CN105524937A - 一种支持单启动子带动多个不同基因表达的载体构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种支持单启动子带动多个基因表达的载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)以PCR方法扩增以共同过渡片段连接的两个以上目标基因序列，获得包含两个以上目标基因序列的DNA片段；2)将步骤1)所得DNA片段纯化；3)双酶切步骤2)获得的反应产物及真核载体骨架；4)将步骤3)内反应产物与载体骨架进行连接；5)将步骤4)所得连接产物转化入载体中。本发明操作过程简单方便，只需要经过两次不同的PCR循环，实现在同一个真核表达载体内同时表达两个甚至多个基因。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物载体构建方法，具体涉及一种支持单启动子带动多个不同基因表达的载体构建方法。
背景技术
表达载体的构建是生物工程技术最常用的技术方法，是实现基因表达调控、进而研究基因功能的实践基础。生物体内，基因经过翻译后表达蛋白质是其发挥作用最主要形式之一，而蛋白质通常会形成一个相互作用蛋白网络进而在“信息网”内受到不同外界环境的调节，进而通过不同的蛋白partner，发挥相应的作用。研究两种甚至多种蛋白质之间的相互作用关系是目前基因蛋白质组学的主要研究方向之一。目前为止，对实现在同一个细胞个体内两种基因蛋白质的调控，主要是采用分别转染各自的表达载体，但是真核表达载体本身具有一定长度，当有多个待研究基因时，多个表达载体长度会对细胞造成极大负担，降低表达效率，而且采用多个独立的表达载体，待研究基因是否能有效的实现同时表达，也是对研究课题的一大挑战。
发明内容
为解决这些问题，我们设计了一种新的基因工程技术，旨在实现在同一个真核表达载体内同时表达两个甚至多个基因。而且操作过程简单方便，只需要经过两次不同的PCR循环。
本发明提供了一种支持单启动子带动多个基因表达的载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以PCR方法扩增以共同过渡片段连接的两个以上目标基因序列，获得包含两个以上目标基因序列的DNA片段；
2)将步骤1)所得DNA片段纯化；
3)双酶切步骤2)获得的反应产物及真核载体骨架；
4)将步骤3)内反应产物与载体骨架进行连接；
5)将步骤4)所得连接产物转化入载体中；
其中，步骤1)的PCR方法是包括两个步骤；
1a)分别用F1与R1、F2与R2、……Fn与Rn为引物，分别扩增第1基因、第2基因、……第n基因，对不同的目标序列进行分别扩增，
1b)以F1和Rn分别为上下游引物，以步骤1a)PCR扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增，
其中，所述共同过渡片段为上下游目标基因序列的终止密码子-人基因非同源无义过渡序列-下游目标基因序列的起始密码子；
R1为人基因非同源无义过渡序列的反义序列-第1基因终止密码子-第1基因特异性引物序列、Rn-1为人基因非同源无义过渡序列的反义序列-第n-1基因终止密码子-第n-1基因特异性引物序列；
F2为人基因非同源无义过渡序列-第2基因起始密码子-第2基因特异性引物序列、Fn为人基因非同源无义过渡序列-第n基因起始密码子-第n基因特异性引物序列。
进一步地，n为小于或等于10的整数，优选地，n为2、3、4、5、6、7、8、9或10。
进一步地，不同目标基因中的人基因非同源无义过渡序列为相同序列或者不同序列。
进一步地，人基因非同源无义过渡序列的长度为3的倍数个碱基，优选为3-30个碱基，优选为6-12个碱基。
进一步地，F1中包含上游酶切位点，Rn中包含下游酶切位点。
进一步地，F1为保护碱基-酶切位点-KOZAK序列-第1基因的特异性序列。
进一步地，Rn为保护碱基-酶切位点-第n基因的特异性序列。
进一步地，1b)中使用的作为模板1a)所得的各个PCR扩增产物比例相同。
进一步地，步骤4中步骤3所得酶切后的载体骨架：DNA片段的摩尔比＝1：5～1:10。
如附图2，以待研究基因为A基因、B基因为例，分别设计A基因与B基因的待研究位点PCR扩增引物，A基因的上游引物F1，B基因的下游引物R2常规设计。在A基因下游引物设计时，在引物序列前段加附内xxxx片段，引物设计公式如例图。同理，B基因的上游引物序列如例图设计。引物合成后，
首次PCR循环：
分别用F1与R1以及F2与R2为引物，同时扩增A基因与B基因，实现在两个基因扩增产物之间插入“xxxx”这个共同过渡片段；
第二次PCR循环：
以F1、R2分别为上下游引物，以第一次PCR扩增产物为模板进行PCR，实现对A、B基因的融合。所有PCR扩增为常规条件。后续进行载体与基因片段连接常规步骤：根据真核表达载体骨架MCS区，选择合适的酶切位点，同时双酶切载体骨架与第二次循环产物，后进行产物T4连接酶连接。完成载体构建，测序检验有效性。
若实现对多基因的融合表达，在A、B，C、D等基因，同理增加设计C、D…各自引物即可。不过融合三个以上基因时，第4个起，为保证融合效果，最好选择在前列基因融合的基础上，重复PCR步骤来逐个添加以后基因，适量增加PCR循环次数相较于同时融合，产物会更稳定。
附图说明
图1为示例真核表达载体。
图2为PCR程序的示意图。
图3-6为实施例1的测序结果.
具体实施方式
实施例
实验试剂与仪器
PCR试剂购自日本TBYOBO
PCR引物由广州英韦创津生物技术有限公司合成
限制性内切酶EcoRI/AgeI购自TheomoFisher
酶切反应相关试剂购自广州美津生物技术有限公司
特效连接buffer购自TOYOBO
DNA纯化试剂盒购自Qiagen
实施例1
1a)PCR扩增FAM123B基因序列
模板：人基因组DNA
扩增引物：(GAATTC或GGTACC为酶切位点，CCG或CGG为保护碱基，GCCACC为KOZAK序列，ACGTTCGGAGAACTA或TTCTCCGAACGTATG为连接序列，黑色为基因特异序列)
F1：CCGGAATTCGCCACCAtggagacccaaaaggatgaagctg
R1：ACGTTCGGAGAACTActtggctaggtttccattcatggc
反应体系：
反应条件为：94℃保持2min，以94℃15s，55℃30s，68℃3min的程序循环35次，4℃保存。
1a)PCR扩增CDC42基因序列
模板：人基因组DNA
引物序列：
F2：TTCTCCGAACGTATGcagacaattaagtg
R2：CGGGGTACCCCCTAtcatagcagcacacacct
反应体系
反应条件为：94℃保持2min，以94℃15s，58℃30s，68℃1min的程序循环35次，4℃保存。
1b)PCR联合扩增FAM123B+CDC42联合序列
模板：1)+2)反应产物1:1混合
引物序列：
F1：CCGGAATTCGCCACCAtggagacccaaaaggatgaagctg
R2：CGGGGTACCCCCTAtcatagcagcacacacct
反应体系：
反应条件：94℃保持2min，以94℃15s，58℃30s，68℃4min的程序循环35次，4℃保存。
以下起常规进行：
2、DNA片段纯化
按照QiagenDNA纯化试剂盒说明书进行。
3、双酶切1.3)内反应产物及GV141真核载体骨架
反应体系：
反应条件：30℃45min，80℃5min，4℃保存。
4、连接反应
将步骤3所得反应产物按照载体骨架：DNA片段摩尔比＝1：5～1:10混匀，加入等体积接合反应缓冲液，16℃反应30min。
5、连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化产物测序鉴定
测序结果：
在所测得序列内定位人基因非同源无义过渡序列“TTCTCCGAACGT”片段：参见图3；分别将“TTCTCCGAACGT”前面与后面序列进行Blast与NCBI人源基因库比对：参见附图4-5。部分测序结果：参见附图6。结果提示两个基因均成功插入。
Claims (9)
1.一种支持单启动子带动多个基因表达的载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以PCR方法扩增以共同过渡片段连接的两个以上目标基因序列，获得包含两个以上目标基因序列的DNA片段；
2)将步骤1)所得DNA片段纯化；
3)双酶切步骤2)获得的反应产物及真核载体骨架；
4)将步骤3)内反应产物与载体骨架进行连接；
5)将步骤4)所得连接产物转化入载体中；
其中，步骤1)的PCR方法包括两个步骤；
1a)分别用F1与R1、F2与R2、……Fn与Rn为引物，分别扩增第1基因、第2基因、……第n基因，对不同的目标序列进行分别扩增，
1b)以F1和Rn分别为上下游引物，以步骤1a)PCR扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增，
其中，所述共同过渡片段为上下游目标基因序列的终止密码子-人基因非同源无义过渡序列-下游目标基因序列的起始密码子；
R1为人基因非同源无义过渡序列的反义序列-第1基因终止密码子-第1基因特异性引物序列、Rn-1为人基因非同源无义过渡序列的反义序列-第n-1基因终止密码子-第n-1基因特异性引物序列；
F2为人基因非同源无义过渡序列-第2基因起始密码子-第2基因特异性引物序列、Fn为人基因非同源无义过渡序列-第n基因起始密码子-第n基因特异性引物序列。
2.根据权利要求1所述的支持单启动子带动多个基因表达的载体构建方法，n为小于或等于10的整数，优选地，n为2、3、4、5、6、7、8、9或10。
3.根据权利要求1-2任一项所述的支持单启动子带动多个基因表达的载体构建方法，不同目标基因中的人基因非同源无义过渡序列为相同序列或者不同序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的支持单启动子带动多个基因表达的载体构建方法，人基因非同源无义过渡序列的长度为3的倍数个碱基，优选为3-27个碱基，更优选6-12个碱基。
5.根据权利要求1-4任一项所述的支持单启动子带动多个基因表达的载体构建方法，F1中包含上游酶切位点，Rn中包含下游酶切位点。
6.根据权利要求1-5任一项所述的支持单启动子带动多个基因表达的载体构建方法，F1为保护碱基-酶切位点-KOZAK序列-第1基因的特异性序列。
7.根据权利要求1-6任一项所述的支持单启动子带动多个基因表达的载体构建方法，Rn为保护碱基-酶切位点-第n基因的特异性序列。
8.根据权利要求1-7任一项所述的支持单启动子带动多个基因表达的载体构建方法，1b)中使用的作为模板1a)所得的各个PCR扩增产物比例相同。
9.根据权利要求1-8任一项所述的支持单启动子带动多个基因表达的载体构建方法，步骤4中步骤3所得酶切后的载体骨架：DNA片段的摩尔比＝1：5～1:10。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105849364A (zh) * | 2013-11-27 | 2016-08-10 | 哈里伯顿能源服务公司 | 井底组件光纤形状感测 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101899434A (zh) * | 2010-06-18 | 2010-12-01 | 南方医科大学 | 一种可连接多片段的重叠延伸pcr方法 |
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| CN105849364A (zh) * | 2013-11-27 | 2016-08-10 | 哈里伯顿能源服务公司 | 井底组件光纤形状感测 |
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