CN105483288A - 一种手足口病病毒快速检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种手足口病病毒快速检测引物，包括如下引物对：(1)检测柯萨奇病毒A16型的引物及探针；(2)检测肠道病毒71型的引物及探针；引物及探针的序列如SEQ？ID？NO：1～6所示，上述引物在同一次检测中使用。本发明还公开了上述手足口病病毒快速检测引物在检测手足口病病毒中的应用。该试剂盒及技术方法具有操作简便、特异性强、敏感性高、成本低廉及高通量等优点，通过双通道荧光定量能实现快速检测手足口病病毒，为临床治疗提供参考。

Description

一种手足口病病毒快速检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种专用于检测手足口病主要病原体柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)的核酸序列的检测试剂盒。

背景技术

手足口病(Hand-foot-mouthdisease,HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见出疹发热性急性传染病，以婴幼儿发病为主。引起手足口病的病毒主要由小RNA病毒科、肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxasckievirus)A组的4、5、7、9、10、16型以及B组的2、5、13型、埃可病毒(ECHOvirus)和肠道病毒71型(EV71)引起，其中以EV71及CoxAl6型最为常见，常相伴造成手足口病的暴发或流行，EV71感染引起重症病例的比例较大。自20世纪60年代逐渐明确其病原体以来，手足口病已在全世界范围内引起多次暴发或流行，累及地域广泛、人口众多。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患儿可出现中枢神经、呼吸系统损害，引发脑炎、急性弛缓性麻痹、脑水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。少年儿童和成人感染后多不发病，但能够传播病毒。

现有技术中手足口病病原体检测方法包括病毒分离与中和试验鉴定两步，大概要一周以上的时间，而且步骤繁琐，费时费力。因此及时检测EV71和CoxA16，可为临床医生提供必要的实验诊断依据。

实时荧光定量PCR技术(Real-timequantitativePolymeraseChainReaction简称RealTimePCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(或cDNA)进行定量检测的方法。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。目前已有多种运用定量PCR技术的试剂盒应用于临床疾病相关的病原体检测、基因分型、突变研究等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种结果可靠、用时短的手足口病病毒检测试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述手足口病病毒检测试剂盒的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种手足口病病毒快速检测引物，包括如下引物对：

(1)检测柯萨奇病毒A16型的引物及探针：

上游引物F1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；

下游引物R1，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；

荧光探针T1，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；

(2)检测肠道病毒71型的引物及探针：

上游引物F2，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；

下游引物R2，其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；

荧光探针T2，其核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；

上述引物及探针在一次检测中共同使用。

作为本发明的优选，所述荧光探针T1的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记tamra淬灭基团。

作为本发明的优选，所述荧光探针T2的5’端标记HEX荧光基团，3’端标记tamra淬灭基团。

上述手足口病病毒快速检测引物在制备手足口病病毒检测试剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

一种手足口病病毒快速检测试剂盒，该试剂盒中包含权利要求1～3任一所述的引物，该试剂盒还包括如下试剂：

(1)病毒RNA提取试剂；

(2)RT-PCR反应液。

上述手足口病病毒快速检测试剂盒在检测手足口病病毒中的应用也在本发明的保护范围之内。

作为本发明的优选，利用该手足口病病毒快速检测试剂盒检测时，

RT-PCR扩增体系如下：反应体系为25μL，其中2×RT-PCR缓冲液12.5μL，ExTaqHS0.5μL，RT酶混合物II0.5μL，上游引物F1、下游引物F2、上游引物F2、下游引物R20.48μmol/L，荧光探针T1、荧光探针T20.24μmol/L，模板RNA8μL，DEPC水1.5μL；

RT-PCR反应条件如下：42℃30min；95℃2min进行逆转录；然后95℃5s，55℃35s，进行40个循环；荧光采集点在55℃，反应体积设置为25μL。

有益效果：利用双通道荧光定量的优点，本发明采用聚合酶链式反应及分子信标荧光探针技术同时对柯萨奇病毒A16型(CoxAl6)和肠道病毒71型(EV71)的基因进行扩增检测，从而判断是否感染手足口病病毒。该试剂盒及技术方法具有操作简便、特异性强、敏感性高、成本低廉及高通量等优点，通过双通道荧光定量能实现快速检测手足口病病毒，为临床治疗提供参考。

附图说明

图1为1例柯萨奇病毒A16型(CoxA16)基因检测阳性结果图，阳性对照品Ct值为18，阴性对照品Ct值为无数值；标本Ct值为27。

图2为1例肠道病毒71型(EV71)基因检测阳性结果图，阳性对照品Ct值为19，阴性对照品Ct值为无数值；标本Ct值为“29”。

图1和图2中横坐标为循环数；纵坐标为荧光值；

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：检测柯萨奇病毒A16型(CoxAl6)和肠道病毒71型(EV71)的基因的核酸序列。

以下实施例中所用的引物及荧光探针均委托英潍捷基(上海)贸易有限公司合成：

上游引物F1(SEQIDNO：1)：5′-AAACCCAATGGTGAGCTAGTCC-3′；

下游引物R1(SEQIDNO：2)：5′-GATGGGTTGGTGGCAGTCTG-3′；

上游引物F2(SEQIDNO：3)：5′-GGAGATAGGGTGGCAGATGTAATT-3′；

下游引物R2(SEQIDNO：4)：5′-AATTTCAGCAGCTTGGAGTGCT-3′；

荧光探针T1(SEQIDNO：5)：Fam-5′-TGCAGTACATGTATGTCC-3′-tamra；

荧光探针T2(SEQIDNO：6)：hex-5′-GTGAGCAGTCATCG-3′-tamra。

实施例2：检测柯萨奇病毒A16型(CoxAl6)和肠道病毒71型(EV71)的方法。

仪器：Roche荧光定量PCR检测仪，BECKMAN22R台式微量冷冻离心机，Eppendorf5810R台式冷冻离心机，太仓华利达实验室设备公司WH-866型涡旋振荡器。

(1)病毒RNA提取试剂

病毒RNA的抽提按照Qiagen生物公司生产的ReansyMiniKit病毒RNA抽提试剂盒说明书提取，得到病毒RNA备用。

(2)选用一步法荧光RT-PCR，试剂购自宝生物工程公司，反应体系为25μL，其中2×RT-PCR缓冲液12.5Μl，ExTaqHS0.5μL,RT酶混合物II0.5μL，上游与下游混合引物(20μmol/L)0.6μL，探针(20μmol/L)0.3μL，模板RNA8μL，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水1.5μL。

(a)配置反应液：从-20℃冰箱取出试剂盒的各组分，室温融化，放冰盒上备用。加样前10分钟之内，按检测样本数配置PCR反应液Xμl：

X＝(12.5μL2×RT-PCR缓冲液+0.5μLExTaqHS+0.5μLRT酶混合物II+0.6μL上下游引物(2对引物)+0.3μL探针(2条探针)+1.5μLDEPC水)×(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)。

振荡混匀后，2000rpm离心5s，按每人份17μl分装到96孔PCR反应板中，传至样本制备区备用。

(b)加样：向分装好试剂的反应孔中，分别加入样本RNA模板8μl(若样本裂解产物保存在-20℃，使用前置室温解冻，以13000rpm离心5min)，阳性对照孔加入8μl阳性对照品，阴性对照孔加入8μl阴性对照品，空白对照孔加入8μl双蒸水，加样过程要求冰上操作。贴好封口膜，3000rpm离心30s，放入仪器进样槽。

(c)RT-PCR扩增：Roche荧光定量PCR仪同时进行柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型基因检测，反应条件如下：42℃30min,95℃2min进行逆转录，然后95℃5s,55℃35s,进行40个循环,荧光采集点在55℃，反应体积设置为25μL。保存文件，运行。

(d)结果分析，具体包括如下步骤：

Roche荧光PCR检测仪点击分析，本产品属于两重荧光检测，荧光信号收集时设定两个荧光，仪器检测通道选择分别为Fam荧光素和HEX荧光素。荧光信号收集设在55℃。选取定量模式，进入分析窗口，选定噪音线项，阈值设定为刚好超过无规则的噪音线的最高点(可根据实际情况适当调整)，且阳性曲线无拐点，保证噪音线项下的数值和分析项下的域值一致。每次实验空白对照孔无Ct值，结果合格。点击计算，自动计算得到每个测试的Ct值。

(e)阴阳性对照品结果标准及处理，具体按照如下步骤判定：

阴性对照品PCR扩增的Ct值应无数值或大于40且增长曲线不规则；阳性对照品PCR扩增增长曲线呈S型曲线且Ct值小于35。

(3)步骤(2)所得的样本耐药基因检测结果判断，具体按照如下标准：

(a)如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为无数值或大于40，则判样本结果为阴性。

(b)如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<40，则按以下方法判断：

若样本的CT<35，则判样本结果为阳性；

检测样本Ct≥35，重新配制PCR反应液进行PCR扩增，复查结果如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为无数值或大于40，则判样本结果为阴性。如果增长曲线呈S型且Ct值仍旧小于40则判样本结果为阳性。

将本发明所述的试剂盒用于50例临床疑似手足口病患者样本检测，检测结果与Elisa法进行比对，检测结果如下表：

上述50例标本中，两种检测方法所得结果一致。综上所述，本试剂盒具有操作简便快捷，灵敏、特异，成本低廉，本发明解决了现有技术中检测手足口病病原体的方法所需周期长、灵敏度较低等问题，对手足口病病毒中柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型基因同时进行快速检测，用于临床能有利于医师进行快速诊断，改善治疗方案，减少抗生素药物的滥用。该技术方案技术门槛低，且适用于其他类型基因的检测，易于推广，具有较好的应用前景。

Claims (7)

1.一种手足口病病毒快速检测引物，其特征在于，包括如下引物对：

(1)检测柯萨奇病毒A16型的引物对及探针：

上游引物F1，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；

下游引物R1，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；

荧光探针T1，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示；

(2)检测肠道病毒71型的引物对及探针：

上游引物F2，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；

下游引物R2，其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；

荧光探针T2，其核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；

上述引物及探针在一次检测中共同使用。

2.根据权利要求1所述的手足口病病毒快速检测引物，其特征在于，所述荧光探针T1的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记tamra淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的手足口病病毒快速检测引物，其特征在于，所述荧光探针T2的5’端标记HEX荧光基团，3’端标记tamra淬灭基团。

4.权利要求1～3任一所述的手足口病病毒快速检测引物在制备手足口病病毒检测试剂中的应用。

5.一种手足口病病毒快速检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包含权利要求1～3任一所述的引物，该试剂盒还包括如下试剂：

(1)病毒RNA提取试剂；

(2)RT-PCR反应液。

6.权利要求5所述的手足口病病毒快速检测试剂盒在检测手足口病病毒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用该手足口病病毒快速检测试剂盒检测时，

RT-PCR扩增体系如下：反应体系为25μL，其中2×RT-PCR缓冲液12.5μL，ExTaqHS0.5μL，RT酶混合物II0.5μL，上游引物F1、下游引物F2、上游引物F2、下游引物R20.48μmol/L，荧光探针T1、荧光探针T20.24μmol/L，模板RNA8μL，DEPC水1.5μL；

RT-PCR反应条件如下：42℃30min；95℃2min进行逆转录；然后95℃5s，55℃35s，进行40个循环；荧光采集点在55℃，反应体积设置为25μL。