CN105483242A - 一种与椎间盘退行性疾病相关的分子标记物 - Google Patents

一种与椎间盘退行性疾病相关的分子标记物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与椎间盘退行性疾病相关的分子标记物，更具体地涉及NDUFAB1基因在椎间盘退行性疾病诊断和治疗中的应用。本发明还公开了NDUFAB1基因在制备诊断椎间盘退行性疾病的产品中的应用，同时公开了NDUFAB1基因在制备治疗椎间盘退行性疾病的药物中的应用。

Description

一种与椎间盘退行性疾病相关的分子标记物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及NDUFAB1基因在椎间盘退行性疾病诊断、治疗中的用途。
背景技术
椎间盘退行性疾病指由椎间盘退变引起的以颈肩腰腿痛为主要表现的一系列临床综合征，为临床上的常见病和多发病，正在给越来越多的患者带来痛苦，给社会带来经济负担。目前学学者一致认为，椎间盘退行性疾病受体内外多种因素影响，常见的因素有：遗传、细胞衰老、基质合成减少、机械负荷、降解酶的增多、炎症因子和细胞凋亡增加等。
椎间盘由外部富含胶原蛋白的纤维环和呈凝胶状的结构的髓核构成。椎间盘细胞，特别是髓核细胞，在维护椎间盘的完整性中起重要作用，它可生成Ⅱ型胶原蛋白，聚集蛋白聚糖和其他细胞外基质等成分。髓核细胞数量的减少及细胞外基质的丢失是椎间盘退变的核心特性。最近研究表明，髓核细胞具有维持椎间盘内平衡不可或缺的特性，而其他各种体外和体内研究同样表明，椎间盘退行性疾病的发展的一个重要原因便是由细胞凋亡引起的细胞损失。
随着基因检测技术的发展，近年来，人们逐渐意识到遗传易感性即遗传因素对于揭示椎间盘退行性疾病具有重要作用，同时也发现了一些椎间盘退行性疾病相关的基因，但是目前临床上并没有有效的基因治疗手段。发现新的相关基因并应用于临床，将会对椎间盘疾病的诊疗起到重要的作用。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于椎间盘退行性疾病诊疗的分子标志物。与传统的诊断方法相比，使用基因标志物来诊断椎间盘退行性疾病的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种基因及其表达产物在制备诊断椎间盘退行性疾病的产品中的应用，所述基因为NDUFAB1。
进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测NDUFAB1基因及其表达产物的表达水平以诊断椎间盘退行性疾病的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断椎间盘退行性疾病的产品至少包括一对特异扩增NDUFAB1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断椎间盘退行性疾病的产品至少包括一对特异扩增NDUFAB1基因的引物；所述用免疫检测诊断椎间盘退行性疾病的产品包括：与NDUFAB1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断椎间盘退行性疾病的产品包括：与NDUFAB1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断椎间盘退行性疾病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与NDUFAB1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与NDUFAB1基因的核酸序列杂交的探针。
优选地，所述产品包括芯片、试剂盒。
本发明提供了一种诊断椎间盘退行性疾病的产品，所述的产品能够通过检测椎间盘髓核组织中NDUFAB1基因的表达水平来诊断椎间盘退行性疾病。
进一步，所述产品包括芯片、或试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测NDUFAB1基因转录水平的针对NDUFAB1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的NDUFAB1蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测NDUFAB1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括NDUFAB1蛋白的特异性抗体。
进一步，所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测NDUFAB1基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对NDUFAB1基因的引物和/或探针。根据SEQIDNO.2所示的核苷酸序列信息设计出可以用于检测NDUFAB1基因表达水平的引物和探针。
与NDUFAB1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述NDUFAB1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述NDUFAB1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与NDUFAB1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
本发明还提供了NDUFAB1基因及其表达产物在制备治疗椎间盘退行性疾病的药物中的应用。
一方面，本发明所述的“治疗椎间盘退行性疾病的药物”包括能够括促进细胞生长、抑制细胞凋亡。
另一方面，本发明所述的“治疗椎间盘退行性疾病的药物”包含NDUFAB1基因和/或其表达产物的抑制剂。所述抑制剂包括抑制NDUFAB1基因表达的物质、抑制NDUFAB1基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制NDUFAB1基因表达产物活性的物质。
进一步，本发明所述的治疗椎间盘退行性疾病的药物包括：通过干扰RNA抑制NDUFAB1基因表达的双链核糖核酸，或基于NDUFAB1抗原蛋白的肿瘤疫苗，或用于抑制NDUFAB1蛋白活性的蛋白质。
本发明还提供了一种用于治疗椎间盘退行性疾病的药物，所述药物包含NDUFAB1基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制NDUFAB1基因表达的物质、抑制NDUFAB1基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制NDUFAB1基因表达产物活性的物质。
进一步，本发明所述抑制剂包括：通过干扰RNA抑制NDUFAB1基因表达的双链核糖核酸，或基于NDUFAB1抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制NDUFAB1蛋白活性的蛋白质。
本发明还提供了上述NDUFAB1基因和/或其表达产物抑制剂在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用。
在本发明中，所述RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉默任何目的基因的表达。
为了确保NDUFAB1基因能够被高效剔除或沉默，根据NDUFAB1基因的mRNA序列设计了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashiret.al2001，Schwarzet.al2003，Khvorovaet.al2003，Reynoldset.al2004，Hsiehet.al2004，Ui-Teiet.al2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgramofWhiteheadInstitute(BingbingYuanet.al2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTMRNAiDesignerofINVITROGEN(winnerofthe2004Frost&SullivanExcellenceinResearchAward，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBIBLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
本发明的药物还可与其他治疗椎间盘退行性疾病的药物联用，多种药物联合使用可以大大提高治疗的成功率。
本发明的药物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。
本发明的药物可以使用不同的添加剂进行制备，例如稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。
稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。
表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。
添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。
本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于)，快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括OPADRY；肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素；增塑剂包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。
本发明药物的单位剂型可以使多种形式，代表性的剂型包括固体剂型如片剂、丸剂、粉剂、干粉剂、颗粒、胶囊等；液态剂型如溶液、悬浮液、乳状液、糖浆、酏剂等。
本发明所述药物可以通过任何途径给予受体，只要能达到目标组织，其可通过口服或非口服的多种途径，如口服给药、鼻内给药、腹腔内给药、肌内给药、皮下给药、皮内给药、肺内给药、直肠内给药、静脉内给药。
在本发明的上下文中，“NDUFAB1基因”包括NDUFAB1基因以及NDUFAB1基因的任何功能等同物的多核苷酸。NDUFAB1基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中NDUFAB1基因(NC_000016.10)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，NDUFAB1基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
(1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述NDUFAB1基因的编码序列是SEQIDNO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，NDUFAB1基因表达产物包括NDUFAB1蛋白以及NDUFAB1蛋白的部分肽。所述NDUFAB1蛋白的部分肽含有与椎间盘退行性疾病相关的功能域。
“NDUFAB1蛋白”包括NDUFAB1蛋白以及NDUFAB1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括NDUFAB1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物或其突变体。突变体包括等位变异体、天然突变体、诱导突变体、其氨基酸序列通过缺失、替代、增加和/或插入发生变异的突变体、与修饰的氨基酸序列功能相同的突变体及在高或低的严格条件下能与NDUFAB1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，NDUFAB1蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述NDUFAB1蛋白是具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质，提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
氨基酸序列的修饰可以源自自发突变或遗传后修饰，也可以人工诱导天然基因产生。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是NDUFAB1蛋白的融合蛋白。对于与NDUFAB1蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留NDUFAB1蛋白的生物学活性即可。
本发明的NDUFAB1蛋白也包括对SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留NDUFAB1蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断椎间盘退行性疾病”既包括判断受试者是否已经患有椎间盘退行性疾病、也包括判断受试者是否存在患有椎间盘退行性疾病的风险。
在本发明的上下文中，“治疗椎间盘退行性疾病”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈；从药物发挥的作用不同，可以包括促进细胞生长、抑制细胞凋亡。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了NDUFAB1基因表达水平与椎间盘退行性疾病的发生发展相关，通过检测受试者椎间盘组织中NDUFAB1的表达水平，可以判断受试者是否患有椎间盘退行性疾病、或者判断受试者是否存在患有椎间盘退行性疾病的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种与椎间盘退行性疾病相关的新的分子标记物-NDUFAB1基因，同传统的检测手段相比，基因诊断更及时、更特异、更灵敏。
附图说明
图1显示利用QPCR检测NDUFAB1基因在椎间盘退行性疾病髓核组织中的表达情况；
图2显示利用QPCR检测siRNA对NDUFAB1基因表达的影响；
图3显示利用MTT检测NDUFAB1基因表达对椎间盘退行性疾病髓核细胞生长的影响。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与椎间盘退行性疾病相关的基因标志物
1、样品的收集
各收集8例正常椎间盘髓核组织和椎间盘退行性疾病髓核组织样本，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备(利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行操作)
1)组织提取
在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研钵称取离体椎间盘髓核组织样本，用杵棒研磨至粉末状，然后将样本转移到一个不含RNA酶的2ml的离心管中。加入300μl裂解液，置于匀浆器内，充分研磨5min，12000g，4℃，离心10min，转移上清至新的1.5ml的离心管中。加入600μl不含RNA酶的水，用漩涡器混匀后，加入20μl蛋白酶K，在55℃温浴15min，不断涡旋混匀。14000g，室温离心1min，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外一个不含RNA酶的1.5ml离心管中，加入450μl的95％乙醇，涡旋混匀。
2)RNA吸附：
取650μl含乙醇的裂解液加到离心柱中，14000g离心1min，弃下层，将柱子重新置于收集管中；重复操作一次，然后加入400μl清洗液，14000g离心2min，弃下层，将柱子置于一新的收集管上。
3)DNase处理：
加入100μlEnzymeIncubationBuffer和15μlDNaseI，14000g离心1min，将收集管中的溶液重新移入柱中，室温放置15min。
4)RNA洗涤：
加入400μl清洗液，14000g离心1min，弃下层，将柱子重置于收集管中，然后加入400μl清洗液，14000g离心2min，弃收集管。
5)RNA洗脱：
把柱子放入1.5mlElution管中，加入30μl洗脱液，200g离心2min，使溶液充分与柱子结合，然后14000g离心1min。
3、高通量转录组测序
1)RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHatv1.3.1将清洁片段与UCSCH.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiensUCSChg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinksv1.0.3处理，Cufflinksv1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
3)差异表达基因的检测
将下载的EnsemblGTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
4、结果
RNA-seq结果显示，NDUFAB1基因在椎间盘退行性疾病组织中的表达量显著高于正常的椎间盘髓核组织。
实施例2QPCR测序验证NDUFAB1基因的差异表达
1、根据高通量测序的检测结果选择NDUFAB1基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择椎间盘退行性疾病髓核组织和正常椎间盘髓核组织各60例。
2、RNA提取步骤同实施例1。
3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：
(1)取总RNA1μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μl，充分混匀。70℃水浴5min后立即冰浴2min。
(2)构建25μl反应体系，其中包括5×逆转录缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，RNasin40U/μl，M-MLV200U/μl，补无核酸酶水至预期体积。
(3)42℃水浴60min后，95℃水浴5min以灭活M-MLV。
(4)-20℃储存备用。
4、QPCR扩增
(1)引物设计
根据Genebank中NDUFAB1基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
NDUFAB1基因：
正向引物为5’-ACTCTATGACAAGATTGAC-3’(SEQIDNO.3)；
反向引物为5’-CAGCATCTATATCAGGAAT-3’(SEQIDNO.4)。
GAPDH基因：
正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQIDNO.5)；
反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQIDNO.6)。
(2)按照表1配制PCR反应体系：
其中，SYBRGreen聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表1PCR反应体系
试剂 体积
正向引物 1μl
反向引物 1μl
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl
模板 2μl
去离子水 补足25μl
(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃30s，60℃40s)×40个循环。以SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示，与正常椎间盘髓核组织相比，NDUFAB1基因在椎间盘退行性疾病髓核组织中的表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。
实施例3抑制NDUFAB1基因表达
1、细胞培养：将获取的髓核组织在无菌条件下用D-HANKS液冲洗3次，然后用剪刀将髓核组织剪碎(约1mm3大小)，置于无菌离心管中；使用0.25％胰蛋白酶于37℃消化20min，每5min摇动一次，800rpm离心5min，弃去上清液；使用0.2％Ⅱ型胶原酶37℃消化4h，用200目筛网过滤；然后滤液以800rpm离心5min，弃去上清液；DMEM/F12培养基冲洗，800rpm离心5min，重复3次；细胞计数后接种于培养瓶，含15％胎牛血清及1％P/S的DMEM/F12培养基作为培养液，于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
2、siRNA设计
针对NDUFAB1的siRNA序列：
siRNA1-NDUFAB1：
正义链为5’-UUCAAUACGUAAAGAACACGG-3’(SEQIDNO.7)；
反义链为5’-GUGUUCUUUACGUAUUGAAAC-3’(SEQIDNO.8)，
siRNA2-NDUFAB1：
正义链为5’-UGUCAUAGAGUUUCAAUACGU-3’(SEQIDNO.9)；
反义链为5’-GUAUUGAAACUCUAUGACAAG-3’(SEQIDNO.10)，
siRNA3-NDUFAB1：
正义链为5’-AGAAUUUACUGAAAGCUUCUC-3’(SEQIDNO.11)；
反义链为5’-GAAGCUUUCAGUAAAUUCUCA-3’(SEQIDNO.12)
阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：
正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQIDNO.13)；
反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQIDNO.14)。
将细胞按1×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1-NDUFAB1、siRNA2-NDUFAB1、siRNA3-NDUFAB1)，其中阴性对照组siRNA与NDUFAB1基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别转染。
3、QPCR检测NDUFAB1基因的转录水平
3.1细胞总RNA的提取
采用TRIzolReagent(InvitrogenCat.No.15596-018)总RNA提取试剂，按说明书提供方法提取髓核细胞的总RNA。具体方法为：取细胞，用浓度为0.01M的PBS冲洗3次，加入适量TRIzol试剂，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀后以1ml/管分装至1.5mlEppendorf管中。每管加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min，4℃、12000rpm离心15min，将上层水相移至干净Eppendorf管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min，4℃、7500r/min离心10min。弃上清，75％乙醇洗涤RNA沉淀，7500rpm离心5min，室温干燥RNA沉淀，5-10min后溶于适量DEPC水。质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。
3.2逆转录步骤同实施例2。
3.3QPCR扩增步骤同实施例2。
4、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰NDUFAB1基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图2显示，相比siRNA2-NDUFAB1、siRNA3-NDUFAB1，siRNA1-NDUFAB1能够更有效抑制NDUFAB1基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4NDUFAB1基因对椎间盘退行性疾病细胞增殖的影响
采用MTT实验检测NDUFAB1基因对椎间盘退行性疾病细胞增殖能力影响。
1、细胞培养与转染步骤同实施例3。
2、步骤：各组细胞转染12h后胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔6000个细胞接种于96孔培养板中，每组分7个时间点，每个时间点设6个复孔。细胞贴壁后，进行第1次检测：每孔加入5g/L的MTT液20μl，继续培养4h后，吸去培养基，加入DMSO150μl，细心吹打，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值(A值)。然后每12h检测1次，连续测72h，共7次。本实验重复3次。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
图3所示的结果显示：siRNA1-NDUFAB1组的细胞生长速度明显高于转染siRNA-NC组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明NDUFAB1表达不利于椎间盘髓核细胞的生长，通过抑制NDUFAB1基因的表达可以促进椎间盘退行性疾病细胞的生长。
实施例5NDUFAB1基因对椎间盘退行性疾病细胞凋亡的影响
使用流式细胞仪检测NDUFAB1基因对细胞凋亡的影响。
1、细胞培养步骤同实施例3。
2、细胞转染步骤同实施例3。
3、步骤
细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞，然后用0.25％胰酶消化细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为1×106个/ml，取200μl上述细胞悬液放置到Eppendorf管中，加入10μlAnnexin-V-FITC混匀，室温暗处孵育染色15min，上机前5min加入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μl。未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果：
转染siRNA1-NDUFAB1组的细胞凋亡率为(9.95±0.18)％，转染siRNA-NC组的细胞凋亡率为(33.23±0.88)％，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，NDUFAB1表达有促进椎间盘髓核细胞的凋亡，通过抑制NDUFAB1基因的表达可以减少椎间盘髓核细胞的凋亡。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基因及其表达产物在制备诊断椎间盘退行性疾病的产品中的应用，其特征在于，所述基因为NDUFAB1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测NDUFAB1基因及其表达产物的表达水平以诊断椎间盘退行性疾病的产品。
3.一种诊断椎间盘退行性疾病的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测椎间盘组织中NDUFAB1基因的表达水平来诊断椎间盘退行性疾病。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测NDUFAB1基因转录水平的针对NDUFAB1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的NDUFAB1蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测NDUFAB1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括NDUFAB1蛋白的特异性抗体。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述试剂包括针对NDUFAB1基因的引物和/或探针。
6.NDUFAB1基因及其表达产物在制备治疗椎间盘退行性疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药物包含NDUFAB1基因和/或其表达产物的抑制剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂是针对NDUFAB1的siRNA。
9.一种用于治疗椎间盘退行性疾病的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求7或8所述的抑制剂。
10.权利要求7或8所述的抑制剂在制备治疗椎间盘退行性疾病的药物中的应用。
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