.64mg/ml。
(3)核酸含量测定：本品经地衣酚法测定核酸含量为0.43mg/ml。
(4)细菌学检测：本品中无需氧、厌氧、腐生菌和真菌存在。
(5)取健康小白鼠10只，口服本品浓缩液，相当于正常口服液剂量的20倍，观察小白鼠的生存能力变化，结果：无任何毒性反应，也无死亡现象出现，说明本品是安全的，无任何毒性和副作用。
(6)用PPD做家兔皮试实验，发现本品具有转移免疫活性的功能。
(7)用鸭肝炎病毒抗原做皮试检测，有微弱的阳性反应，说明本品具有良好的转移活性和特异性。
应用实例：
选取200只4日龄北京鸭(经过健康检查无菌)，随机分为A，B，C，D，E共5组，B，C，D，E组经过人工感染0.3m1鸭肝炎病毒强毒攻毒后作实验。A组为健康组，不感染病毒，不给药；B组阴性对照组，感染病毒，不给药；C组为本发明药物低剂量组，按禽0.3m1/只鸭/天肌肉注射；D组为本发明药物高剂量组，按鸭0.6ml/只鸭/天注射饲喂；E组为鸭肝康(香港新亚国际药业集团有限公司)，按禽0.5ml/只鸭/天注射，共治疗七日。结果表明，采用本发明药物治疗鸭肝炎病毒病有着明显的疗效。
本发明抗鸭肝炎病毒特异性转移因子实验结果如下:
上述试验结果表明，该药物低、高剂量治疗组与对照组差异非常显著(P<0.01)，说明本发明药物对鸭肝炎病毒引起的鸭肝炎具有显著的治疗作用。且与“鸭肝康”组疗效相当((P>0.01)。
Claims (5)
1.一种抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
(1)无菌环境下采取鸡脾脏或鸡血，用鸡脾脏或外周血制备淋巴细胞单层。无菌静脉采取动物全血20-30ml，加0.8％肝素溶液0.3m1抗凝，静置30-60min，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7.2)液反复洗涤2-3次，离心速度800-1200rpm，然后用含30％犊牛血清水解乳蛋白40ml进行白细胞培养，混合均匀后分装于容量100ml细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，置37℃细胞培养箱中，经2-3天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层，备用；
(2)将步骤(1)制备的淋巴细胞单层进行传代培养，显微镜下观察步骤(1)制备的淋巴细胞单层，确认其生长状态良好即可进行细胞的传代培养；
(3)鸭肝炎病毒的制备与提取：将鸭肝炎病毒接种于9-11日龄的鸡胚或鸭胚尿囊液中，33℃-37℃温箱孵育，24h内死亡的鸡胚或鸭胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚或鸭胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，反复冻融3-5次后，装入厚壁小瓶子内，超声15-20min，4℃、5000rpm离心20-30min，弃去沉淀，收集上清液，将上清液经4℃、7000rpm离心20-30min，弃去沉淀，收集上清液，经4℃、25000rpm离心20-30min，弃去上清液，取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15％、30％、45％、60％及80％的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4℃、15000-20000rpm离心2-4h，根据鸭肝炎病毒的分子量确定鸭肝炎病毒所在位置，吸出并置于-20℃—-40℃冰箱内保存备用；
(4)抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的制备：将步骤(2)传代的淋巴细胞长成单层后，用植物血凝素(终浓度为100mg/L)和步骤(3)所得鸭肝炎病毒(终浓度为1000-1500血凝单位/ml)诱导培养，离心培养2-3天后，8000rpm、20-30min离心细胞培养液，取上清液，将其置于4℃下磁力搅拌透析18-24h，超滤除菌，即得到抗鸭肝炎病毒特异性转移因子成品。
2.根据如权利要求1所述的抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，其特征在是：刺激鸡脾细胞和鸡血淋巴细胞增殖的植物血凝素剂的质量浓度为50-100mg/L。
3.根据如权利要求1所述的抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，其特征在是：制备淋巴细胞单层以及细胞培养均在无菌状态下进行。
4.根据如权利要求1所述的抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，其特征在是：离心时均需在4℃进行。
5.根据如权利要求1所述的抗鸭肝炎病毒特异性转移因子的体外制备方法，其特征在是：超滤除菌所需滤膜为0.22μm滤膜。
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