CN105505890A - 一种水中肠道病毒分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水中肠道病毒分离纯化方法，属于水中病毒分离纯化领域。本发明要解决现有病毒浓缩方法中浓缩样病毒回收率低和单位体积病毒含量低的问题。本发明包括两种方法：第一种方法是Plus-70设备一步分离纯化方法，该方法应用于少量水样；第二种方法是吸附洗脱超滤法，Nanoceram滤膜吸附多聚磷酸盐溶液洗脱结合Plus-70设备进行二次分离纯化方法，该方法应用于大量水样。本发明克服了Plus-70设备过滤堵塞的问题，同时保证洗脱效率和病毒活性，减小了浓缩样本终体积，提高了单位体积内病毒样本含量。

Description

一种水中肠道病毒分离纯化方法
技术领域
本发明属于水中病毒分离纯化领域；具体涉及一种水中病毒分离纯化的方法。
背景技术
病毒引发的腹泻疾病在发展中国家有显著的致死率，在发达国家也有很高的发病率，其中儿童患者数量最高。引起急性腹泻的常见病毒包括轮状病毒(RotaViruses)、诺如病毒(NoroViruses)、星状病毒(AstroViruses)、科萨奇病毒(CoxViruses)和肠道腺病毒(AdenoViruses)等。由于我国肠道病毒检测研究开展较晚，受限水中病毒分离纯化方法，对环境及生活水中肠道病毒的检测至今没有国家标准方法。在水中病毒分离纯化技术方面，现有技术普遍应用超速离心、电势吸附洗脱结合有机絮凝等方对水样本进行快速分离浓缩，但是由于不同水质中病毒稀薄程度的差异，需要过滤大量水样本，水中病毒分离纯化效率制约了后期的分子和细胞水平检测方法，另一方面由于超速离心机等设备的过于昂贵，使得普通检测实验室不具备实验能力，制约了方法的应用。
发明内容
本发明要解决现有病毒浓缩方法中浓缩样病毒回收率低和单位体积病毒含量低的问题；而提供了一种水中肠道病毒分离纯化方法。
本发明方法能够高效提取水中肠道病毒，并应用荧光定量PCR及细胞水平检测。
本发明包括两种方案：第一种方案是吸附洗脱超滤法，Nanoceram滤膜吸附多聚磷酸盐溶液洗脱结合Plus-70设备进行二次分离纯化方法，该方法应用于大量水样；第二种方案是Plus-70设备一步分离纯化方法，该方法应用于少量水样。
本发明的第一方案——水中肠道病毒分离纯化方法是采用专利号201410234128.4公开的装置进行的，具体步骤如下：
步骤一、将水样装入存储罐中，闭合顶盖；
步骤二、然后通入氮气调节存储罐内的压力，打开控制阀，使水样通过过滤器流向滤膜支架；
步骤三、待水样全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后停止进样，关闭氮气存储罐，使罐体泄压；
步骤四、更换新的存储罐，向新的存储罐中加入1L质量浓度为1％的多聚磷酸钠溶液，通入氮气使存储罐内的压力上升至0.7个标准大气压；
步骤五、打开控制阀，使多聚磷酸钠溶液流向滤膜支架进行洗脱，通过放水管收集洗脱液，待全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后停止洗脱；
步骤六、将滤液杯安装于带有样品杯的Plus-70滤芯上，组装成两套离心杯，然后用去离子水预润洗；
步骤七、取步骤五获得的洗脱液120ml分成两等份，然后分别装入两套离心杯的样品杯中后盖盖，再将两套离心杯对称放置在离心机内，离心10分钟，取出两套离心杯后将两个样品杯分别由滤液杯上取下，弃去两个滤液杯中过滤液；
步骤八、重复步骤七直至步骤五收集的洗脱液全部过滤完毕；
步骤九、将经步骤八处理后的两个带有样品的Plus-70滤芯分别与收集杯组装成两套收集装置，然后对称置于离心机中，离心2分钟，然后合并两个收集杯中样本，再用MEM培养基(minimumessentialmedium)稀释至1mL，移至离心管内-70℃保藏备用。
方案一进一步限定：步骤七中在离心力为1900×g条件下离心。步骤九中在离心力为800×g条件下离心。步骤四所述多聚磷酸钠溶液是由3.8mmol/LNa2HPO4、6.5mmol/LKH2PO4、0.05mol/L氨基乙酸(glycine)和去离子水配制的。
专利号201410234128.4公开的装置包括氮气压力罐、存储罐、过滤器和滤膜支架，所述的存储罐包括罐体和顶盖，罐体设有穹顶，穹顶设有弧形缩口，顶盖底端设有外翻沿，密封圈置于外翻沿内，顶盖由弧形缩口伸入并可通过密封圈卡在弧形缩口内，顶盖顶端对称设有耳座，耳座内装有杠杆，杠杆包括一个“n”字形的提杆、两个弧形的连接杆及两个横折形的支撑杆，所述提杆两端与连接杆通过过渡圆弧连接，连接杆的另一端与支撑杆圆弧过渡连接，杠杆的支撑杆套在耳座内，支撑杆的底端可抵在穹顶上，过渡圆弧可抵在穹顶上，穹顶上分别设有压力表、进气管和出水管，存储罐的进气管与氮气压力罐连接，出水管底端穿过穹顶伸入到罐体底部，出水管顶端设有控制阀，控制阀与过滤器通过两端连接快速接头的导管连接，过滤器与滤膜支架通过两端连接快速接头的导管连接，滤膜支架设有放水管；所述滤膜支架内设有正电荷滤膜。
本发明的第二方案——水中肠道病毒分离纯化方法是由下述步骤完成的：
步骤1、将滤液杯安装于带有样品杯的Plus-70滤芯上，组装成两套离心杯，然后用去离子水预润洗；
步骤2、向1L纯水中投入肠道病毒样本得到水样，取水样120mL分成两等分，然后分别装入两套离心杯的样品杯中后盖盖，再将两套离心杯对称放置在离心机内，离心10分钟，取出两套离心杯后将两个样品杯分别由滤液杯上取下，弃去两个滤液杯中过滤液；
步骤3、重复步骤2直至样本全部过滤完毕，收集样本；
步骤4、将经步骤3处理后的两个带有样品的Plus-70滤芯与收集杯组成两套收集装置，然后对称置于离心机中，离心2分钟，然后合并两个收集杯中样本，再用MEM培养基(minimumessentialmedium)稀释至1mL，移至离心管内-70℃保藏备用。
方案二进一步限定：步骤2中在离心力为1900×g条件下离心。步骤4中在离心力为800×g条件下离心。步骤2中肠道病毒样本按下述投入量投加：1L纯水中诺如病毒的投入量1.47E+03～1.47E+07；1L纯水中轮状病毒1.06E+03～1.06E+07；1L纯水中星状病毒2.07E+02～2.07E+06；1L纯水中科萨奇病毒3.50E+01～3.50E+06；1L纯水中肠道腺病毒3.60E+02～3.60E+07。
本发明方法相对于现有方法做出了以下改变，将洗脱液由有机溶剂牛肉浸出液换成了无机溶剂多聚磷酸盐溶液，一方面克服了Plus-70设备过滤堵塞的问题，同时保证洗脱效率和病毒活性，减小了浓缩样本终体积，提高了单位体积内病毒样本含量。
附图说明
图1是离心杯结构示意图；图2是收集装置示意图；图中1——盖，2——样品杯，3——Plus-70滤芯，4——滤液杯，5——收集杯。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式中水中肠道病毒分离纯化方法是采用专利号201410234128.4公开的装置进行的，具体步骤如下：
步骤一、将水样装入存储罐中，闭合顶盖；
步骤二、然后通入氮气调节存储罐内的压力，打开控制阀，使水样通过过滤器流向滤膜支架；
步骤三、待水样全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后停止进样，关闭氮气存储罐，使罐体泄压；
步骤四、更换新的存储罐，向新的存储罐中加入1L质量浓度为1％的多聚磷酸钠溶液，通入氮气使存储罐内的压力上升至0.7个标准大气压，
其中，所述多聚磷酸钠溶液是由3.8mmol/LNa2HPO4、6.5mmol/LKH2PO4、0.05mol/L氨基乙酸(glycine)和去离子水配制的；
步骤五、打开控制阀，使多聚磷酸钠溶液流向滤膜支架进行洗脱，通过放水管收集洗脱液，待全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后停止洗脱；
步骤六、将滤液杯4安装于带有样品杯2的Plus-70滤芯3上，组装成两套离心杯(参见图1)，然后用去离子水预润洗；
步骤七、取步骤五获得的洗脱液120ml分成两等份，然后分别装入两套离心杯的样品杯2中后盖盖1，再将两套离心杯对称放置在离心机内，在离心力为1900×g条件下离心10分钟，取出两套离心杯后将两个样品杯分别由滤液杯4上取下，弃去两个滤液杯4中过滤液；
步骤八、重复步骤七直至步骤五收集的洗脱液全部过滤完毕；
步骤九、将经步骤八处理后的两个带有样品的Plus-70滤芯3分别与收集杯5组装成两套收集装置(参见图2)，然后对称置于离心机中，在离心力为800×g条件下离心2分钟，然后合并两个收集杯中样本，再用MEM培养基(minimumessentialmedium)稀释至1mL，移至离心管内-70℃保藏备用。
具体实施方式二：本实施方式中水中肠道病毒分离纯化方法是由下述步骤完成的：
本发明的第一方案——水中肠道病毒分离纯化方法是由下述步骤完成的：
步骤1、将滤液杯安装于带有样品杯的Plus-70滤芯上，组装成两套离心杯，然后用去离子水预润洗；
步骤2、向1L纯水中投入肠道病毒样本得到水样，取水样120mL分成两等分，然后分别装入两套离心杯的样品杯中后盖盖，再将两套离心杯对称放置在离心机内，在离心力为1900×g条件下离心10分钟，取出两套离心杯后将两个样品杯分别由滤液杯上取下，弃去两个滤液杯中过滤液；
步骤3、重复步骤2直至样本全部过滤完毕，收集样本；
步骤4、将经步骤3处理后的两个带有样品的Plus-70滤芯与收集杯组成两套收集装置，然后对称置于离心机中，在离心力为800×g条件下离心2分钟，然后合并两个收集杯中样本，再用MEM培养基(minimumessentialmedium)稀释至1mL，移至离心管内-70℃保藏备用。
步骤2中肠道病毒样本按下述投入量投加：1L纯水中诺如病毒的投入量1.47E+03～1.47E+07；1L纯水中轮状病毒1.06E+03～1.06E+07；1L纯水中星状病毒2.07E+02～2.07E+06；1L纯水中科萨奇病毒3.50E+01～3.50E+06；1L纯水中肠道腺病毒3.60E+02～3.60E+07。克服了Plus-70设备过滤堵塞的问题，同时保证洗脱效率和病毒活性，减小了浓缩样本终体积，提高了单位体积内病毒样本含量。
采用下述实验验证发明效果
本发明中对五种有代表性的肠道病毒进行了分离纯化实验，他们分别是诺如病毒、轮状病毒、星状病毒、科萨奇病毒和肠道腺病毒。其中，诺如病毒是不能进行体外细胞培养的，因此应用临床腹泻样本作为病毒来源，其它病毒由体外细胞培养技术获得，病毒应用前保藏于-70℃冰箱中。
实验采用二种方法提取水中病毒，具体如下：
一步法浓缩采用具体实施方式二方法进行操作的。
Centricon二次浓缩法采用具体实施方式一所述方法进行操作的；水中病毒提取过程中，应用了zl201410234128.4水中病毒分离提取装置实施吸附过滤纯化，通过多聚磷酸盐溶液洗脱和Centricon设备进行二次浓缩，具体操作按具体实施方式一的步骤进行，浓缩后的样本利用荧光定量PCR和细胞培养方法检出回收率和单位体积病毒浓度，结果与利用原有的牛肉蛋白絮凝纯化方法进行比较，结果如表1-4。
表1.利用Centricon设备一步法分离纯化水中肠道病毒回收率
由表1可知，利用Centricon设备一步法由1L纯水中分离提取5中肠道病毒的总回收率，分别为诺如病毒68.70％，轮状病毒51.50％，星状病毒51.70％，科萨奇病毒78.11％，肠道腺病毒32.84％。
表2.比较总回收率结果
由表2可知，利用Centricon设备一步法分离纯化方法与目前应用的牛肉浸提物溶液洗脱絮凝溶解方法比较，病毒总回收率有所提高，分别是诺如病毒24.22％，轮状病毒19.73％，星状病毒8.24％，科萨奇病毒20.09％，肠道腺病毒10.91％。
表3不同分离纯化方法回收科萨奇病毒后细胞培养结果
由表3可知，本发明比较了两种不同浓缩方法回收的科萨奇病毒，对回收后的病毒样本进行了细胞培养实验，实验证明，本发明方法能够在纯化病毒过程中保持良好的病毒活性，并没有对病毒活细胞造成影响。
表4.Centricon二次浓缩后较牛肉浸提物方法提高倍数
由表4可知，利用电势滤膜吸附后，经由多聚磷酸盐洗脱结合Centricon设备进行二次浓缩方法与目前应用的牛肉浸提物溶液洗脱絮凝溶解方法比较，分离纯化样本单位体积病毒含量有所提高，分别是诺如病毒19.40倍，轮状病毒19.45倍，星状病毒12.80倍，科萨奇病毒16.10倍，肠道腺病毒11.97倍。

Claims (8)

1.一种水中肠道病毒分离纯化方法，其特征在于一种水中肠道病毒分离纯化方法是采用专利号201410234128.4公开的装置进行的，具体步骤如下：
步骤一、将水样装入存储罐中，闭合顶盖；
步骤二、然后通入氮气调节存储罐内的压力，打开控制阀，使水样通过过滤器流向滤膜支架；
步骤三、待水样全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后停止进样，关闭氮气存储罐，使罐体泄压；
步骤四、更换新的存储罐，向新的存储罐中加入1L质量浓度为1％的多聚磷酸钠溶液，通入氮气使存储罐内的压力上升至0.7个标准大气压；
步骤五、打开控制阀，使多聚磷酸钠溶液流向滤膜支架进行洗脱，通过放水管收集洗脱液，待全部通过滤膜支架内的正电荷滤膜后停止洗脱；
步骤六、将滤液杯安装于带有样品杯的Plus-70滤芯上，组装成两套离心杯，然后用去离子水预润洗；
步骤七、取步骤五获得的洗脱液120ml分成两等份，然后分别装入两套离心杯的样品杯中，再将两套离心杯对称放置在离心机内，离心10分钟，取出两套离心杯后将两个样品杯分别由滤液杯上取下，弃去两个滤液杯中过滤液；
步骤八、重复步骤七直至步骤五收集的洗脱液全部过滤完毕；
步骤九、将经步骤八处理后的两个带有样品的Plus-70滤芯分别与收集杯组装成两套收集装置，然后对称置于离心机中，离心2分钟，然后合并两个收集杯中样本，再用MEM培养基稀释至1mL，移至离心管内-70℃保藏备用。
2.根据权利要求1所述的一种水中肠道病毒分离纯化方法，其特征在于步骤四所述多聚磷酸钠溶液是由3.8mmol/LNa2HPO4、6.5mmol/LKH2PO4、0.05mol/L氨基乙酸(glycine)和去离子水配制的。
3.根据权利要求1所述的一种水中肠道病毒分离纯化方法，其特征在于步骤七中在离心力为1900×g条件下离心。
4.根据权利要求1所述的一种水中肠道病毒分离纯化方法，其特征在于步骤九中在离心力为800×g条件下离心。
5.一种水中肠道病毒分离纯化方法，其特征在于一种水中肠道病毒分离纯化方法是由下述步骤完成的：
步骤1、将滤液杯安装于带有样品杯的Plus-70滤芯上，组装成两套离心杯，然后用去离子水预润洗；
步骤2、向1L纯水中投入肠道病毒样本得到水样，取水样120mL分成两等分，然后分别装入两套离心杯的样品杯中后盖盖，再将两套离心杯对称放置在离心机内，离心10分钟，取出两套离心杯后将两个样品杯分别由滤液杯上取下，弃去两个滤液杯中过滤液；
步骤3、重复步骤2直至样本全部过滤完毕，收集样本；
步骤4、将经步骤3处理后的两个带有样品的Plus-70滤芯与收集杯组成两套收集装置，然后对称置于离心机中，离心2分钟，然后合并两个收集杯中样本，再用MEM培养基稀释至1mL，移至离心管内-70℃保藏备用。
6.根据权利要求5所述的一种水中肠道病毒分离纯化方法，其特征在于步骤2中在离心力为1900×g条件下离心。
7.根据权利要求5所述的一种水中肠道病毒分离纯化方法，其特征在于步骤4中在离心力为800×g条件下离心。
8.根据权利要求5所述的一种水中肠道病毒分离纯化方法，其特征在于步骤2中肠道病毒样本按下述投入量投加：1L纯水中诺如病毒的投入量1.47E+03～1.47E+07；1L纯水中轮状病毒1.06E+03～1.06E+07；1L纯水中星状病毒2.07E+02～2.07E+06；1L纯水中科萨奇病毒3.50E+01～3.50E+06；1L纯水中肠道腺病毒3.60E+02～3.60E+07。
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