CN105477008B - 玫瑰多糖在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药技术领域,提供一种玫瑰多糖的应用,具体涉及玫瑰多糖在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。该玫瑰多糖对秀丽隐杆线虫阿尔茨海默症病理模型具有显著的治疗作用,提示本发明所述玫瑰多糖具有治疗阿尔茨海默症的潜力,可在制备治疗阿尔茨海默症的药物中应用,亦可在制备预防和辅助治疗阿尔茨海默症的相关保健品中应用。

Description

玫瑰多糖在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用
技术领域
本发明属于中药技术领域,提供一种玫瑰多糖的应用,具体涉及玫瑰多糖在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer'sM disease,AD),是一种以进行性认知障碍和记忆损伤为主的神经系统退行性疾病,是老年痴呆症最常见的一种形式。临床上以记忆障碍、失语、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。在痴呆患者中所占比例超过75%。随着我国老龄化程度的加剧,AD会成为影响老年人健康的主要疾病之一,有效预防和治疗AD成为摆在我们面前的又一重大课题。
淀粉样蛋白沉积(Aβ蛋白)和神经纤维缠结是AD的两大主要病理学特征。现代医学对AD的发病机制进行了多年的研究,但是由于其病因复杂,该病的发病机制至今仍不明确,“Aβ级联假说”是当前被科学界广为接受的机制之一。该学说认为患者大脑中异常沉积的Aβ通过自由基反应、线粒体氧化损伤和炎症反应等一系列级联反应,直接或者间接作用于神经元和神经胶质细胞,最终导致神经元功能异常或者死亡,引发认知损伤及记忆衰退,最终引起痴呆。在家族性阿尔茨海默病症患者中发现淀粉样前体蛋白(APP)基因和早老素基因发生突变,导致Aβ在大脑的过度表达成为该学说最为有力的证据。因此β淀粉样蛋白已成为公认的筛选抗AD药物靶标。
AD病因复杂、病程漫长、且发病环节较多,需要长期服药,目前主要的抗阿尔茨海默病药物乙酰胆碱酯酶抑制剂(如加兰他敏)和N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)拮抗剂(如美金刚),但上述药物价格昂贵,服药后幻觉、意识混沌、头晕、头痛和疲倦等副作用显著,且只能延缓,却不能控制或逆转患者病情。
而中药组合物具有多种活性组分、多靶点的特征,一定程度上可以克服西药的不足之处,使得从中药组合物宝库中筛选用于治疗AD的药物候选物前景广阔。
玫瑰是一味行气活血的中药,玫瑰氯仿提取物被证明可促进体外培养的大鼠胚神经元细胞轴突生长,并抑制Aβ(25-35)引起的神经元轴突萎缩(Awale et al.,2011)。但尚不知水溶性的玫瑰多糖是否具有抗AD作用。不同天然来源决定了多糖结构存在多样性和复杂性(Zong et al.,2012),而多糖结构的不同使其生物活性迥异(Ma et al.,2013)。从不同天然来源提取获得结构各异的多糖并研究它们药学活性,一直是多糖研究领域的热点。有文献报道表明复方二精多糖(徐玲玲,2008)、玉郎伞多糖(陈晓宇,2013)和龙眼参多糖(黄忠仕,2008)具有抗老年疾呆的作用。但是,水溶性玫瑰多糖抗AD的活性尚未被公开报道。
秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是一个非常有用的多功能药物筛选和药物作用机制的研究平台。它廉价、易培养;世代周期短、后代数目多,同时可获得大量背景一致的个体,保证实验重复性和采用大样本量进行实验,从而排除个体差异的影响;与高等生物在基因和分子通路方面高度保守(Kaletta and Hengartner,2006)。它作为一个从细胞体外水平药物初筛到小鼠体内水平药物复筛的一个桥梁,越来越受到药学家的青睐。美国devGen公司利用人源化线虫筛选的抗心律不齐药物已被FDA批准进入临床研究。
人源化秀丽隐杆线虫AD病理模型的建立是将人源Aβ1-42基因转入肌球蛋白启动子下游并受温度控制表达,该线虫株系可在15℃正常生长,当转移至25℃条件下Aβ1-42表达并在其肌肉内累积,导致线虫失去运动能力而麻痹。加入受试药物可延缓肌肉麻痹表型,其结果以肌肉麻痹线虫数量占受试线虫群体数量的百分比表示。未麻痹线虫比率越高,药物抗AD效果越显著。这一模型早已被用于抗AD疾病发生机制和抗AD药物及候选物作用机制研究(Link,1995;2001)。
基于上述研究现状,本发明提供了玫瑰多糖的新应用,即在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用,以及在制备预防和辅助治疗阿尔茨海默症的保健品中的应用。
参考文献
Kaletta T,Hengartner MO.Finding function in novel targets:C.elegansas a model organism.Nat Rev Drug Discov 2006,5:387e398.
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Awale S,Tohda C,Tezuka T et al.Protective Effects of Rosa damascenaand its active constituent on Aβ(25–35)-induced neuritic atrophy.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2011,doi:10.1093/ecam/nep149.
Ma,L.,Qin,C.,Wang,M.,Gan,D.,Cao,L.,Ye,H.,et al.(2013).Preparation,preliminarycharacterization and inhibitory effect on human colon cancer HT-29cells of anacidic polysaccharide fraction from Stachys floridana Schuttl.exBenth.Food and Chemical Toxicology 60:269–276.
Zong A.,Cao h.,Wang F.(2012).Anticancer polysaccharides from naturalresources:a review of recent research.Carbohydrate Polymers 90:1395-1410.
徐玲玲.2008.复方二精灵多糖抗老年疾呆的作用及其机制研究[D]中南民族大学.
陈晓宇.2013.玉郎伞多糖抗痴呆作用及机制的研究[D].广西医科大学.
黄忠仕.2008.龙眼参多糖抗痴呆作用及机制的研究[D].广西医科大学.
发明内容
本发明目的是提供一种玫瑰多糖的新应用。
具体为:玫瑰多糖在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。
所述玫瑰多糖作为药效成分的药物制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、丸剂。
玫瑰多糖在制备预防和辅助治疗阿尔茨海默症的保健品中的应用。
所述玫瑰多糖作为有效成分的保健品剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、丸剂。
本发明所述玫瑰多糖的制备方法如下:
本发明采用水提醇沉法制备玫瑰多糖:称取玫瑰花,按1:20-30质量份数加水,浸泡20min,加热煮沸并保持30分钟,10000rpm离心10min,收得上清液。重复三次收取上清液,加入5倍量的无水乙醇于室温沉淀12h,10000rpm离心5min,收集沉淀,待溶剂挥干,收得固体,即为粗多糖。
粗多糖脱蛋白:取粗多糖粉末,蒸馏水溶解,加入1/5体积氯仿:正丁醇(5:1),剧烈振荡,4000转/分钟,离心20分钟,弃沉淀,重复多次直至离心后溶剂介面无沉淀。
粗多糖脱色素:取脱蛋白后的粗多糖粉末,加入10倍量65%的乙醇,55℃水浴提取5h,4000rpm离心5min,弃上清。
粗多糖脱酚:取脱色素之后的粗多糖,加入一定量的丙酮溶液,充分振摇,4000rpm离心20min,收取沉淀,获得初步纯化的粗多糖。
采用苯酚-浓硫酸法检测多糖含量,具体步骤如下:取经过脱蛋白、脱色素及脱酚处理的粗多糖样品,用蒸馏水溶解成15mg/mL的粗多糖水溶液,测量时再做100倍稀释。之后按照样品、5%苯酚溶液、浓硫酸为2:1:5的比例添加试剂,混匀5min后,沸水浴加热15min,冷却。处理好的待检样品在490nm处测量吸光度值。标准曲线采用葡萄糖为标准品绘制。经检测本发明提取的玫瑰多糖含量为85.4%。
本发明的有益效果在于:
1、本发明以秀丽隐杆线虫作为阿尔茨海默症病理模型进行实验,结果表明:玫瑰多糖对罹患阿尔茨海默症的秀丽隐杆线虫具有显著的治疗作用。表现在对AD秀丽隐杆线虫肌肉内Aβ过度表达引起的麻痹表型具有显著的抑制作用,即玫瑰多糖对秀丽隐杆线虫阿尔茨海默症病理模型具有显著的治疗作用,提示玫瑰多糖具有治疗阿尔茨海默症的潜力,可在制备治疗阿尔茨海默症的药物中应用,亦可在制备预防阿尔茨海默症的保健品中应用。
2、玫瑰常用于提取玫瑰精油,玫瑰多糖可从玫瑰提取过精油的玫瑰花渣中提取获得,从而大大地提升了玫瑰的价值。
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案,但本发明的保护范围不局限于以下所述。
附图说明
图1玫瑰多糖延缓AD秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹
C-表示空白对照组。
具体实施方式
实施例一玫瑰多糖的制备方法
本发明使用水提醇沉法制备玫瑰多糖:称取玫瑰或玫瑰花渣12.5g,加水250mL,浸泡20min后,加热煮沸并保持30分钟,10000rpm离心10min,获得上清液。重复三次收集上清液共得350mL,加入5倍量的无水乙醇室温沉淀12h,10000rpm离心5min,收集沉淀,待溶剂挥干,收得固体,即为粗多糖。多糖收率约为1.3%。共得650mg粗多糖。
粗多糖脱蛋白:称取100mg粗多糖粉末,用10mL蒸馏水溶解,加入1/5体积氯仿:正丁醇(5:1),剧烈振荡,4000转/分钟,离心20分钟,弃沉淀,重复多次直至离心后溶剂介面无沉淀。
粗多糖脱色素:取脱蛋白后的粗多糖粉末,加入10倍量65%的乙醇,55℃水浴提取5h,4000rpm离心5min,弃上清。
粗多糖脱酚:取脱色素之后的粗多糖粉末,加入一定量的丙酮溶液,充分振摇,4000rpm离心20min,收取沉淀。经过初步纯化后获得多糖85mg。
采用苯酚-浓硫酸法检测多糖含量,具体步骤如下:取经过脱蛋白、脱色素及脱酚处理的粗多糖样品,用蒸馏水溶解成15mg/mL的粗多糖水溶液,测量时再做100倍稀释。之后按照样品、5%苯酚溶液、浓硫酸为2:1:5的比例添加试剂,混匀5min后,沸水浴加热15min,冷却。处理好的待检样品在490nm处测量吸光度值。标准曲线采用葡萄糖为标准品绘制。经检测本发明提取的玫瑰多糖含量为85.4%。
实施例二玫瑰多糖延缓AD秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹
1.生物材料
(1)秀丽隐杆线虫CL4176购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC);为转基因品系,在25℃温度诱导下肌肉特异性表达人类Aβ1-42,Aβ1-42在肌肉组织聚集,最终导致线虫麻痹,本实施例采用秀丽线虫CL4176株系作为筛选抗AD药物的病理模型。
(2)大肠杆菌OP50(尿嘧啶渗漏突变株),购自Caenorhabditis Genetics Center(CGC),作为秀丽隐杆线虫的食物。
2.试剂
(1)固体NGM(Nematode Growth Medium)培养基成分与制作(以1升为例):
成分 含量
NaCl 3.00g
K2HPO4 2.34g
KH2PO4 17.23g
蛋白胨 2.50g
琼脂 17.00g
补充H2O至 1000mL
固体NGM培养基配制好后,121℃下高压恒温灭菌20min,在无菌操作台下加入5mg/mL胆固醇1mL,1M MgSO41mL,1M CaCl21mL摇匀,趁热倒入已灭菌的9cm培养板,约20mL/板。静置等待培养基凝固,备用。
(2)M9液配方
成分 含量
Na2HPO4 6.00g
KH2PO4 3.00g
NaCl 5.00g
1M MgSO4 1.00mL
补充H2O至 1000mL
(3)裂解液的配制:6.4%NaClO溶液和1M NaOH溶液按体积比1:1混合。
3.配制含有玫瑰多糖的NGM平板
将玫瑰多糖以无菌水稀释,加入NGM培养基的终浓度分别为0.01mg/mL,0.1mg/mL和1mg/mL,将NGM倒入各平板,静置等待培养基凝固。在培养基上均匀涂布大肠杆菌OP50作为线虫的食物。
4.实施步骤
(1)线虫的培养:
将线虫接在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上,然后置于16℃的培养箱中培养,当线虫长到成虫时进行同步化处理。
(2)线虫同步化:
挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出的NGM培养基,用M9液将线虫从培养基上冲下,转移到离心管中,静置使线虫自由沉降至管底,弃上清。视线虫量多少向离心管中加入裂解液,在漩祸搅拌器上振荡5-7分钟待线虫全部断裂时停止涡旋,并分装于1.5mL离心管中,用M9溶液洗线虫卵三次。
(3)实验组设置
空白对照组(C):无菌水
0.01mg/ml玫瑰多糖组;0.1mg/ml玫瑰多糖组;1mg/ml玫瑰多糖组。
(4)玫瑰多糖对秀丽隐杆线虫CL4176的作用
将同步化后分装于离心管中的线虫卵转移到涂布有OP50并混合有不同浓度玫瑰多糖的NGM培养皿中,玫瑰多糖的终浓度分别为0.01mg/ml、0.1mg/ml和1mg/ml,空白对照组涂布有OP50并加有与玫瑰多糖组等体积无菌水的NGM培养皿,每个培养皿60条线虫,每个药物浓度设置三个平行,16℃培养3天至L3期。
为了使线虫表达Aβ,将L3期线虫转在25℃下进行诱导,34h后开始计数线虫麻痹条数。每两小时计数一次,直至所有线虫都麻痹(麻痹是指机械刺激线虫身体时,线虫不能运动或者只有头部运动)。
(5)实验结果
图中纵坐标表示没有麻痹的秀丽隐杆线虫占的百分比,在同一个时间点,此值越大,表明该处理组中没有麻痹的秀丽隐杆线虫比例越大,即药物延缓麻痹的作用越强。
玫瑰多糖对秀丽隐杆线虫AD病理模型的肌肉麻痹具有显著的延缓作用,并且延缓作用与玫瑰多糖呈浓度依赖关系,这表明玫瑰多糖具有抗AD作用(图1)。
通过以上实施例证明,玫瑰多糖对秀丽隐杆线虫阿尔茨海默症病理模型具有显著的治疗作用,提示本发明所述玫瑰多糖具有治疗阿尔茨海默症的潜力,可在制备治疗阿尔茨海默症的药物中应用,亦可在制备预防和辅助治疗阿尔茨海默症的相关保健品中应用。

Claims (4)

1.玫瑰多糖在制备治疗阿尔茨海默症的药物中的应用,所述的玫瑰多糖的制备方法如下:①采用水提醇沉法获得玫瑰粗多糖;②粗多糖脱蛋白;③粗多糖脱色素;④粗多糖脱酚即得所述的玫瑰多糖。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述玫瑰多糖作为药效成分的药物制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、丸剂。
3.玫瑰多糖在制备预防和辅助治疗阿尔茨海默症的保健品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述玫瑰多糖作为有效成分的保健品剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、丸剂。
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