CN105524131B - 一种黄酮类化合物TA31a及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种黄酮类化合物TA31a及其制备方法与用途，所述的化合物结构式如式1，命名为6,8,4＇‑三羟基黄酮‑7‑C‑吡喃葡萄糖基‑4＇‑O‑(4＇＇＇‑吡喃葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷，呈黄色粉末状，分子式为C33H40O20。所述化合物的制备方法，其特征在于以菥蓂子为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、反相硅胶柱层析、高效液相色谱分离纯化。本发明化合物具有明确的抗氧化活性、抗肿瘤活性、免疫增强活性以及PC12细胞保护作用，为临床应用提供了一种新的选择。

Description

一种黄酮类化合物TA31a及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种黄酮类化合物TA31a及其制备方法与用途。
背景技术
菥蓂子是藏药中常用的一种药物，隶属于十字花科(Brassicaceae)、菥蓂属(Thlaspi arvense L.)植物菥蓂的干燥种子。据传统医药典籍《神农本草经》以及《中华本草》记载，菥蓂子性辛、微温。主明目，目痛泪出，益精光，补五脏，除痹，祛风湿，主治目赤肿痛，迎风流泪，风湿痹痛等。藏药典籍《晶珠本草》记载菥蓂子具有清肾热、肺热，治疗各种肾病之功效，在藏药中被广泛应用，具有非常重要的作用。目前菥蓂子的研究不是很多，仅少量文献报道其具有抗肿瘤、抗抑郁以及保肝的作用，国内外尚无其他生物学活性的研究报道。
同时国内外对菥蓂子的化学成分的研究报道较少，主要为菥蓂子油方面的研究。国内外有少量关于菥蓂子种子油提取工艺、种子油组分分析的报道。如：
涂杰等人(涂杰,张新申,李翔等.GC-MS分析菥蓂籽炒香前后挥发油的化学成分及其变化[J].华西药学杂志,2007,(01):1-4.；涂杰,张新申,罗霞等.菥蓂籽挥发油的GC/MS分析[J].化学研究与应用,2006,(11):1340-1342.)利用GC/MS对菥蓂子的挥发油成分进行了分析，显示菥蓂子挥发油中含有大量的不饱和脂肪酸，且主要的化学成分为4-异硫氰酸基-1-丁烯和烯丙基异硫氰酸酯。
Roque L.Evangelista(R.L.Evangelista,T.A.Isbell,S.C.Cermak.Extractionof pennycress(Thlaspi arvense L.)seed oil by full pressing[J].IndustrialCrops and Products,2012,37(1):76-81.)探讨了种子水分和炒制对菥蓂子压榨性质的影响，通过固形物含量、游离脂肪酸、颜色、Ca、P、Mg、S等含量对其种子油品质进行评价，表明水分含量低以及炒制过的菥蓂子比水分含量高的具有更高的种子油回收率，且固形物含量更高，游离氨基酸含量略高，颜色略好，磷脂的含量升高。而硫的含量差别较大，主要取决于种子的水分和炒制的程度。
Bryan R.Moser(B.R.Moser,S.N.Shah,J.K.Winkler-Moser,et al.Compositionand physical properties of cress(Lepidium sativum L.)and field pennycress(Thlaspi arvense L.)oils[J].Industrial Crops and Products,2009,30(2):199-205.)研究了菥蓂子油中脂肪酸谱，维生素E和植物甾醇含量，还测定油的物理性质，其中包括氧化稳定性，运动粘度，粘度指数，低温流动性，比重，酸值，润滑性和碘值。结果显示，菥蓂子油含量为29.0％。菥蓂子中的脂肪酸主要由芥酸(32.8％)和亚油酸(22.4％)组成；生育酚含量为851ppm，并且主要为α-生育酚(714ppm)。菥蓂子中的植物甾醇含量为8.55mg/g，主要为谷甾醇和菜油甾醇。
黑芥子苷是菥蓂子的标志性成分之一，陈玉等(陈玉,周旻,伍丽萍等.HPLC测定菥蓂子中的黑芥子苷[J].华西药学杂志,2012,(01):94-95.)建立了一种简便、重复性好的测定菥蓂子黑芥子苷的HPLC方法。色谱条件为，以C18为色谱柱，乙腈-20mmol四丁基硫酸氢铵水溶液＝20:80为流动相，检测波长227nm，流速1mL/min。
王磊磊等(王磊磊,陈聪,周旻等.近红外漫反射光谱法测定川藏道地药材菥蓂子中黑芥子苷含量[J].光谱学与光谱分析,2009,(10):2673-2676.)建立了近红外光谱检测菥蓂子黑芥子苷的方法。作者首先采用傅里叶变换近红外光谱仪确定菥蓂子的吸收波段，然后通过软件筛选出最优的检测条件，此方法能在样本量足够大的情况下准备测定出黑芥子苷的含量。
有文献报道称，菥蓂主要是以异牧荆苷为主的黄酮类化合物。成日青等(成日青,钱宇,郭慧卿等.菥蓂子总黄酮含量的测定[J].中国中医药科技,2012,(05):430-431.)利用比色法对菥蓂子中的总黄酮进行测定。70％乙醇进行提取，通过测定方法的选择，考察方法的线性关系、精密度、稳定性和重复性，建立了以芦丁为对照品，503nm为测定波长，NaNO2－Al(NO3)3－NaOH的显色法，用于菥蓂子总黄酮含量的测定。
有作者通过HPLC检测十三味菥蓂胶囊和十三味菥蓂丸中大叶茜草素的含量。张宁等(张宁,杨晓宏,马晓帆.HPLC法测定十三味菥蓂胶囊中大叶茜草素的含量[J].药物分析杂志,2007,(09):1475-1477.)建立了一种以C18为色谱柱，甲醇：0.2％磷酸溶液＝85:15为流动相，250nm为检测波长的检测方法。作者[12]通过全波长扫描，找到最佳的检测波长270nm，并比较不同方法，最终找到最适的流动相为甲醇：水＝84:16，此方法重复性好、专属性强。
涂杰等(涂杰,张新申,罗霞等.菥蓂籽微量元素化学形态研究[J].分析仪器,2006,(04):28-33.)采用了原子吸收分光光度法分析了菥蓂子中13种微量元素的含量。菥蓂子中微量元素的含量特征为:K>Ca>P>Mg>Fe>Na>Zn>Mn>Cu>As>Cd>Pb>C。且菥蓂子中Ca、Mg、K、P、Fe、Zn等微量元素含量都比较丰富，其中Fe与何首乌铁含量相当。
Hojilla-Evangelista(M.P.Hojilla-Evangelista,R.L.Evangelista,T.A.Isbell,et al.Effects of cold-pressing and seed cooking on functionalproperties of protein in pennycress(Thlaspi arvense L.)seed and press cakes[J].Industrial Crops and Products,2013,45(0):223-229.)和Selling(G.W.Selling,M.P.Hojilla-Evangelista,R.L.Evangelista,et al.Extraction of proteins frompennycress seeds and press cake[J].Industrial Crops and Products,2013,41(0):113-119.)等研究报道了菥蓂子蛋白的提取，冷压和蒸煮对菥蓂子中蛋白功能的影响。通过不同提取条件的对比，发现提取温度77℃时，菥蓂子蛋白提取率最高35％，而菥蓂子一般蛋白含量为25％左右，其他大部分成分都为碳水化合物和油。分析发现，菥蓂子蛋白的氨基酸组成是典型的植物蛋白，包括甘氨酸、谷氨酸和丙氨酸。另外，比较了不同压榨工艺对菥蓂子蛋白的影响，以确定其膳食的潜在用途。采取冷压和加热至82℃压榨的提取方法，比较蛋白的组成和功能性质(溶解性、起泡、乳化以及持水能力)。菥蓂子蛋白主要由白蛋白和球蛋白组成，少量谷蛋白，无醇溶谷蛋白。蒸煮能使白蛋白和球蛋白含量显著降低。在pH4时，蛋白溶解度最低为10％，随着pH值升高也只能达到中等溶解度35-45％。菥蓂子蛋白具有良好的发泡性和乳化性能，持水能力一般。实验表明，蒸煮会对菥蓂子蛋白产生不利影响，但是其仍具有有用的功能特性。另外Hojilla-Evangelista[16]还报道了通过盐水萃取或酸沉淀从菥蓂种子分离蛋白质，评价蛋白质的乳化性、稳定性和发泡性的功能，发现两种方法提取的蛋白功能性具有差异。
本申请的发明人从菥蓂子中分离出一种呈黄色粉末状的黄酮类化合物(6,8,4＇-三羟基黄酮-7-C-吡喃葡萄糖基-4＇-O-(4″＇-吡喃葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷)，并发现了其医药用途。
发明内容
本发明所解决的第一个技术问题是提供一种黄酮类化合物。所述化合物是从菥蓂子中分离得到，其结构式如式1，命名为6,8,4＇-三羟基黄酮-7-C-吡喃葡萄糖基-4＇-O-(4″＇-吡喃葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷。本发明化合物呈黄色粉末状，ESI-MSm/z显示其分子量756，综合1H-NMR和13C-NMR数据，其分子式为C33H40O20如下，简称TA31a。
本发明所解决的第二个技术问题是提供该黄酮类化合物(6,8,4＇-三羟基黄酮-7-C-吡喃葡萄糖基-4＇-O-(4″＇-吡喃葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷)的制备方法：该黄酮类化合物的制备方法是以菥蓂子为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、反相硅胶柱层析、高效液相色谱分离步骤制备所得，具体为：
A、浸膏提取：取菥蓂子，粉碎至20～40目，用90％～100％乙醇回流提取2～5次，每次40～80min，合并提取液、过滤，减压浓缩至浸膏；
B、有机溶剂萃取：A步骤浸膏用蒸馏水混悬，加入等体积石油醚(60℃-90℃)萃取5～8次，收集水相溶液，加入等体积乙酸乙酯萃取5～8次，收集水相溶液，加入等体积正丁醇萃取5～8次，收集正丁醇相溶液，减压浓缩至浸膏；
C、反相硅胶柱层析：B步骤浸膏用乙醇溶解，进行反相硅胶柱层析；以体积配比为1:9～6:4的乙醇-水溶液进行梯度洗脱，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；
D、高效液相色谱分离：C步骤洗脱液的1:9部分进一步用高效液相色谱分离纯化，即得所述的黄酮类化合物。
上述技术方案中，优选步骤A中的乙醇浓度为90％～100％。
上述技术方案中，优选步骤B中浸膏用蒸馏水混悬后，分别用石油醚(60℃-90℃)、乙酸乙酯萃取除杂，取萃取后的水相溶液，用正丁醇萃取，收集正丁醇相溶液。
上述技术方案中，优选步骤C中乙醇-水溶液体积配比为11:9、2:8、3:7、4:6、5:5或6:4中的至少一种。
上述技术方案中，优选步骤D中高效液相色谱分离纯化是采用20mm×250mm，5μm的C18色谱柱，流速为5～20ml/min，流动相为30～45％的甲醇，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样190～210μl，收集10.2～15.2min的色谱峰，多次累加后干燥。
本发明所解决的第三个技术问题是提供该黄酮类化合物(6,8,4＇-三羟基黄酮-7-C-吡喃葡萄糖基-4＇-O-(4″＇-吡喃葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷)在制备具有抗氧化活性的药物或保健食品中的应用。
具体的，体现本发明黄酮类化合物具有抗氧化活性是通过该黄酮类化合物具有清除DPPH自由基的能力、清除羟自由基的能力、具有清除ABTS自由基的能力、具有还原能力体现。
本发明所解决的第四个技术问题是提供该黄酮类化合物(6,8,4＇-三羟基黄酮-7-C-吡喃葡萄糖基-4＇-O-(4″＇-吡喃葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷)在制备抗肿瘤活性的药物或保健食品中的应用。
具体的，体现本发明黄酮类化合物具有抗肿瘤活性是通过该黄酮类化合物对于HGC-27肿瘤细胞增殖的抑制作用较强和抑制KM小鼠体内S180肿瘤细胞生长体现，
本发明所解决的第五个技术问题是提供该黄酮类化合物(6,8,4＇-三羟基黄酮-7-C-吡喃葡萄糖基-4＇-O-(4″＇-吡喃葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷)在制备具有免疫增强活性的药物或保健食品中的应用。
具体的，体现本发明黄酮类化合物具有免疫增强活性是通过该黄酮类化合物能够促进巨噬细胞产生NO，能促进巨噬细胞的吞噬功能，对巨噬细胞的增殖有显著影响体现。
本发明所解决的第六个技术问题是提供该黄酮类化合物(6,8,4＇-三羟基黄酮-7-C-吡喃葡萄糖基-4＇-O-(4″＇-吡喃葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷)在制备具有PC12细胞保护作用的药物或保健食品中的应用。
具体的，体现本发明黄酮类化合物具有PC12细胞保护作用是通过该黄酮类化合物能减轻H2O2对PC12细胞的损伤，能够降低PC12细胞中由H2O2损伤引起的MDA含量升高，减少PC12细胞的LDH释放量，能提高PC12细胞内SOD的活力，能提高PC12细胞内CAT酶的活力，能提高PC12细胞内GSH-Px的活力，能抑制由H2O2损伤引起的细胞内ROS含量升高，能够稳定线粒体膜电位体现，
综上，本发明黄酮类化合物(6,8,4＇-三羟基黄酮-7-C-吡喃葡萄糖基-4＇-O-(4″＇-吡喃葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷)具有明确的抗氧化活性、抗肿瘤活性、具有免疫增强活性以及PC12细胞保护作用，为临床应用提供了一种新的选择。
附图说明
图1黄酮类化合物红外图。
图2黄酮类化合物氢谱图。
图3黄酮类化合物碳谱图。
图4黄酮类化合物高分辨质谱图。
图5黄酮类化合物HSQC。
图6黄酮类化合物HMBC。
图7黄酮类化合物HMBC相关图。
图8黄酮类化合物的DPPH自由基清除能力。
图9黄酮类化合物的羟自由基清除能力。
图10黄酮类化合物的ABTS自由基清除能力。
图11黄酮类化合物的还原能力。
图12NO标准曲线。
图13黄酮类化合物对RAW264.7巨噬细胞生成NO的影响。
其中：＊，表示与空白组对比P<0.05；＊＊，表示与空白组对比P<0.01。
图14黄酮类化合物对RAW264.7巨噬细胞生成吞噬功能的影响。
其中：＊，表示与空白组对比P<0.05；＊＊，表示与空白组对比P<0.01。
图15黄酮类化合物对RAW264.7巨噬细胞生成增殖的影响。
其中：＊，表示与空白组对比P<0.05；＊＊，表示与空白组对比P<0.01。
图16黄酮类化合物HGC-27肿瘤细胞抑制率。
图17黄酮类化合物对PC12细胞存活率的影响。
其中：＊，表示与模型组对比P<0.05；#，表示与对照组对比P<0.05。
图18黄酮类化合物对细胞内MDA的影响。
其中：＊，表示与模型组对比P<0.05；#，表示与空白组对比P<0.05。
图19黄酮类化合物对LDH含量的影响。
其中：＊，表示与模型组对比P<0.05；##，表示与空白组对比P<0.01。
图20黄酮类化合物对SOD酶活力的影响。
其中：＊，表示与模型组对比P<0.05；#，表示与空白组对比P<0.05。
图21黄酮类化合物对CAT酶活力的影响。
其中：＊＊，表示与模型组对比P<0.01；##，表示与空白组对比P<0.01。
图22黄酮类化合物对GSH-Px酶活力的影响。
其中：＊，表示与模型组对比P<0.05；##，表示与空白组对比P<0.01。
图23黄酮类化合物对细胞内ROS含量影响。
其中：＊，表示与模型组对比P<0.05；##，表示与空白组对比P<0.01。
图24黄酮类化合物对线粒体膜电位的影响。
其中：A表示正常组；B表示H2O2模型组；C表示TA31a实验组。
具体实施方式
本发明一种黄酮类化合物是采用如下方法从菥蓂子中提取分离纯化而得：
取菥蓂子10kg，粉碎至20～40目，加入10倍体积95％乙醇回流提取3次，每次60min，合并提取液、过滤，减压浓缩，得浸膏1.57kg，浸膏用蒸馏水混悬，在分液漏斗中加入等体积石油醚(60℃-90℃)萃取，充分振荡后，待混合液分层后，收集水相溶液，反复操作5次后，水相溶液加入等体积乙酸乙酯萃取，充分振荡混匀后，待混合液澄清分层后，收集水相溶液，反复操作5次后，水相溶液加入等体积正丁醇萃取，充分振荡混匀后，待澄清分层后，收集正丁醇相溶液，减压浓缩，得浸膏182g。浸膏用重量比3倍的20％乙醇溶解后，进行反相硅胶柱(5cm×25cm)层析，多次上样洗脱，每次上样20ml，用体积配比为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4的乙醇-水溶液梯度洗脱，TLC监测合并相同的部分，得到6个部分；洗脱液的1:9部分进一步用半制备高效液相色谱分离纯化，以40％甲醇为流动相，采用20mm×250mm，5μm的C18制备柱为固定相，流速10ml/min，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样200μl，收集13.1min的色谱峰，多次累加后干燥，即可得该黄酮类化合物。
对该黄酮类化合物进行红外光谱分析、ESI-MS质谱分析、高分辨率质谱分析和1D、2D核磁共振分析(13C NMR、1H NMR、DEPT135、HMBC和HSQC)。
本发明一种黄酮类化合物经过ESI-MS m/z显示其分子量756，综合1H-NMR和13C-NMR数据，其化学式为C33H40O20。1H-NMR和13C-NMR数据见表1。
表1 黄酮类化合物的碳氢归属
结合IR、一维核磁数据，二维核磁数据以及高分辨数据分析(见附图1～附图6)，可确定黄酮类化合物的结构为式1所示。附图7为该黄酮类化合物的HMBC相关图。该黄酮类化合物鉴定为6,8,4＇-三羟基黄酮-7-C-吡喃葡萄糖基-4＇-O-(4″＇-吡喃葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷。
以下为本发明黄酮类化合物(以下简称TA31a)的化学活性研究实验。
1、抗氧化活性
以清除DPPH、ABTS、羟自由基及还原能力为评价指标，对本发明黄酮类化合物进行抗氧化能力测定。
1)DPPH自由基清除能力测定：100μL 0.1mM的DPPH加入100μL的样品，室温反应30min，517nm测定吸光度值。同时做不加样品的空白对照，以及只含样品的样品本底对照。
DPPH清除率％＝1-(A1-A2)/A0
A1：样品+DPPH的吸光度值；A2:样品+溶剂的吸光度值；A0：DPPH的吸光度值
结果如图8显示，本发明黄酮类化合物具有清除DPPH自由基的能力，且具有剂量依赖关系，但整体的清除能力较阳性对照组Vc要弱。通过计算得知，本发明黄酮类化合物清除DPPH的IC50值为132.95μg/mL。
2)羟自由基清除能力测定：150μL不同浓度的样品中加入25μL 1.5mM FeSO4和10μL20mM水杨酸，再加入15μL 6mM H2O2。37℃反应1h，520nm处测定吸光度值。
清除率％＝1-(A1-A2)/A0
其中：A1：样品吸光度值；A2:样品本底对照的吸光度值；A0：不加样品和H2O2吸光度值
结果如图9显示，本发明黄酮类化合物具有一定的清除羟自由基的能力，且具有剂量依赖关系，在浓度<125μg/mL条件下，对羟自由基的清除能力强于相同剂量的Vc，在浓度>125μg/mL后，清除能力低于Vc。通过计算可知，本发明黄酮类化合物清除羟自由基的IC50值分别为111.18μg/mL。
3)ABTS自由基清除能力测定：7mM的ABTS和2.45mM的过硫酸钾等体积混合，于暗处室温反应16h，用pH7.2的磷酸缓冲液稀释50倍，至吸光度值0.7左右(734nm)。再吸取此稀释液100μL加入含100μL不同浓度的样品，室温反应5min，734nm测定吸光度值。
清除率％＝1-(A1-A2)/A0
A1：样品+ABTS的吸光度值；A2:样品+溶剂的吸光度值；A0：ABTS的吸光度值
结果如图10显示，本发明黄酮类化合物具有清除ABTS自由基的能力，且具有剂量依赖关系，在浓度250μg/mL时，对ABTS自由基的清除率与Vc相当，达到100％。通过计算得，本发明黄酮类化合物清除ABTS的IC50值分别为4.64μg/mL。
4)还原能力测定：25μL样品加入50μL 0.2M pH6.0PBS和25μL的1％铁氰化钾，于45℃反应30min。再加入40μL 10％三氯乙酸和60μL 0.1％三氯化铁，700nm处测定吸光度值。
结果如图11显示，本发明黄酮类化合物具有一定的还原能力，且具有剂量依赖关系。
2、抗肿瘤活性和免疫增强活性
以促RAW264.7巨噬细胞增殖、吞噬及产NO，抗HGC-27肿瘤细胞增殖，以及小鼠体内抑瘤试验为试验平台，评价本发明黄酮类化合物的抗肿瘤活性和免疫增强活性。
(1)对巨噬细胞产NO的影响
RAW264.7细胞培养：
RAW 264.7细胞以10％胎牛血清的RPMI-1640培养液培养于37℃5％CO2饱和湿度空气的细胞培养箱中，每隔1d传代一次。传代时，用0.25％胰蛋白酶液消化贴壁的细胞60s左右，倾倒出酶液，加入新鲜的含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，并用吸管吹吸数次，以1:4比例传代培养。
NO的诱生：
按1×106个/孔将对数生长期的RAW264.7巨噬细胞加入24孔板中。培养过夜后，将样品按实验设计，加入24孔培养板，并以PBS补足至终体积为1000μL；每种浓度设3个平行孔，共5个浓度，终浓度分别为0，1，10，20，100，200μg/mL。同时，做阳性对照孔(加入终浓度为10μg/mL的LPS)。在37℃5％CO2饱和湿度空气条件下培养2d。培养结束后，分别吸取培养上清液，立即进行NO检测。
NO检测：
采用Griess法测定体系中NO的含量。NO不稳定，Griess法是测定由NO分解而成的NO-2/NO-3的比例来反应其含量。
标准曲线的绘制：
准确称取NaNO26.9g，以ddH2O定容至100mL，并进一步梯度稀释为浓度为100μM的工作液。利用ddH2O将工作液稀释至终浓度50μM，40μM，30μM，20μM，10μM，5μM，2μM，0μM。于每孔中加入等体积混合后的Griess试剂A液和B液100μL。室温反应20min后，于酶标仪上测定540nm处吸光度。以标准品浓度和吸光度值为横纵坐标，绘制标准曲线。
样品检测：
在酶标板中准确加入样品作用后的培养上清液100μL。于每孔中加入等体积混合后的Griess试剂A液和B液100μL。室温反应20min后，于酶标仪上测定540nm处吸光度。利用标准曲线方程求出上清液中NO的浓度。
以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线(图12)，推导出标准曲线方程为Y＝0.0068X+0.0428(R2＝0.9985)。将样品各浓度的吸光度数据带入标准曲线方程，求得样品各浓度细胞液上清中NO的浓度。
实验结果如图13显示，RAW264.7巨噬细胞自身产生的NO量较少，但在受到LPS刺激后，NO大量产生(P<0.01)。本发明黄酮类化合物在100μg/mL能够促进巨噬细胞产生NO(P<0.01)。
(2)对巨噬细胞吞噬能力的影响
按1×105个/孔将对数生长期的RAW264.7巨噬细胞加入96孔板中。培养过夜后，将三个化合物按实验设计，加入96孔板中，并以PBS补足至终体积为200μL；每种浓度设3个平行孔，共5个浓度，终浓度分别为0，1，10，20，100，200μg/mL。同时，做阳性对照孔(加入终浓度为10μg/mL的LPS)。
细胞在37℃5％CO2饱和湿度空气条件下培养24h。培养结束后，轻轻吸去上清液，加入1mg/mL中性红溶液100μL。30min后，吸去中性红染液，并以37℃的PBS洗板数次，直至细胞外染料全部洗净。离心并小心吸去PBS后，加入细胞裂解液(乙醇：乙酸＝24：1)100μL，4℃放置1h，至细胞全部裂解。震荡混匀后，在酶标仪上测定波长540nm处OD值。
吞噬作用是巨噬细胞行使其功能的一个重要方式。通过检测巨噬细胞内的中性红染料，可以反应巨噬细胞的吞噬能力。实验结果如图14表明，本发明黄酮类化合物能促进巨噬细胞的吞噬功能(P<0.05)。
(3)对巨噬细胞增殖的影响
将对数生长期的RAW264.7巨噬细胞按2×104个/孔浓度加入96孔板中。培养过夜后，将样品按实验设计，加入96孔培养板，并以含PBS补足至终体积为200μL；每种浓度设3个平行孔，共5个浓度，终浓度分别为0，1，10，20，100，200μg/mL。同时做空白对照孔(只加细胞培养液)。
细胞加样后在37℃5％CO2饱和湿度空气条件下培养48h，倒置显微镜下观察细胞生长状况。于培养结束前4h，弃上清。每孔加入100μL的PBS，然后加入5μL浓度为5mg/mL的MTT继续培养，培养结束后，每孔加10％SDS(用0.01M的HCl配制)100μL，37℃下放置过夜。振荡混匀，使结晶物充分溶解。在570nm波长处用酶标仪测定每孔OD值。
通过实验如图15发现，本发明黄酮类化合物对单核巨噬细胞株RAW264.7都有明显的促进或抑制增殖的作用(P<0.05)，说明其对巨噬细胞的增殖有显著影响。
(4)抗HGC-27细胞增殖的测定
细胞培养：
HGC-27细胞以含10％胎牛血清的DMEM培养液培养于37℃5％CO2饱和湿度空气的细胞培养箱中，每隔1d传代一次。传代时，用0.25％胰蛋白酶液消化贴壁的细胞30s左右，倾倒出酶液，加入新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM培养液，并用吸管吹吸数次，以1：4比例传代培养。
细胞增殖实验：
将对数生长期的HGC-27巨噬细胞按3000个/孔浓度加入96孔板中。于37℃培养箱中孵育过夜，将样品按实验设计，加入96孔培养板，并以含10％胎牛血清的无酚红DMEM培养液补足至终体积为200μL；每种浓度设3个平行孔，共5个浓度，终浓度分别为0，1，10，20，100，200μg/mL。同时做空白对照孔(只加细胞培养液)。
细胞加样后在37℃5％CO2饱和湿度空气条件下培养48h，倒置显微镜下观察细胞生长状况。于培养结束前4h，弃上清，每孔加入100μL PBS，然后加入5μL浓度为5mg/mL的MTT继续培养，培养结束后，每孔加10％SDS(用0.01M的HCl配制)100μL，37℃下放置过夜。振荡混匀，使结晶物充分溶解。在570nm波长处用酶标仪测定每孔OD值。
结果如图16所示，本发明黄酮类化合物对于HGC-27肿瘤细胞增殖的抑制作用都较强，具有抗肿瘤作用。
(5)小鼠体内抑瘤试验
取腹腔接种S1807d后的荷瘤小鼠，以注射器在无菌条件下抽取腹水，腹水应为乳白至淡黄色，无血色。以无菌生理盐水稀释至4×107个/ml，置于冰水浴中备用。
KM小鼠(18-22g)购回后，在每只小鼠右侧腋窝皮下准确接种瘤液0.2ml，饲养过夜后，分组。接种次日，小鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半。其中空白组每日腹腔注射生理盐水0.1ml/10g，给药组腹腔注射本发明黄酮类化合物0.1ml/10g(2mg/10g)，连续给药7天。末次给药4h后，颈椎脱臼处死小鼠，分离腋下肿瘤并立即称瘤重。
结果如表2所示，本发明黄酮类化合物对于S180肿瘤细胞的体内抑瘤率为67.2％，具有抗肿瘤的作用。
表2 KM小鼠体内抑瘤试验
3、PC12细胞保护作用
(1)细胞活力测定(MTT比色法)
细胞存活率用细胞增殖抑制实验(MTT比色法)测定。取对数生长期的PC12细胞，按40000个/孔加入96孔板中，37℃5％CO2培养箱中孵育过夜。将受试样品按实验设计加入96孔板中，并以培养基补足至终体积200μL；每个浓度设置3个平行孔，共5个浓度梯度，终浓度分别为0，1，10，20，100，200μg/mL。加入受试样品后，与细胞共同孵育6h，然后加入终浓度200μM的H2O2进行细胞损伤，同时做不加受试样品和H2O2的对照孔，以及只加H2O2的模型组。将细胞板置于37℃5％CO2培养箱中继续孵育18h，弃去上清液，加入100μL的缓冲液和5μL5mg/mL的MTT，继续培养4h后，每孔加入100μL SDS，过夜培养。于570nm处测定吸光度值。吸光度值与细胞存活率具有正相关性，因此，吸光度值能反应PC12细胞的存活率。各组细胞存活率通过下列公式进行计算。
细胞活力(％)＝实验组吸光度值/对照组吸光度值×100
从图17可以看出，与对照组(规定对照组细胞活力为100％)相比，模型组细胞活力显著降低(P<0.05)，细胞活力52％，表明PC12细胞对200μM的H2O2非常敏感，造模成功。与模型组相比，本发明黄酮类化合物浓度100μg/mL～200μg/mL范围内，具有显著差异性(P<0.05)，说明其能减轻H2O2对PC12细胞的损伤，作用具有剂量依赖性。200μg/mL时，本发明黄酮类化合物的PC12细胞存活率为为81.21％。
(2)细胞内MDA、LDH含量，以及SOD、CAT、GSH-Px酶活力的测定
样品准备：
取对数生长期的PC12细胞，按5.0×105/孔加入24孔板中，37℃5％CO2培养箱中孵育过夜。加入100μg/mL的样品后，与细胞共同孵育6h，然后加入终浓度200μM的H2O2进行细胞损伤，同时做不加样品和H2O2的对照孔，以及只加H2O2的模型组。将细胞板置于37℃5％CO2培养箱中继续孵育18h，收集上清液用于LDH含量测定，细胞沉淀中加入100μL 1％Triton溶液，将细胞板置于-80℃条件下，裂解细胞1h，即得检测样品，用于丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、过氧化氢酶(CAT)含量的测定。
MDA、LDH、SOD、GSH-px、CAT的含量测定：
参考试剂盒说明书对样品进行MDA、LDH含量，以及SOD、GSH-Px、CAT酶活进行测定。
结果如图18所示，与对照组相比(规定对照组MDA水平为100％)，模型组中MDA含量明显升高(P<0.05)；而与模型组相比，本发明黄酮类化合物给药组中MDA的含量明显降低(P<0.05)，说明其能够降低PC12细胞中由H2O2损伤引起的MDA含量升高。
样品对LDH释放量的影响如图19所示，与对照组相比(规定对照组LDH释放量为100％)，模型组中LDH含量明显升高(P<0.01)；而与模型组相比，本发明黄酮类化合物给药组中LDH的含量明显降低(P<0.05)。结果表明本发明黄酮类化合物能减少PC12细胞的LDH释放量。
结果如图20所示，与对照组相比(规定对照组SOD酶活力为100％)，模型组中SOD酶含量明显降低(P<0.05)；而与模型组相比，本发明黄酮类化合物给药组中SOD的活性明显升高(P<0.05)，说明其能提高PC12细胞内SOD的活力。
样品对CAT酶活力影响图21所示，与对照组相比(规定对照组CAT酶活力为100％)，模型组中CAT酶含量明显降低(P<0.01)；而与模型组相比，本发明黄酮类化合物给药组中CAT酶的活性明显升高(P<0.01)。说明其能提高PC12细胞内CAT酶的活力。
本发明黄酮类化合物对GSH-Px酶活力影响如图22所示，与对照组相比(规定对照组GSH-Px酶活力为100％)，模型组中GSH-Px酶含量明显降低(P<0.01)；而与模型组相比，本发明黄酮类化合物给药组中GSH-Px酶的活性明显升高(P<0.05)。说明其能提高PC12细胞内GSH-Px的活力。
(3)细胞内活性氧(ROS)的测定
取对数生长期的PC12细胞，按1.0×106/孔加入6孔板中，37℃孵育过夜。随机分组：正常组、300μM H2O2组、300μM H2O2+样品组。用100μg/mL的样品预处理细胞24h，后加入300μM H2O2诱导3小时。细胞内活性氧检测按照活性氧试剂盒进行。悬浮PC12细胞，用浓度10μM的活性氧荧光探针，在避光条件下反应，对细胞进行染色，37℃孵育30分钟后，3000转/分，离心5分钟，弃上清。利用PBS液洗涤细胞3次，把细胞外残留的荧光试剂洗干净，去掉背景荧光的干扰。在多功能酶标仪上，使用激发波长488nm，发射波长525nm，测定细胞ROS的荧光强度，胞内ROS含量与荧光强度成正比，可通过测得的荧光值反应细胞内ROS的含量。
样品对细胞内ROS含量的影响如图23所示，与对照组相比，模型组中ROS含量明显升高(规定模型组中ROS含量为100％)(P<0.01)；而与模型组相比，本发明黄酮类化合物给药组中ROS含量明显降低(P<0.05)，说明其能抑制由H2O2损伤引起的细胞内ROS含量升高。
(4)PC12细胞线粒体膜电位的测定
JC-1染料染色细胞后，线粒体膜电位完全丧失，染色后呈绿色荧光。正常细胞呈红色荧光。
取对数对数生长期的PC12细胞，按5×105/孔加入24孔板中，37℃孵育过夜。随机分组：正常组、300μM H2O2组、300μM H2O2+样品组。100μg/mL的样品与细胞共同孵育6h，然后加入终浓度300μM的H2O2进行细胞损伤。将细胞板置于37℃5％CO2培养箱中继续孵育18h，在培养结束时，离心收集细胞，用0.5ml细胞培养液重新悬浮细胞，然后加入5μg/mL的JC-1染料，于37℃中反应20min，用PBS洗涤细胞3次。利用倒置荧光显微镜观察荧光。
结果如图24显示，正常组中多数细胞呈红黄色荧光。而H2O2模型组细胞几乎呈绿色荧光，只有少数细胞依稀可见黄色荧光，表明细胞线粒体膜电位下降甚至丧失。与模型组相比，本发明黄酮类化合物能使细胞中红黄色荧光比例增加，表明其能够稳定线粒体膜电位。

Claims (8)

1.黄酮类化合物，命名为6,8,4＇-三羟基黄酮-7-C-吡喃葡萄糖基-4＇-O-(4″＇-吡喃葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷，其分子式为C33H40O20，其结构式如式1：
2.权利要求1所述的黄酮类化合物在用于制备具有抗氧化活性、抗肿瘤活性、免疫增强活性或PC12细胞保护作用中任意一项所述活性的药物或保健食品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：满足以下任意一项：
所述具有抗氧化活性是指具有清除DPPH自由基的能力；
所述具有抗氧化活性是指清除羟自由基的能力；
所述具有抗氧化活性是指具有清除ABTS自由基的能力；
所述具有抗氧化活性是指具有还原能力。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗肿瘤活性是指对于HGC-27肿瘤细胞增殖的抑制作用。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：满足以下任意一项：
所述具有免疫增强活性是指能够促进巨噬细胞产生NO；
所述具有免疫增强活性是指能促进巨噬细胞的吞噬功能；
所述具有免疫增强活性是指对巨噬细胞的增殖有显著影响。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：满足以下任意一项：
所述具有PC12细胞保护作用是指能减轻H2O2对PC12细胞的损伤；
所述具有PC12细胞保护作用是指能够降低PC12细胞中由H2O2损伤引起的MDA含量升高；
所述具有PC12细胞保护作用是指减少PC12细胞的LDH释放量；
所述具有PC12细胞保护作用是指能提高PC12细胞内SOD的活力；
所述具有PC12细胞保护作用是指能提高PC12细胞内CAT酶的活力；
所述具有PC12细胞保护作用是指能提高PC12细胞内GSH-Px的活力；
所述具有PC12细胞保护作用是指能抑制由H2O2损伤引起的细胞内ROS含量升高；
所述具有PC12细胞保护作用是指能够稳定线粒体膜电位。
7.权利要求1所述黄酮类化合物的制备方法，包括以菥蓂子为原料，经步骤A浸膏提取、步骤B有机溶剂萃取、步骤C反相硅胶柱层析、步骤D高效液相色谱分离步骤制备而得，其特征在于：
A、浸膏提取：取菥蓂子，粉碎至20～40目，用90％～100％乙醇回流提取2～5次，每次40～80min，合并提取液、过滤，减压浓缩至浸膏；
B、有机溶剂萃取：A步骤浸膏用蒸馏水混悬，加入等体积石油醚萃取5～8次，收集水相溶液，加入等体积乙酸乙酯萃取5～8次，收集水相溶液，加入等体积正丁醇萃取5～8次，收集正丁醇相溶液，减压浓缩至浸膏；
C、反相硅胶柱层析：B步骤浸膏用乙醇溶解，进行反相硅胶柱层析；用乙醇-水溶液进行梯度洗脱，乙醇-水的起始体积配比为1:9，终止体积配比为6:4，合并相同的部分，收集各部分洗脱液并浓缩；
D、高效液相色谱分离：C步骤洗脱液的1:9部分进一步用高效液相色谱分离纯化，即得所述的黄酮类化合物。
8.根据权利要求7所述的黄酮类化合物的制备方法，其特征在于：满足以下任意一项：
所述步骤A中的乙醇浓度为90％～100％；或
所述步骤B中浸膏用蒸馏水混悬后，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取除杂，取萃取后的水相溶液，用正丁醇萃取，收集正丁醇相溶液；或
所述步骤C中用乙醇-水溶液进行梯度洗脱，乙醇-水的起始体积配比为1:9，终止体积配比为6:4，在梯度洗脱过程中，乙醇-水溶液浓度至少为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5或6:4的一种；或
所述步骤D中高效液相色谱分离纯化是采用20mm×250mm，5μm的C18色谱柱，流速为5～20ml/min，流动相为30～45％的甲醇，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样190～210μl，收集10.2～15.2min的色谱峰，多次累加后干燥。
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