CN105462845B - 茶多酚或EGCG与β-CD包合物及制备富含茶多酚或EGCG的通用固体培养基的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茶多酚或EGCG与β‑CD包合物及其用于制备富含茶多酚或EGCG的适合真菌培养的通用固体培养基的方法。通用固体培养基的制备方法如下：按茶多酚或EGCG与β‑CD的摩尔比例为1:1称取茶多酚或EGCG，将茶多酚或EGCG溶于无水乙醇中，将所得第一次混合溶液逐滴加入到β‑CD饱和溶液中，再将所得第二次混合溶液在60℃条件下搅拌，然后4℃静置过夜，并冷冻干燥，制得包合物粗品；用甲醇冲洗包合物粗品粉末并蒸干，即可制得CDTP或CDTE；最后将CDTP或CDTE配置成通用固体培养基。本发明成功地利用β‑CD疏水空腔的包合性，制备得到了富含茶多酚或EGCG的固体培养基，为后期研究微生物对茶多酚的代谢的研究和生产奠定了基础，本发明还为有效开发利用茯砖茶以及其他茶叶提供了广阔的前景。
Description
技术领域
本发明属于化学技术领域，具体涉及一种茶多酚或EGCG与β-CD包合物及其用于制备富含茶多酚或EGCG的适合真菌培养的通用固体培养基的方法。
背景技术
茯砖茶属于黑茶。“发花”是其加工工艺流程的特有工序。简单的说，发花就是控制一定的温湿度环境，使茶砖内部经历复杂微生物生长的过程。该过程经历大约三周左右，是茯砖茶独特风味品质形成的关键时期。发花后的茶砖内部能看到许多金黄色的小点，这些金黄色的小点是俗称“金花”的真菌【冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)】。据报道，茯砖茶发花过程中出现的微生物不仅有冠突散囊菌，还有很多其它真菌，包括徳巴利酵母属(Debaryomyces spp.)，曲霉属(Aspergillus spp.)，轮枝孢属(Verticilliumspp.)，毕赤酵母属(Pichia spp.)；拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis spp.)等。冠突散囊菌是其中的优势菌种之一。
多年来的实践告诉人们，茯砖茶不仅有独特的风味，还具有很好的治疗菌痢、减肥、降血脂和助消化等功效。尤其重要的是，近年来的相关药理研究发现茯砖茶的这些功效与“发花”有关。所以，利用微生物对茶叶原有内含成分((即主要的活性物质茶多酚类，包括最主要的表没食子儿茶素没食子酸酯即EGCG，及其它几种儿茶素类))进行发酵，制备其代谢产物，不仅是研究这些微生物的代谢机制的基础，还是今后相关制药和保健品行业的一项重要技术，在科研领域和产业方面均具有重要意义。
比较高效的发酵模式是利用真菌在富含茶多酚，或者是富含EGCG的固体培养基上发酵。这种发酵方法的优势是：第一，微生物在固体培养基中生长环境与茶叶上相似，其代谢机制才可以相同，即能产生与茯砖茶(或其它黑茶)相同的儿茶素活性衍生物；第二，现代微生物学研究可提示我们，茯 砖茶发花阶段中结构修饰的机制很有可能是若干种真菌在共生群落的状态下才可发生。在固体培养基上的不同位置接种微生物后，可以发现不同种类的微生物间如何产生互动，分别研究不同的微生物之间产生哪些代谢产物，在测定这些产物的结构和功能后，可以筛选出高效生产某活性物质的菌种。这在将来茶叶活性物质的产业发展和基础研究中都有重要意义；第三，获取培养基中的代谢产物时，没有茶叶中其它杂质(如叶绿素、脂类、黄酮类等)的干扰，便于产物的纯化。
但是作为固体培养基的关键配方之一的琼脂，只要接触到茶多酚类物质，即无法凝固，所以目前国内外利用微生物研究茶叶活性产物的技术主要是液体发酵，即让真菌在含有茶多酚的液体培养基中对这些茶多酚进行代谢和修饰，接着从发酵液中提取和分离出代谢产物。但是这种发酵方式显然不具备固体发酵的第一、第二种优势。所以目前尚未有报道证明微生物液体发酵可以得到与黑茶中活性物质结构相同的产物。这使得该技术始终停留在实验室研究阶段，无法产生更高的科研价值和生产效益。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明的目的之一是提供一种茶多酚或EGCG与β-CD包合物，其制备方法包括以下步骤：
1)、制备β-CD饱和溶液
取经重结晶后的纯β-CD，置烧杯中，加蒸馏水，在60±1℃条件下制成饱和水溶液，保温，备用；
2)、称取茶多酚或EGCG，所称取的茶多酚或EGCG与前述β-CD的摩尔比例均为1:1，将称取得到的茶多酚或EGCG溶于无水乙醇中得到第一次混合溶液，再将第一次混合溶液逐滴加入到步骤1)制备的β-CD饱和溶液中得到第二次混合溶液，将第二次混合溶液在60℃条件下搅拌若干小时，然后4℃静置过夜，再将其置于冷冻干燥器中冷冻干燥，即制得包合物粗品；取包合物粗品粉末，用甲醇冲洗所述包合物粗品粉末，并将冲洗后的包合物粗品粉末进行蒸干，即可制得茶多酚与β-CD包合物CDTP或EGCG与β-CD包合物CDTE。
优选的，步骤2)中，将第二次混合溶液在60℃条件下置于磁力搅拌器上磁力搅拌4h。
优选的，步骤2)中，所述冷冻干燥器为真空冷冻干燥器，冷冻温度为-80℃。
优选的，步骤2)中，所述茶多酚或EGCG与无水乙醇的摩尔比例为7:85。
优选的，步骤2)中，所述包合物粗品粉末与冲洗用甲醇之间摩尔比例为(1～3):62。
本发明的目的之二是提供了一种富含茶多酚或EGCG的适合真菌培养的通用固体培养基的制备方法，本制备方法所制得的固体培养基中富含茶多酚或EGCG，从而能够为冠突散囊菌等真菌提供与茶叶相似的固体发酵环境。本发明为研究微生物对茶多酚的代谢的研究和生产奠定了基础，具有较高的科研价值。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：称取一定量的PDA培养基，高压蒸汽灭菌处理，并冷却至60℃待用；将包合物CDTP或包合物CDTE进行微波灭菌1min，待用；在已灭菌处理的培养皿中分别加入所述20mL PDA，加入0.4500g CDTP或CDTE，用已灭菌处理的玻璃棒搅拌，使其均匀混合在PDA中，待冷却，即制得富含茶多酚培养基CDTP-PDA或富含EGCG培养基CDTE-PDA。
本发明的有益效果在于：
1)、天然环糊精(Cyclodextrin,CD)是环状低聚糖，是由α-1,4糖苷键连接D-(+)-吡喃葡萄糖形成的，具有“内疏水，外亲水”的环状特征结构，其疏水空腔可包合许多无机、有机化合物，能改善客体分子的物理化学性质，如降低客体分子的氧化性、钝化热敏性、增加客体分子的水溶性等。因此，CD被广泛的用于工业生产中。广泛应用的环糊精有α-CD、β-CD、γ-CD，分别由六，七，和八个D-(+)-吡喃葡萄糖单位组成，其中β-CD由于其大小适当的优越内部空腔，应用最广泛。
本发明成功地利用β-CD疏水空腔的包合性，对茶多酚或是EGCG进行包合，再将包合产物加入培养基中形成富含茶多酚或EGCG的固体培养基， 为后期研究微生物对茶多酚的代谢的研究和生产奠定了基础，也为制备与黑茶中活性物质结构相同的产物提供了可能，本发明还为有效开发利用茯砖茶以及其他茶叶提供了广阔的前景。
2)、本发明制备方法简单，制备条件温和，不但有利于降低制备成本，而且具有较大的科研推广价值。
附图说明
图1为CDTP的TLC结果(254nm紫外光下检测)，图1中标号含义为1：β-CD，2：CDTP，3：茶多酚，4：α-淀粉酶酶解后的CDTP，5：α-淀粉酶酶解后的茶多酚。
图2为1H-NMR谱图，图2中(a)为β-CD(3.0×10-3M)，(b)为CDTP(3.0×10-3M)。
图3A、3B为CDTE的TLC结果，其中图3A为254nm紫外光下检测结果；图3B为喷洒FeCl3乙醇溶液显色结果，图3A、3B中标号含义为1：β-CD，2：CDTE，3：EGCG，4：α-淀粉酶酶解后的CDTE，5：α-淀粉酶酶解后的EGCG。
图4为1H-NMR谱图(δ3.65-4.15)，图4中(a)为β-CD(3.0×10-3M),(b)为CDTE(3.0×10-3M)。
图5为1H-NMR谱图(δ2.8-7.3)：图5中(a)为EGCG(3.0×10-3M),(b)为CDTE(3.0×10-3M)。
图6-1A至图6-3B为PDA培养效果与CDTP-PDA培养效果的比较图。其中图6-1A、图6-2A、图6-3A为PDA培养效果图，图6-1B、图6-2B、图6-3B为CDTP-PDA培养效果图。
图7-1A至图7-3B为PDA培养效果与CDTE-PDA培养效果的比较图。其中图7-1A、图7-2A、图7-3A为PDA培养效果图，图7-1B、图7-2B、图7-3B为CDTE-PDA培养效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1
茶多酚与环糊精β-CD的包合物的制备(mol茶多酚:molβ-CD＝1:1)
1.1制备β-CD饱和溶液
取经重结晶后的纯β-CD 8.00g，置烧杯中，加蒸馏水100mL，在60±1℃条件下制成饱和水溶液，保温，备用。
1.2制备包合物
称取茶多酚样品6.17g，溶于5mL的无水乙醇中，再逐滴加入到2.1制备的β-CD饱和溶液中，置磁力搅拌器上(60℃条件下)磁力搅拌4h，4℃静置过夜(12h)，再将其置于真空冷冻干燥器(温度为-80℃)中冷冻干燥，即制得包合物粗品。取适量的包合物粉末，用适量的甲醇冲洗粉末，并将包合物置于旋转蒸发仪上进行旋转蒸干，制得茶多酚与β-CD包合物(β-cyclodextrin tea polyphenol,CDTP)，备用。
1.3CDTP的表征
1.3.1薄层色谱表征(thin layer chromatography,TLC)
图1所示实验样品1-5的处理方法：分别取1、2、3样品适量，于适量蒸馏水中溶解，作为样品1-3；分别取0.1444g茶多酚、0.1505g CDTP，各用8mL蒸馏水溶解后，在恒温水浴锅中加热至50±2℃，保温5min，再各加入1.00gα-淀粉酶，在恒温水浴中反应2h，冷却至室温，各加入2mL乙酸乙酯萃取10min，取乙酸乙酯层，分别作为样品4和5。将样品1-5进行硅胶薄层实验(流动相：苯-甲酸乙酯-甲酸＝3-6-1)，观察色谱展开后的斑点位置并分析结果。
由图1可知，1、2样品的TLC结果均未见斑点，说明茶多酚与β-CD形成了包合物；3、4、5样品的TLC结果均可见斑点，且斑点位置相当，这表明茶多酚不仅被β-CD包合了，且其性质未被改变；包合物中的茶多酚经α-淀粉酶酶解后被释放，且α-淀粉酶不会影响茶多酚的性质。TLC结果说明本实验成功制备了CDTP。
1.3.2核磁共振谱表征
核磁共振谱样品的处理方法：样品分别溶于500μL D2O中，浓度均为3.0×10-3M，核磁检测温度为35℃。
图2显示CDTP中β-CD的1H-NMR(图2中的(b))不同于纯化合物β-CD的1H-NMR(图2中的(a))。与图2中的(a)相比，图2中的(b)中β-CD的H-2至H-6信号均明显向高场位移，且无其它核磁信号出现。该结果是成功制备了CDTP的另一个证据。
实施例2
制备EGCG与β-CD的包合物(β-Cyclodextrin tea epigallocatechin gallate,CDTE)(molEGCG:molβ-CD＝1:1)
2.1制备β-CD饱和溶液
取经重结晶后的纯β-CD 8.00g，置烧杯中，加蒸馏水100mL，在60±1℃条件下制成饱和水溶液，保温，备用。
2.2制备CDTE
称取EGCG样品3.2282g，用5mL无水乙醇溶解，将溶解液逐滴加入到3.1制得的β-CD饱和溶液中，置60℃磁力搅拌器上磁力搅拌4h，4℃静置过夜(12h)，再将其置于冷冻干燥器(温度为-80℃)中冷冻干燥，即制得包合物粗品。取适量的包合物，用适量的甲醇进行洗脱，并置于旋转蒸发仪上进行旋转蒸干，制得CDTE，备用。
2.3CDTE的表征
2.3.1薄层色谱表征(TLC)
图3所示实验样品1-5的处理方法：分别取1、2、3样品适量，于适量蒸馏水中溶解，作为样品1-3；分别取0.1446g EGCG、0.1455g CDTE，各用8mL蒸馏水溶解后，在恒温水浴锅中加热至50±2℃，保温5min，再各加入1.00gα-淀粉酶，在恒温水浴中反应2h，冷却至室温，各加入2mL乙酸乙酯萃取10min，再取其乙酸乙酯层，分别作为样品4和5。将样品1-5进行硅胶薄层实验(流动相：苯-甲酸乙酯-甲酸＝3-6-1)，观察色谱展开后的斑点位置并分析结果。
由图3的TLC结果知，1、2样品的TLC结果均未见斑点，说明EGCG与β-CD形成了包合物；3、4、5样品的TLC均可见斑点，且斑点位置相当，这表明EGCG不仅被β-CD包合了，且其性质未被改变；经α-淀粉酶酶解后，EGCG被释放，且α-淀粉酶对EGCG的性质也无影响。TLC结果证明本实验成功制备CDTE。
2.3.2核磁共振谱表征
核磁共振谱样品的处理：实验样品分别溶于500μL D2O中，浓度均为3.0×10-3M，核磁检测温度为35℃。
从图4可见，与纯β-CD(图4中的(a))相比，CDTE中β-CD(图4中的(b))的H-3，H-5，H-6质子信号明显向高场位移。
图5显示，与纯EGCG的1H-NMR(图5中的(a))相比，CDTE中EGCG部分的(图5中的(b))的H-2，H-3，H-6，H-8信号均明显向高场位移，而H-4β、H-2′和H-6′则明显向低场位移。图4和图5也是成功制得CDTE的证据之一。综合以上TLC和NMR实验数据，可证明本实验成功制备了CDTE。
3.微生物培养效果的比较
微生物实验是将茯砖茶中分离纯化得到的优势真菌(此处暂命名为Fg1，Fg2，Fg3，Fg4)，分别接种在普通PDA培养基、富含茶多酚培养基(CDTP-PDA)、富含EGCG培养基(CDTE-PDA)上，25℃恒温培养6天、观察、比较。
PDA培养基原料：市购。
CDTP-PDA的制备：称取一定量的PDA培养基，高压蒸汽灭菌处理；将2.3制备得到的包合物进行微波灭菌1min，待用；在培养皿(已灭菌处理)中分别加入20mL PDA(经过高压蒸汽灭菌处理，待冷却至60℃左右)，加入0.4500g CDTP，用玻璃棒(已灭菌处理)搅拌，使其均匀混合在PDA中，待冷却，即制得CDTP-PDA。
CDTE-PDA的制备：称取一定量的PDA培养基，高压蒸汽灭菌；将3.2制备得到的包合物进行微波灭菌1min，待用；在培养皿(已灭菌处理)中分别加入20mL PDA(经过高压蒸汽灭菌处理，待冷却至60℃左右)，加入0.4500g CDTE，用玻璃棒(已灭菌处理)搅拌，使其均匀的混合在PDA中，待冷却， 即制得CDTE-PDA。
将Fg1，Fg2，Fg3，分别接种在制备好的PDA平板、CDTP-PDA平板上，置25℃恒温培养箱中培养6天，观察。
图6-1A至图6-3B是PDA培养基与CDTP-PDA培养基培养真菌的结果。图6-1A、6-2A、6-3A均为PDA的培养结果，图6-1B、6-2B、6-3B是CDTP-PDA培养基的培养结果。图6-1是培养Fg1的结果，比较图6-1A和图6-1B，Fg1在两种培养基的条件下生长状态表现一致，均表现出菌落边缘呈白色绒毛状，中间先老化呈金黄色。图6-2是培养Fg2的结果，比较图6-2A和图6-2B，Fg2在两种培养基中均可正常生长，但菌落形态有差异，在普通PDA培养基中Fg2菌落呈青绿色；在本实验制备的CDPT-PDA培养基中Fg2菌落呈青白色。图6-3是培养Fg3的结果，比较图6-3A和图6-3B，Fg3在两种培养基中均可正常生长，但菌落形态有差异，在普通PDA培养基中Fg3呈灰黑色，但在本实验制备的CDTP-PDA培养基中菌落呈红褐色。
将Fg1、Fg2、Fg4分别接种在制备好的PDA平板、CDTE-PDA平板上，置25℃恒温培养箱中培养6天，观察。
图7-1A至图7-3B是PDA培养基、CDTE-PDA培养基培养真菌的结果。图7-1A、7-2A、7-3A均为PDA的培养结果，图7-1B、7-2B、7-3B是CDTE-PDA培养基的培养结果。比较图7-1A和图7-1B，Fg1在两种培养基中均可以正常生长，且生长状态表现一致，均表现菌落边缘呈白色绒毛状，中间先老化呈金黄色。比较图7-2A和图7-2B，Fg2在两种培养基中均可以正常生长，但菌落形态表现出一定的差异，在普通PDA培养基中，菌落呈青绿色；在CDTE-PDA培养基中，菌落呈青白色。比较图7-3A和图7-3B，Fg4在两种培养基中均可以正常生长，但在菌落形态上表现出一定的差异，在普通PDA培养基中，菌落呈灰黑色绒毛状；在CDTE-PDA培养基中，菌落呈灰白色绒毛状，另外图7-3B的菌落周围CDTE-PDA的颜色变为有趣的红色。
从以上结果知，在本实验制备的CDPT-PDA和CDTE-PDA培养基中，真菌是可以正常生长的，但真菌在含有、或不含有茶多酚或EGCG的培养基中的 菌落形态表现不一样。这可能是由于培养基中茶多酚的存在影响了真菌的生长状态。
因为茶叶是富含茶多酚的基质，所以真菌呈现的这种受到茶多酚影响的生长状态应该更接近于这些微生物在茶叶上生长的状态，其代谢机制更接近于真实环境中的机制，其代谢产物也更有可能是茯砖茶等黑茶中的活性物质。事实上，图6和图7已初步提供了一定的证据。如图6-3B和图7-3B中，微生物Fg3和Fg4在含有茶多酚或EGCG的培养基上生长，分别使得自身和周围培养基呈现了特有的红色，这与茯砖茶等黑茶具有红色汤色的特点是一致的。这些红色的物质，很可能是茯砖茶中风味和功效物质的来源。对这些物质，以及进一步用若干种微生物共培养的方法对培养基中其它代谢产物的产生机制的研究，将会在学术和应用领域有重要意义。这些潜在的成果均以富含茶多酚或EGCG的适合真菌培养的通用固体培养基的制备为基础。
Claims (1)
1.一种制备富含茶多酚或EGCG的适合真菌培养的通用固体培养基的方法，该方法首先制备茶多酚与β-CD包合物CDTP或EGCG与β-CD包合物CDTE，所述茶多酚与β-CD包合物CDTP或EGCG与β-CD包合物CDTE的制备方法包括以下步骤：
1)、制备β-CD饱和溶液
取经重结晶后的纯β-CD，置烧杯中，加蒸馏水，在60±1℃条件下制成饱和水溶液，保温，备用；
2)、称取茶多酚或EGCG，所称取的茶多酚或EGCG与前述饱和水溶液中β-CD的摩尔比例均为1:1，将称取得到的茶多酚或EGCG溶于无水乙醇中得到第一次混合溶液，再将第一次混合溶液逐滴加入到步骤1)制备的β-CD饱和溶液中得到第二次混合溶液，将第二次混合溶液在60℃条件下搅拌若干小时，然后4℃静置过夜，再将其置于冷冻干燥器中冷冻干燥，即制得包合物粗品；取包合物粗品粉末，用甲醇冲洗所述包合物粗品粉末，并将冲洗后的包合物粗品粉末进行蒸干，即可制得茶多酚与β-CD包合物CDTP或EGCG与β-CD包合物CDTE；
步骤2)中，将第二次混合溶液在60℃条件下置于磁力搅拌器上磁力搅拌4h；
步骤2)中，所述冷冻干燥器为真空冷冻干燥器，冷冻温度为-80℃；
步骤2)中，所述茶多酚或EGCG与无水乙醇的摩尔比例为7:85；
步骤2)中，所述包合物粗品粉末与冲洗用甲醇之间摩尔比例为(1～3):62；
所制得的茶多酚与β-CD包合物CDTP或EGCG与β-CD包合物CDTE用于制备适合真菌培养的通用固体培养基；
其特征在于包括以下步骤：称取一定量的PDA培养基，高压蒸汽灭菌处理，并冷却至60℃待用；将前述制备的包合物CDTP或包合物CDTE进行微波灭菌1min，待用；在已灭菌处理的培养皿中分别加入所述20mL PDA，加入0.4500g CDTP或CDTE，用已灭菌处理的玻璃棒搅拌，使其均匀混合在PDA中，待冷却，即制得富含茶多酚培养基CDTP-PDA或富含EGCG培养基CDTE-PDA。
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| Publication number | Publication date |
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| CN105462845A (zh) | 2016-04-06 |
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |