CN105492033B - 提供组织修复的含微颗粒的具有协同作用的真皮基质及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于慢性创伤治疗的真皮基质及其生产方法，所述基质在其结构中含有具备协同作用的含抗氧化剂的微颗粒，提供真皮组织的快速修复，所述方法主要包括以下步骤：制备真皮基质系统(11)；形成微颗粒(12)；将所述微颗粒和所述真皮基质系统组合。

Description

提供组织修复的含微颗粒的具有协同作用的真皮基质及其生 产方法

技术领域

本发明涉及用于治疗慢性创伤的真皮基质及其生产方法，所述真皮基质能够实现真皮组织的快速修复，并且在其结构中包括具备协同作用的含抗氧化剂的微颗粒。

背景技术

在当今的慢性创伤治疗中，使用了诸如乳剂、凝胶、洗液和软膏等常规产品。为了使所述产品在治疗中有效，它们需要频繁施用。此外，施用剂量也必须被标准化。

然而现有治疗可以消除这些问题，其是常规方法的一部分。在这样的治疗应用中，使用异种移植和移植物转移(graft transfer)方法，以便在大规模组织损失的区域上更换新组织。这些方法均是疼痛的，且同时可能具有基于供体的缺点。

慢性创伤治疗中已知的最新的最终阶段包括创新制剂。与现有技术方法相比，微颗粒系统和基质系统提供了有利的治疗方法。作为进行文献研究的结果，观察到已开发出了包含协助区域愈合的试剂的基质，其提供了必要的机械支持，从而通过闭塞效应对因各种损伤而损失的组织区域进行补偿。已制备了真皮基质，其特别地包括胶原蛋白-壳聚糖、胶原蛋白-明胶，胶原蛋白-糖胺聚糖以及胶原蛋白-透明质酸组合物，并通过向它们孵育成纤维细胞来制备，并且已观察到了创伤组织的愈合。

真皮基质是为了有效支持细胞生长和发育而用天然或合成的聚合物制备的系统，并且这些真皮基质在创伤治疗中的使用开辟了一个新的视野。这些结构的主要目的是使受损的组织重建，并将不同的生物材料和生物活性分子运载到该区域。

现今存在具有不同特点的使上皮愈合的商购产品。在所述产品中，使用了用壳聚糖(其是天然聚合物)制备的创伤贴片，或者使用诸如合成聚氨酯和PLGA等聚合物，并且提供了其中角质形成细胞在上皮中形成小集落的介质，从而获得了更快的上皮形成。在替换上皮的所述产品中，提供了二维结构。然而，此种在上皮形成中优选的维度在需要三维结构的替代治疗中是不足的。

创伤区域易患感染和类似的并发症，并且防止感染的最有效方法是尽快提供有效治疗。受伤后的头六小时对细菌拓殖而言是更重要的时间段。防止感染的最有效方法是通过以下方式封闭创伤：在创伤上使用无菌贴片，并且在用无菌贴片封闭创伤前在无菌条件下清理创伤，这些条件甚至比抗生素治疗更有效。出于此原因，立即覆盖创伤、增加真皮层的自我修复并且发育出完全分层的组织(其会替换组织区域)是当前研究中需要解决的一些重要课题。

用于治疗创伤的常规方法(软膏、乳剂、凝胶、洗液)不能克服一些基本问题，例如创伤感染，脱水，热损失，活组织仍未受保护，蛋白质、红细胞、白细胞、免疫因子和微量元素的损失。

常规制剂的最重要的缺点之一是施用的量可能变化或改变，因此施用的剂量不能被标准化，并且需要频繁进行施用。每次进行施用时，病人都会感觉疼痛，这使得治疗过程更加困难。此外，由于表面活性剂或者这些制剂中所用的诸如防腐剂和香料等成分，也会出现过敏反应。除了常规疗法，作为在大规模组织损失的情况下进行的另一种疗法，移植物转移也具有许多缺点。这些缺点可以是由供体传播的疾病，或者是在取走移植物的供体区域形成新创伤。尽管自体移植为优选的材料，但在某些情况下在患者中可能不会有任何适合的可转移组织。除此之外，在取走移植组织的区域会出现新的创伤。另一个缺点是这些过程可能需要外科手术。为了防止诸如感染等并发症并克服所述缺点，认为创新方法对于缩短治疗时间是必要的。

为了达到这些目的而制备的具有胶原蛋白、壳聚糖和明胶的制剂是二维系统，并且所述二维系统不足以提供物理支持。为了解决此问题，用于确保用胶原蛋白制备的真皮基质是包含化学材料的三维系统的方法会破坏细胞生长所需的条件。在现有技术中，为达到所述目的而开发的产品不包含微颗粒，并且其作用类似于使细胞可略微更快生长的创伤贴片。

发明内容

本发明的目的是提供一种真皮基质，其提高慢性创伤治疗的效率、缩短愈合时间并确保组织修复。

本发明的另一目的是提供一种真皮基质，其不仅包含胶原蛋白和层粘连蛋白，而且还包含携带抗氧化剂的微颗粒，所述抗氧化剂有助于通过展现协同作用而加快组织修复速度。

本发明的另一目的是获得一种能够实现组织修复的真皮基质生产方法，其中使用由位于真皮天然结构内的蛋白质形成的试剂及其它组分。

本发明的另一目的是提供一种真皮基质生产方法，其通过采用并非化学方法的交联方法而支持细胞生长和组织修复。

本发明的另一目的是提供一种真皮基质生产方法，其能够实现组织修复，并且通过实施冻干工序而防止热敏性生物材料降解。

具体实施方式

附图中示出了为了达到本发明的目的而产生的真皮基质生产方法，其提供组织修复，其中所述附图图示了以下内容；

表1是本发明的方法的流程图。

具有协同作用并提供组织修复的真皮基质生产方法(10)，其特征在于，其包括以下步骤：

制备真皮基质系统(11)，

制备胶原蛋白溶液系统(111)，

将层粘连蛋白添加到胶原蛋白溶液上并混合(112)，

冷冻并储存混合物(113)，

将储存的混合物冻干(114)，

使冻干物交联(115)，

形成微颗粒(12)，

制备聚合物的水溶液(121)，

制备磷脂、抗氧化剂和醇混合物(122)，

将水溶液添加到醇混合物上并且混合(123)，

喷雾干燥所得到的全部混合物(124)，

将微颗粒与真皮基质系统组合(13)。

本发明的方法(10)主要基于：分别制备真皮基质系统和微颗粒系统，其后将微颗粒喷洒到真皮基质上，从而将这两个系统物理组合。

根据本发明的方法(10)，首先通过将胶原蛋白添加到酸性酸溶液中制备胶原蛋白溶液(111)，从而制成真皮基质系统(11)。在本发明的优选应用中，将牛胶原蛋白以0.1％的浓度添加至0.1M的酸性酸溶液中(111)。

接下来，将层粘连蛋白添加到胶原蛋白溶液上(112)。在本发明的优选实施方式中，取2.5ml已制备的胶原蛋白溶液，添加20μl层粘连蛋白，并且将其全部在冰浴中混合(112)。当使用冰浴时，其目的在于防止存在于混合物内的蛋白质结构劣化。在本发明的优选实施方式中，用10-G探针以3000转/分钟的速度进行混合1分钟。

将包含胶原蛋白和层粘连蛋白的混合物在-20±1℃的温度下搁置12小时并冷冻(113)。在此之后，对已冷冻的所述混合物进行24小时的冻干(114)。由此确保防止所述混合物内的热敏性生物材料劣化。

利用紫外交联仪(UV交联仪)设备在254nm波长下对已获得的包含胶原蛋白和层粘连蛋白的冻干结构物进行交联(115)。在另一处，为了提供微颗粒的形成(12)，制备聚合物水溶液(121)。为了确保这一点，使用0.2g透明质酸钠盐(HA)并将其溶于150ml纯水中。在此期间，将二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和白藜芦醇混合在醇中并溶解(122)。在本发明的优选实施方式中，将0.7g～0.75g的DPPC和0.05g～0.1g白藜芦醇350ml添加到乙醇中并混合(122)。使用白藜芦醇(抗氧化剂)显示出与形成蛋白结构物的胶原蛋白和层粘连蛋白的协同作用，并因此提高了最终产物对于组织修复的效率。此外，确保了长时间保持最终产物的基质完整性。

将已制备的HA溶液(121)添加到DPPC和白藜芦醇的醇溶液(122)上并在40±1℃混合(123)。将已制备的全部混合物置于喷雾干燥器中，并且通过喷雾获得微颗粒(124)。在本发明的优选实施方式中，已调节喷雾干燥器以使初始温度为180℃，且喷雾速度为400L/h。

将用喷雾干燥器制备的负载有白藜芦醇的HA微颗粒作为干粉喷到预先制备的真皮基质(11)上，并且将所述两个系统组合(13)。根据本发明优选实施方式，喷洒的微颗粒包括50μΜ白藜芦醇。已获得的这些基质特别用于慢性创伤治疗，并且其显著提高创面愈合的速度。

为了测定用本发明方法获得的真皮基质的直径和厚度，已采用自动罗盘，并对基质的直径和厚度进行了评估。作为已经进行的分析的结果，所获得的真皮基质的平均直径为2.24±0.05cm，其厚度经测量为0.23±0.04cm。

已测定真皮基质的孔径约为至多100μm，该孔径利用扫描电子显微镜和共焦显微镜(用来确定表面形态)而获得。除此之外，观察到存在三维胶原蛋白纤维，并且微颗粒已被交联。

将针对保水能力而制备的基质在测定其重量后搁置在37±1℃水中20秒。通过计算初始重量的百分比并将其与试验完成后测量的重量进行比较，确定保水能力为84±1.5％。

使用TA-XT+质构分析装置以测定真皮基质的机械特性。作为分析的结果，通过属于该基质的功率时间曲线，计算出硬度为26N～21N、压缩性为23N/mm～18N/mm、内聚力为0.93～1且弹性值为0.8～1。作为湿气含量测定的结果，本发明真皮基质的湿气量经计算为0.2％。用激光衍射方法，位于真皮基质内的微颗粒尺寸经计算为15μm～30μm。

如在用SEM获得的图像中可见的，该制剂为球形且具有光滑表面。将通过SEM观察到的颗粒尺寸与预先进行的激光衍射分布方法的结果进行比较，发现尺寸是一致的。

已制备的微颗粒的药物负载能力经计算为0.5mg～l mg，并且封装效率经计算为97％～98.7％。

为了确定白藜芦醇从微颗粒中的释放量，用以不同的白藜芦醇浓度制备的微颗粒制剂进行了活性剂释放研究。分析结果显示，白藜芦醇从所述制剂中的24小时释放量为73％～85％。

研究了与白藜芦醇从微颗粒中的释放有关的透明质酸酶、胶原蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶的作用。用透明质酸酶和胶原蛋白酶进行了单独的酶促降解研究，以便研究酶对真皮基质的作用。不包含微颗粒的真皮基质在30分钟内被胶原蛋白酶酶促降解，而包含负载有白藜芦醇的微颗粒的真皮基质的降解则用了两倍的时间。白藜芦醇不仅在支持创伤愈合方面是有利的，而且由于其更长时间地抵抗胶原蛋白酶以保护基质完整性，故也是有利的。

使用共焦显微镜3D软件程序，以确定微颗粒是否均匀地分布在真皮基质中以及其位于何处。更新了共焦研究，并在此程序中对数据进行了评估。进行的形态学研究显示，在真皮基质顶面微颗粒的分布均匀得多，并且所述微颗粒与基质完全接触。

根据制造商的操作说明，在包括37±0.5℃和5％CO₂的潮湿条件下培养人真皮成纤维细胞(Invitrogen C-013-5C)。将不含白藜芦醇的制剂和包含白藜芦醇的微颗粒制剂与白藜芦醇溶液温育24小时，并检测所有样品对细胞活力的作用。对于白藜芦醇溶液或者空白或含活性试剂的制剂，未观察到具有细胞毒性可能，并且它们在对应于50μΜ白藜芦醇含量的浓度中显示了增加细胞增殖的作用。在已分析过的细胞内检测了诸如总谷胱甘肽、丙二醛、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等氧化应激参数。获得的结果表明，针对白藜芦醇开发的剂型包括分子水平的氧化活性。

总之，近年来进行的研究显示，创伤愈合依赖于制剂内选择的组分，并且包含形成真皮天然结构的蛋白质的创新制剂提供了高效的治疗，且治疗时间可被缩短。显然，需要为长期创伤治疗制备新的载药系统。尚不存在包含所选组合的新一代剂型。通过本发明第一次评估了与组织修复有关的真皮基质与白藜芦醇的协同作用。

Claims (13)

1.一种真皮基质生产方法(10)，其特征在于，其包括以下步骤：

制备真皮基质系统(11)；

制备胶原蛋白溶液系统(111)；

将层粘连蛋白添加到胶原蛋白溶液上并混合(112)；

冷冻和储存混合物(113)；

将储存的混合物冻干(114)；

使冻干物交联(115)；

形成微颗粒(12)；

制备聚合物的水溶液(121)，其中将透明质酸(HA)溶解在纯水中；

制备磷脂、抗氧化剂和醇的混合物(122)，其中将二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和白藜芦醇混合在醇中并使其溶解；

将水溶液添加到醇混合物上并且混合(123)；

喷雾干燥所得到的全部混合物(124)；

将所述微颗粒与真皮基质系统组合(13)，其中通过干粉式喷雾将负载有白藜芦醇的透明质酸(HA)-二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)微颗粒喷洒到所述真皮基质系统(11)上。

2.如权利要求1所述的真皮基质生产方法(10)，其特征在于包括制备磷脂、抗氧化剂和醇的混合物的步骤(122)，其中将0.7g～0.75g的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和0.05g～0.1g白藜芦醇混合在350mL醇中并使其溶解。

3.如权利要求1所述的真皮基质生产方法(10)，其特征在于将所述水溶液添加到醇混合物中并在40±1℃混合(123)。

4.如权利要求1所述的真皮基质生产方法(10)，其特征在于包括以下步骤：通过将牛胶原蛋白以0.1％的浓度添加至0.1M的酸性酸溶液中，制备胶原蛋白溶液(111)。

5.如权利要求1所述的真皮基质生产方法(10)，其特征在于包括以下步骤：取2.5mL已制备的胶原蛋白溶液，对其添加20μL层粘连蛋白，并将它们在冰浴中混合，从而将层粘连蛋白添加到所述胶原蛋白溶液上(112)。

6.如权利要求1所述的真皮基质生产方法(10)，其特征在于包括冷冻和储存混合物的步骤(113)，其中将胶原蛋白和层粘连蛋白的混合物在-20±1℃的温度下搁置12小时。

7.如权利要求1所述的真皮基质生产方法(10)，其特征在于，其包括将已储存的混合物冻干的步骤(114)，其中对已冷冻并搁置的所述混合物进行24小时的冻干，并且因此其中防止了存在于所述混合物内的对热敏感的生物材料的劣化。

8.如权利要求1所述的真皮基质生产方法(10)，其特征在于包括使冻干物交联的步骤(115)，其中利用紫外交联仪(UV交联仪)设备在254nm的波长下对冻干结构物进行交联。

9.如权利要求1所述的真皮基质生产方法(10)，其特征在于包括制备聚合物的水溶液的步骤(121)，其中将0.2g透明质酸(HA)溶于150mL纯水中。

10.通过使用权利要求1所述的方法生产的真皮基质制剂，其特征在于，其包括在胶原蛋白-层粘连蛋白支架中的负载有抗氧化剂的透明质酸(HA)-二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)微颗粒。

11.如权利要求10所述的真皮基质制剂，其中所述抗氧化剂是白藜芦醇。

12.如权利要求10所述的真皮基质制剂，其中所述制剂是可生物降解的。

13.如权利要求10所述的真皮基质制剂，其用于慢性创伤治疗。