CN105483058A - 一种石油降解菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种石油降解菌剂；还涉及一种上述石油降解菌剂的制备方法。本发明的石油降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母菌种分别进行扩大培养至菌体浓度为109～1010cfu/g，并按照3∶2∶2∶1∶1的质量比混合均匀，得混合菌种；(2)将混合菌种在液体发酵培养基中发酵48-60小时；(3)离心分离得粘稠状菌体细胞；(4)将粘稠状菌体细胞和0.9％NaCl溶液和海泥浸出液混匀；(5)添加营养物质后在4℃条件下密封保存。本发明对石油的降解率高。

Description

一种石油降解菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于石油降解技术领域，尤其涉及一种石油降解菌剂；本发明还涉及一种上述石油降解菌剂的制备方法。
背景技术
随着石油开发、船舶运输及石油工业的日益发展，海上溢油事故频繁发生，石油污染给海洋环境和海洋生态系统带来了严重的危害，并能直接或间接的影响着人类的生存和可持续发展。据联合国环境规划署报告，每年流入海洋的石油为200万吨至2000万吨，石油污染已成为一个世界性的污染问题。2010年发生在墨西哥湾的泄油事件是美国历史上最严重的海洋污染事件之一，其所造成的生态损伤和经济损失不可估量。
溢油多发生在海上，随着风浪漂移至海岸线的油品不仅造成严重环境污染，而且由于石油烃类污染物的潜在毒性和生物积累效应会导致近岸海域环境质量和生物种类多样性指数严重下降，海洋生态系统遭受严重破坏，也会对水产业和旅游业造成巨大损失。
生物修复(Bioremediation)指利用生物特别是微生物来催化降解环境污染物，减小或最终消除环境污染的受控或自发过程，是在微生物降解基础上发展起来的新兴的环保技术。早在1972年，美国利用生物修复技术清除宾夕法尼亚州的Ambler管线泄露的汽油；之后1989年，美国大规模应用生物修复技术成功处理了阿拉斯加海滩的石油污染，从此生物修复技术开始成为环境科学的研究热点与前沿。
生物修复的机理是依靠微生物细胞的吸收氧化作用，对污染物进行分解同化，将污染有机物转变为细胞的组成部分，或者转变成H2O和CO2排出体外，从而实现对有机污染的修复。与动物和植物相比，微生物具有比表面积大、繁殖快、适应性强、使用范围广等优点，具有强大的降解与转化能力。目前，利用微生物进行污染环境的修复倍受国内外研究学者的重视，具体工作主要集中在寻找高效降解菌、提高污染物的可利用性以及为微生物提供更合适的环境三方面。该技术分为生物促进(biostimulation)和生物强化(bioaugmentation)两大类型。生物促进法是通过添加营养物或改变环境因子，以促进微生物的代谢能力。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，并提供一种石油降解菌剂及其制备方法，旨在通过生物修复方式对海底石油污染进行有效修复，提高石油降解能力，为解决石油污染问题提供突破点。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种石油降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母菌种分别进行扩大培养至菌体浓度为109～1010cfu/g，将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母按照3∶2∶2∶1∶1的质量比混合均匀，得混合菌种；
(2)将液体发酵培养基高压灭菌15-30min，在无菌操作台中，向灭菌处理的液体发酵培养基中接种步骤(1)所得的混合菌种，混合菌种与液体发酵培养基的重量比为1∶10-15，将接种了混合菌种的液体发酵培养基置于恒温水浴摇床，在140rpm、27-30℃条件下连续发酵48-60小时；
(3)用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的粘稠状菌体充分搅拌以混合均匀，获得粘稠状菌体细胞；
(4)向步骤(3)所得的粘稠状菌体细胞中加入灭菌后的0.9％NaCl溶液和海泥浸出液，并混合均匀，得菌体混合溶液，所述0.9％NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶(20-40)，所述海泥浸出液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶(0.5-0.8)；
(5)称取重量份数为15-20份的糯稻根、15-20份的蜂房、10-15份的石榴皮，将称量好的糯稻根、蜂房、石榴皮混合均匀，将混合物高压灭菌15-30min，将灭菌后的混合物和步骤(4)所得的菌体混合溶液按照1∶2的重量比混合均匀；于37℃恒温培养2-5天，得到固体菌剂并在4℃条件下密封保存。
进一步地，所述液体发酵培养基的配方如下：1L的液体发酵培养基中含有5-8g的酵母粉、5-8g麦麸、16-20g蛋白胨、4-6g葡萄糖、8-12g玉米淀粉、0.6-1g贝壳粉、0.5-0.9g膨润土、0.8-1.2g的MgSO4·7H2O、0.3-0.6g的Na2HPO4、0.1-0.3g磷酸二氢钾、余量的去离子水定容至1L。
进一步地，所述海泥浸出液的制备方法为：将海泥用粉碎机粉碎，过150目筛，过筛后加入提取罐中，将质量浓度为50％的酒精加入提取罐中，酒精用量为海泥重量的15倍，开启搅拌，将提取罐置于恒温水浴摇床，在140rpm、70-80℃条件下提取30min，100目过滤取滤液，滤渣返回提取罐中重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出液。
本发明中，步骤(2)的发酵步骤的作用在于促进混合菌种的再生长，且本发明的液体发酵培养基能为混合菌种提供充分的营养，有利于发挥各菌株之间的协同作用。步骤(3)～步骤(5)的操作既可保证菌体的密度又可保证营养物质的摄取；0.9％NaCl溶液、海泥浸出液、糯稻根、蜂房、石榴皮按照特定的比例与粘稠状菌体细胞混合均匀，既满足了混合菌株生长所需的营养物质，使本发明的石油降解菌剂投放到石油污染土壤环境后能够暂时得到养分供给，而且菌剂制备过程简单经济，糯稻根、蜂房、石榴皮均为天然材料，生物可降解性好，环境友好且安全，不会对环境带来二次污染。因此本发明在石油污染土壤的生物修复过程中具有广阔的应用前景。此外，本发明所得的固体菌剂运输和贮存方便。
优选地，步骤(2)中的发酵温度为28℃。
优选地，步骤(4)中，所述0.9％NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶30。
优选地，步骤(4)中，海泥浸出液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶0.6。
优选地，所述液体发酵培养基的配方如下：1L的液体发酵培养基中含有6g的酵母粉、6g麦麸、18g蛋白胨、5g葡萄糖、10g玉米淀粉、0.8g贝壳粉、0.8g膨润土、1g的MgSO4·7H2O、0.4g的Na2HPO4、0.2g磷酸二氢钾、余量的去离子水定容至1L。
一种利用上述石油降解菌剂的制备方法制备得到的石油降解菌剂。
本发明中的菌种均为公众商业渠道可以买到的生物材料。其中，惰性柄杆菌，拉丁名称：Caulobactersegnis，可购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，CGMCC菌种编号NO.4.1475，可用于处理石油污染；
近平滑假丝酵母，拉丁名称：Candidaparapsilosis，可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC菌种编号为NO.1693，能发酵分解石油；
抗酚小短杆菌，拉丁名称：Brachybacteriumphenoliresistens，可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC菌种编号为NO.23825，革兰氏阳性菌，可用于处理石油污染；
球形节细菌，拉丁学名Arthrobacterglobiformis，属于细菌界Bacteria，放线菌门Actinobacteria，放线菌纲Actinobacteria，放线菌目Actinomycetales，微球菌科Micrococcaceae，节细菌属Arthrobacter，能消耗掉石油烃类化合物；
鲑色锁掷孢酵母，拉丁名称：Sporidiobolussalmonicolor，可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC菌种编号为NO.31636，可利用烷烃为碳源，可用于处理石油污染。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明中使用惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母菌种作为高效石油降解菌群，该菌群降解率高，各菌株之间的协同效果好，环境适应性强。
(2)本发明中，步骤(2)的发酵步骤的作用在于促进混合菌种的再生长，且本发明的液体发酵培养基能为混合菌种提供充分的营养，有利于发挥各菌株之间的协同作用。步骤(3)～步骤(5)的操作既可保证菌体的密度又可保证营养物质的摄取；0.9％NaCl溶液、海泥浸出液、糯稻根、蜂房、石榴皮按照特定的比例与粘稠状菌体细胞混合均匀，既满足了混合菌株生长所需的营养物质，使本发明的石油降解菌剂投放到石油污染土壤环境后能够暂时得到养分供给，而且菌剂制备过程简单经济，糯稻根、蜂房、石榴皮均为天然材料，生物可降解性好，环境友好且安全，不会对环境带来二次污染。因此本发明在石油污染土壤的生物修复过程中具有广阔的应用前景。本发明所得的固体菌剂运输和贮存方便。
(3)本发明操作简单、修复效果好、成本费用低、无二次污染、易于产业化。通过生物修复来催化降解石油烃类污染物，降低了石油烃类污染物的潜在毒性和生物积累效应导致的近岸海域环境质量和生物种类多样性破坏，对海洋生态系统、水产业和旅游业具有重要意义。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明中的菌种均为公众商业渠道可以买到的生物材料。其中，惰性柄杆菌，拉丁名称：Caulobactersegnis，可购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，CGMCC菌种编号NO.4.1475，可用于处理石油污染；近平滑假丝酵母，拉丁名称：Candidaparapsilosis，可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC菌种编号为NO.1693，能发酵分解石油；抗酚小短杆菌，拉丁名称：Brachybacteriumphenoliresistens，可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC菌种编号为NO.23825，革兰氏阳性菌，可用于处理石油污染；球形节细菌，拉丁学名Arthrobacterglobiformis，属于细菌界Bacteria，放线菌门Actinobacteria，放线菌纲Actinobacteria，放线菌目Actinomycetales，微球菌科Micrococcaceae，节细菌属Arthrobacter，能消耗掉石油烃类化合物；鲑色锁掷孢酵母，拉丁名称：Sporidiobolussalmonicolor，可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，CICC菌种编号为NO.31636，可利用烷烃为碳源，可用于处理石油污染。
实施例1
一种石油降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母菌种分别进行扩大培养至菌体浓度为109～1010cfu/g，将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母按照3∶2∶2∶1∶1的质量比混合均匀，得混合菌种；
(2)将液体发酵培养基高压灭菌15-30min，在无菌操作台中，向灭菌处理的液体发酵培养基中接种步骤(1)所得的混合菌种，混合菌种与液体发酵培养基的重量比为1∶12，将接种了混合菌种的液体发酵培养基置于恒温水浴摇床，在140rpm、27℃条件下连续发酵60小时；
(3)用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的粘稠状菌体充分搅拌以混合均匀，获得粘稠状菌体细胞；
(4)向步骤(3)所得的粘稠状菌体细胞中加入灭菌后的0.9％NaCl溶液和海泥浸出液，并混合均匀，得菌体混合溶液，所述0.9％NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶20，所述海泥浸出液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶0.5；
(5)称取重量份数为15份的糯稻根、15份的蜂房、15份的石榴皮，将称量好的糯稻根、蜂房、石榴皮混合均匀，将混合物高压灭菌15-30min，将灭菌后的混合物和步骤(4)所得的菌体混合溶液按照1∶2的重量比混合均匀；于37℃恒温培养2-5天，得到固体菌剂并在4℃条件下密封保存。
所述液体发酵培养基的配方如下：1L的液体发酵培养基中含有5g的酵母粉、8g麦麸、18g蛋白胨、4g葡萄糖、10g玉米淀粉、0.6g贝壳粉、0.6g膨润土、0.8g的MgSO4·7H2O、0.3g的Na2HPO4、0.1g磷酸二氢钾、余量的去离子水定容至1L。
所述海泥浸出液的制备方法为：将海泥用粉碎机粉碎，过150目筛，过筛后加入提取罐中，将质量浓度为50％的酒精加入提取罐中，酒精用量为海泥重量的15倍，开启搅拌，将提取罐置于恒温水浴摇床，在140rpm、70-80℃条件下提取30min，100目过滤取滤液，滤渣返回提取罐中重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出液。
一种利用上述石油降解菌剂的制备方法制备得到的石油降解菌剂。
实施例2
一种石油降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母菌种分别进行扩大培养至菌体浓度为109～1010cfu/g，将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母按照3∶2∶2∶1∶1的质量比混合均匀，得混合菌种；
(2)将液体发酵培养基高压灭菌15-30min，在无菌操作台中，向灭菌处理的液体发酵培养基中接种步骤(1)所得的混合菌种，混合菌种与液体发酵培养基的重量比为1∶10，将接种了混合菌种的液体发酵培养基置于恒温水浴摇床，在140rpm、28℃条件下连续发酵55小时；
(3)用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的粘稠状菌体充分搅拌以混合均匀，获得粘稠状菌体细胞；
(4)向步骤(3)所得的粘稠状菌体细胞中加入灭菌后的0.9％NaCl溶液和海泥浸出液，并混合均匀，得菌体混合溶液，所述0.9％NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶30，所述海泥浸出液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶0.6；
(5)称取重量份数为20份的糯稻根、15份的蜂房、10份的石榴皮，将称量好的糯稻根、蜂房、石榴皮混合均匀，将混合物高压灭菌15-30min，将灭菌后的混合物和步骤(4)所得的菌体混合溶液按照1∶2的重量比混合均匀；于37℃恒温培养2-5天，得到固体菌剂并在4℃条件下密封保存。
所述液体发酵培养基的配方如下：1L的液体发酵培养基中含有5g的酵母粉、5g麦麸、16g蛋白胨、6g葡萄糖、8g玉米淀粉、0.8g贝壳粉、0.5g膨润土、0.8g的MgSO4·7H2O、0.3g的Na2HPO4、0.1g磷酸二氢钾、余量的去离子水定容至1L。
所述海泥浸出液的制备方法为：将海泥用粉碎机粉碎，过150目筛，过筛后加入提取罐中，将质量浓度为50％的酒精加入提取罐中，酒精用量为海泥重量的15倍，开启搅拌，将提取罐置于恒温水浴摇床，在140rpm、70-80℃条件下提取30min，100目过滤取滤液，滤渣返回提取罐中重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出液。
一种利用上述石油降解菌剂的制备方法制备得到的石油降解菌剂。
实施例3
一种石油降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母菌种分别进行扩大培养至菌体浓度为109～1010cfu/g，将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母按照3∶2∶2∶1∶1的质量比混合均匀，得混合菌种；
(2)将液体发酵培养基高压灭菌15-30min，在无菌操作台中，向灭菌处理的液体发酵培养基中接种步骤(1)所得的混合菌种，混合菌种与液体发酵培养基的重量比为1∶15，将接种了混合菌种的液体发酵培养基置于恒温水浴摇床，在140rpm、30℃条件下连续发酵48小时；
(3)用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的粘稠状菌体充分搅拌以混合均匀，获得粘稠状菌体细胞；
(4)向步骤(3)所得的粘稠状菌体细胞中加入灭菌后的0.9％NaCl溶液和海泥浸出液，并混合均匀，得菌体混合溶液，所述0.9％NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶40，所述海泥浸出液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶0.8；
(5)称取重量份数为18份的糯稻根、18份的蜂房、12份的石榴皮，将称量好的糯稻根、蜂房、石榴皮混合均匀，将混合物高压灭菌15-30min，将灭菌后的混合物和步骤(4)所得的菌体混合溶液按照1∶2的重量比混合均匀；于37℃恒温培养2-5天，得到固体菌剂并在4℃条件下密封保存。
所述液体发酵培养基的配方如下：1L的液体发酵培养基中含有8g的酵母粉、6g麦麸、20g蛋白胨、5g葡萄糖、12g玉米淀粉、1g贝壳粉、0.9g膨润土、1.2g的MgSO4·7H2O、0.6g的Na2HPO4、0.3g磷酸二氢钾、余量的去离子水定容至1L。
所述海泥浸出液的制备方法为：将海泥用粉碎机粉碎，过150目筛，过筛后加入提取罐中，将质量浓度为50％的酒精加入提取罐中，酒精用量为海泥重量的15倍，开启搅拌，将提取罐置于恒温水浴摇床，在140rpm、70-80℃条件下提取30min，100目过滤取滤液，滤渣返回提取罐中重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出液。
一种利用上述石油降解菌剂的制备方法制备得到的石油降解菌剂。
实施例4
一种石油降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母菌种分别进行扩大培养至菌体浓度为109～1010cfu/g，将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母按照3∶2∶2∶1∶1的质量比混合均匀，得混合菌种；
(2)将液体发酵培养基高压灭菌15-30min，在无菌操作台中，向灭菌处理的液体发酵培养基中接种步骤(1)所得的混合菌种，混合菌种与液体发酵培养基的重量比为1∶12，将接种了混合菌种的液体发酵培养基置于恒温水浴摇床，在140rpm、28℃条件下连续发酵55小时；
(3)用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的粘稠状菌体充分搅拌以混合均匀，获得粘稠状菌体细胞；
(4)向步骤(3)所得的粘稠状菌体细胞中加入灭菌后的0.9％NaCl溶液和海泥浸出液，并混合均匀，得菌体混合溶液，所述0.9％NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶30，所述海泥浸出液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶0.6；
(5)称取重量份数为15-20份的糯稻根、15-20份的蜂房、10-15份的石榴皮，将称量好的糯稻根、蜂房、石榴皮混合均匀，将混合物高压灭菌15-30min，将灭菌后的混合物和步骤(4)所得的菌体混合溶液按照1∶2的重量比混合均匀；于37℃恒温培养2-5天，得到固体菌剂并在4℃条件下密封保存。
所述液体发酵培养基的配方如下：1L的液体发酵培养基中含有6g的酵母粉、6g麦麸、18g蛋白胨、5g葡萄糖、10g玉米淀粉、0.8g贝壳粉、0.8g膨润土、1g的MgSO4·7H2O、0.4g的Na2HPO4、0.2g磷酸二氢钾、余量的去离子水定容至1L。
所述海泥浸出液的制备方法为：将海泥用粉碎机粉碎，过150目筛，过筛后加入提取罐中，将质量浓度为50％的酒精加入提取罐中，酒精用量为海泥重量的15倍，开启搅拌，将提取罐置于恒温水浴摇床，在140rpm、70-80℃条件下提取30min，100目过滤取滤液，滤渣返回提取罐中重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出液。
一种利用上述石油降解菌剂的制备方法制备得到的石油降解菌剂。
本发明中，步骤(2)的发酵步骤的作用在于促进混合菌种的再生长，且本发明的液体发酵培养基能为混合菌种提供充分的营养，有利于发挥各菌株之间的协同作用。步骤(3)～步骤(5)的操作既可保证菌体的密度又可保证营养物质的摄取；0.9％NaCl溶液、海泥浸出液、糯稻根、蜂房、石榴皮按照特定的比例与粘稠状菌体细胞混合均匀，既满足了混合菌株生长所需的营养物质，使本发明的石油降解菌剂投放到石油污染土壤环境后能够暂时得到养分供给，而且菌剂制备过程简单经济，糯稻根、蜂房、石榴皮均为天然材料，生物可降解性好，环境友好且安全，不会对环境带来二次污染。因此本发明在石油污染土壤的生物修复过程中具有广阔的应用前景。此外，本发明所得的固体菌剂运输和贮存方便。
实验结果
分别称取5g本发明实施例1-实施例4的石油降解菌剂，分别添加至100ml的受污染水体(受污染水体采自于2013年11月22日黄岛输油管线发生爆炸后胶州湾岸滩受溢油污染的水体)，置于恒温水浴摇床，在140rpm、18℃条件下培养15天。以受污染水体(受污染水体采自于2013年11月22日黄岛输油管线发生爆炸后胶州湾岸滩受溢油污染的水体)中加入5g灭菌后的天然海水的处理组为对照组。
对照组以及利用本发明实施例1-实施例4的石油降解菌剂的制备方法制备得到的石油降解菌剂对石油降解性能的影响见下表：
实验结果表明，采用本发明制得的石油降解菌剂的石油降解率可达到67.63％以上，显著高于惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母中的任意一种菌株的石油降解率，说明本发明的菌群降解率高，各菌株之间的协同效果好。也表明本发明制得的石油降解菌剂在可有效加快溢油污染岸滩环境的恢复进程。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种石油降解菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母菌种分别进行扩大培养至菌体浓度为109～1010cfu/g，将惰性柄杆菌、近平滑假丝酵母、抗酚小短杆菌、球形节细菌以及鲑色锁掷孢酵母按照3∶2∶2∶1∶1的质量比混合均匀，得混合菌种；
(2)将液体发酵培养基高压灭菌15-30min，在无菌操作台中，向灭菌处理的液体发酵培养基中接种步骤(1)所得的混合菌种，混合菌种与液体发酵培养基的重量比为1∶10-15，将接种了混合菌种的液体发酵培养基置于恒温水浴摇床，在140rpm、27-30℃条件下连续发酵48-60小时；
(3)用酵母分离离心机离心分离除去发酵液中的水，把离心获得的粘稠状菌体充分搅拌以混合均匀，获得粘稠状菌体细胞；
(4)向步骤(3)所得的粘稠状菌体细胞中加入灭菌后的0.9％NaCl溶液和海泥浸出液，并混合均匀，得菌体混合溶液，所述0.9％NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶(20-40)，所述海泥浸出液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶(0.5-0.8)；
(5)称取重量份数为15-20份的糯稻根、15-20份的蜂房、10-15份的石榴皮，将称量好的糯稻根、蜂房、石榴皮混合均匀，将混合物高压灭菌15-30min，将灭菌后的混合物和步骤(4)所得的菌体混合溶液按照1∶2的重量比混合均匀；于37℃恒温培养2-5天，得到固体菌剂并在4℃条件下密封保存；
所述液体发酵培养基的配方如下：1L的液体发酵培养基中含有5-8g的酵母粉、5-8g麦麸、16-20g蛋白胨、4-6g葡萄糖、8-12g玉米淀粉、0.6-1g贝壳粉、0.5-0.9g膨润土、0.8-1.2g的MgSO4·7H2O、0.3-0.6g的Na2HPO4、0.1-0.3g磷酸二氢钾、余量的去离子水定容至1L；
所述海泥浸出液的制备方法为：将海泥用粉碎机粉碎，过150目筛，过筛后加入提取罐中，将质量浓度为50％的酒精加入提取罐中，酒精用量为海泥重量的15倍，开启搅拌，将提取罐置于恒温水浴摇床，在140rpm、70-80℃条件下提取30min，100目过滤取滤液，滤渣返回提取罐中重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出液。
2.根据权利要求1所述的石油降解菌剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的发酵温度为28℃。
3.根据权利要求1所述的石油降解菌剂的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述0.9％NaCl溶液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶30。
4.根据权利要求1所述的石油降解菌剂的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，海泥浸出液与粘稠状菌体细胞的重量比为1∶0.6。
5.根据权利要求1所述的石油降解菌剂的制备方法，其特征在于：所述液体发酵培养基的配方如下：1L的液体发酵培养基中含有6g的酵母粉、6g麦麸、18g蛋白胨、5g葡萄糖、10g玉米淀粉、0.8g贝壳粉、0.8g膨润土、1g的MgSO4·7H2O、0.4g的Na2HPO4、0.2g磷酸二氢钾、余量的去离子水定容至1L。
6.一种利用权利要求1-5中任一项所述石油降解菌剂的制备方法制备得到的石油降解菌剂。
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