CN105445464A - 一种蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性测定方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛋氨酸腺苷转移酶(MAT)生物学活性测定方法和试剂盒。将样品与试剂按一定的比例混合，使之发生MAT催化的酶促反应，该反应与测定其产物S-腺苷蛋氨酸(SAM)的竞争性酶联免疫吸附实验可以分步或同时进行,以测定示踪物酶的反应产物在特定光谱处的吸光度，通过与标准品的吸光度相比，算出单位时间生成产物SAM的量来计算MAT生物学活性。定量SAM的方法是把示踪物标记到抗SAM抗体或SAM或SAM类似物抗原上，再通过竞争的原理使得生成的SAM与一定量的SAM抗原竞争抗SAM抗体。采用本发明方法的试剂盒使得MAT活性测定更加灵敏、准确、可靠、直接、简易和快速。利用本发明的方法测定并观察到了正常和肝癌细胞中MAT活性及在不同调控因素下对MAT活性的影响。

Description

一种蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性测定方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物样品检测技术领域，具体涉及一类蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性测定方法及测定试剂盒。
背景技术
除了依靠宿主为生的寄生物以外，所有物种的生物体细胞内都存在蛋氨酸腺苷转移酶(MethinineAdenosyltransferase,MAT，EC2.5.1.6)，又称S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethioninesynthetase)。MAT序列具有非常高的保守性，在人类和大肠杆菌之间MAT的基因序列有59％的同源性。在哺乳类，MAT存在由3个基因编码的三种同工酶,MAT-I和MAT-III是由同一个基因(MAT1a)编码的催化亚基α1组成，MAT-I为四聚体,MAT-III为二聚体主要存在于成年肝细胞。MAT-II是由另外一个MAT基因(MAT2a)编码的催化亚基α2组成，存在于其它细胞,胚胎肝脏和肝癌细胞。MAT2β基因编码调节亚基β，主要调节MAT-II。MAT在体内的催化反应分为二步:(1)催化蛋氨酸(Met)和三磷酸腺苷(ATP)生成S-腺苷蛋氨酸(俗称活化蛋氨酸,S-adenosylmethionine,SAM,AdoMet)和三聚磷酸(PPPi),SAM和PPPi仍然留在MAT表面上；(2)MAT的磷酸酶活性将把PPPi进一步分解二聚磷酸(PPi)和无机单磷酸(Pi)。
MAT催化L-甲硫氨酸或称蛋氨酸(L-Met)和三磷酸腺苷(ATP)生成S-腺苷甲硫氨酸或称S-腺苷蛋氨酸，MAT具有三磷酸酶活性，使三磷酸分解成焦磷酸和磷酸。其酶活性依赖于Mg2+和K+，酶促反应如下：
ATP和SAM是生物体内最常见的中间代谢产物。在蛋氨酸循环中，首先必须活化Met，形成SAM，SAM把甲基提供给生命过程中重要物质如DAN，RNA，脂蛋白,激素,神经递质等后变成同型半胱氨酸(HCY)，最后通过四氢叶酸提供的甲基,变成蛋氨酸。在肝脏中，蛋氨酸循环有个额外的功能，主要是在高蛋氨酸或高蛋白饮食后，用以迅速清除血液中过高的蛋氨酸，最后通过同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、谷胱甘肽被转运到其它器官。
SAM是自然界中仅有的几个功能极其多样而重要的含硫的生物活性物质，是蛋氨酸循环中的关键物质，是人类至关重要的甲基化修饰过程中甲基的唯一供体。在转甲基、转硫、转氨丙基反应中有重要的地位。对于甲基化相关的细胞功能、多胺合成、调节蛋氨酸与同型半胱氨酸的比例等有直接的影响。在各种生命重要的代谢反应和细胞的增殖分化等有重要意义。依赖于SAM的甲基转移酶占人类基因组的基因总数的1％。研究表明,肝脏中维持一定浓度的SAM对于肝功能的发挥起着至关重要的作用。大约85％的甲基化反应和约50％的蛋氨酸代谢是在肝脏中进行的，不仅提示肝脏在调节血液蛋氨酸水平有重要的作用(通过增强MAT-I/III的活性)，而且提示SAM在调控肝细胞再生，分化以及对各种因素(酒精，化学物质，辐射，病原微生物，病毒，寄生虫等)造成的肝细胞损伤的敏感性的重大意义。因此能够精确、敏感、方便地测定MAT在不同情况下的生物活性和产物SAM的含量，对于加深人们对蛋氨酸循环的深入了解，在不同组织和器官在不同生理和病理情况下的调控关系提供重要的研究工具。
在因肝脏炎症或氧化应激造成的肝损伤中观察到MAT酶部分失活。MAT1a基因在肝硬化和肝癌中完全不表达。在MATI/III缺失的小鼠中SAM水平下降；在甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)缺失的小鼠中，SAM水平上升，这两种情况下，小鼠出现肝癌的几率明显增加。
很多研究表明MAT与其催化合成的SAM在人体生命活动的不同阶段，如胚胎发生、发育、成长、分化、健康、疾病中起着至关重要的作用，就是因为SAM在蛋氨酸循环和一碳代谢中有非常重要的特殊作用，与人体新陈代谢状况直接相关。体内的SAM含量会因为年龄、性别、种族、体重、饮食、用药情况、健康和疾病状况而有所波动。鉴于这一特性，我们应该从SAM的合成和分解代谢两个方面来考察原因。因此，了解MAT在不同情况下生物活性的高低对于我们研究许多至关重要的代谢与健康问题有很大的实际意义。
MAT酶活性中心有两种构型,第一种构型利于SAM合成,第二种构型具有三磷酸水解活性。第二种构型的酶反应明显慢于第一种构型的。第一种构型到第二种构型的转换需要一定的时间。两种构型的差别在于对三磷酸酶和巯基亚硝基化的敏感性。
目前有两种办法测定MAT活性：方法一：MAT在饱和底物蛋氨酸,三磷酸腺苷和PPPi存在条件下，最终生成Pi的。用孔雀绿和钼酸铵直接染色法测定无机磷Pi的含量；方法二：高压液相(HPLC)或质谱(LC-MS/MS)方法测定MAT催化合成的产物SAM的量。
其中：方法一存在较大的局限性：(1)反应体系中PPPi,PPi和Pi,共存,孔雀绿和钼酸铵与PPPi和PPi也有一定的结合,测出的Pi值不准确；(2)灵敏度不高；(3)MAT的三磷酸酶活性需要经过构型转变才能发生,因此测定三磷酸酶的反应产物Pi有滞后效应,迟滞生成的Pi系间接法，因此变异性高；(4)MAT的三磷酸酶活性受Met影响较大,使得该方法稳定性受到影响；(5)完全依靠MAT的三磷酸酶活性来推测MAT的SAM合成能力(或活性)本身就有局限性，因为很有可能MAT的这两种酶活性不成比例,并极有可能不同的MAT酶活性(指SAM合成能力和PPPi的水解能力)在不同因素作用下表现出不同程度的影响,因而很难用MAT的磷酸酶水解活性准确地反映MAT的SAM合成活性。
Fernández-Irigoyen报道不同变异株的MAT-I和MAT-III酶活性跟野生型MAT-I和MAT-III相比,其三磷酸水解酶活性和SAM合成活性所受的影响各不一致,一些变异株三磷酸酶活性不变，而SAM合成活性有非常明显的降低；一些变异株SAM合成能力增强而三磷酸水解酶活性降低；还有一些是两种酶活性不同程度地都降低,总之,各种可能性都会存在。
SanxhezdelPino等发现MAT-III在121位半胱氨酸残基引入NO基团(亚硝基化),使得MAT的SAM和成活性明显降低,而对三磷酸酶活性没有抑制。因此，用测定Pi的方法衡量MAT活性只能反映SAM合成酶活性以及三磷酸酶活性的总体结果，不能很好地反应MAT的SAM合成能力，结果很不准确，因而有很大的局限性。
那么，Fernández-Irigoyen的报道SAM合成活性是使用上述的方法二，即高压液相(HPLC)方法测定SAM的生成量。其实无论是HPLC或LC-MS/MS哪种方法测定SAM含量，对于评估MAT活性都是很不准确的。我们知道SAM合成后一段时间都是结合在MAT上的，而HPLC和LC-MS/MS方法(1)只能测定游离状态的SAM分子；(2)HPLC和LC-MS/MS的样品，需要特殊处理，经过较长时间、较多步骤后SAM的含量必然有丢失；(3)不能及时测定SAM的量(SAM分子自身很不稳定，需要及时测定SAM)，所有这些因素都会造成所测的SAM值很不准确，更不用说试图达到反映酶动力学反应的目的。
因此，研发出一种能准确、快速、直接测定蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性的检测方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能准确、快速、直接测定蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性的方法以及利用该方法得到的试剂盒。本发明中涉及的一步法或同时法直接测定其合成的SAM产物含量，是MAT活性测定领域的创新。MAT是SAM合成的唯一的酶，无论体内还是体外方法测定MAT酶活性，本发明都可以最直接地第一时间地快速地测定SAM的含量，以推算MAT活性的高低，可以同时测定样品中SAM含量和MAT活性。本发明把MAT催化的生化反应与测定SAM的免疫反应同时进行，把这两个过程有机地结合起来，对于准确地测定分子性状及其不稳定的SAM尤其具有重大的意义。本发明的创新之处是利用抗S-腺苷蛋氨酸特异性抗体测定蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性。该蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性测定方法，有以下部分组成：(1)在保证蛋氨酸腺苷转移酶有生物学活性的缓冲体系中，含有酶的样品和底物进行反应以便产生一定量的S-腺苷蛋氨酸产物；(2)利用免疫学方法检测S-腺苷蛋氨酸的含量，来决定反应体系中蛋氨酸腺苷转移酶是否有活性，以及活性高低。其中：底物含有蛋氨酸，三磷酸腺苷，镁离子和钾离子等适当酸碱性的缓冲体系；样品可以来源于基因工程表达的产物、生物组织细胞内被纯化出的样品、组织细胞内的蛋氨酸腺苷转移酶，生物体液或组织细胞培养液，生物体液如血液，血浆，血清，唾液，尿液，脑脊液，腹腔或胸腔渗出液，组织液；免疫检测方法包含抗S-腺苷蛋氨酸特异性抗体，包括多种示踪物偶联的该抗体，S-腺苷蛋氨酸或其类似物，和偶联的S-腺苷蛋氨酸或其类似物；蛋氨酸腺苷转移酶的催化反应和所生成的产物S-腺苷蛋氨酸与包被的S-腺苷蛋氨酸抗原或示踪物标记的S-腺苷蛋氨酸抗原，竞争结合示踪物标记的抗S-腺苷蛋氨酸抗体或包被的抗S-腺苷蛋氨酸抗体的免疫反应是基于可以同时进行的一步法原理。
为解决现有技术(用孔雀绿和钼酸铵直接染色法测定无机磷Pi的含量；HPLC或LC-MS/MS)方法测定MAT催化合成的产物SAM的量)存在的问题，本发明提供了测定样品中蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性的方法，方案之一包括如下步骤：
(1)不同浓度标准品的配制：取试剂盒中的S-腺苷蛋氨酸标准品，用缓冲液配制成不同浓度的标准曲线样品；
(2)在包被有蛋白(或多聚体)-SAM抗原偶联物或的蛋白(或多聚体)-SAM类似物抗原偶联物的微孔板中，标准曲线孔中加入配制好的不同浓度梯度的标准品，在待检测样品孔中加入待检测样品；
(3)加入辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗S-腺苷蛋氨酸单克隆抗体，蛋氨酸、三磷酸腺苷、以及待测蛋氨酸腺苷转移酶的样品，混匀后37℃反应60分钟，反应结束后洗板；
(4)加入辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的底物，37℃显色15min，加入终止液终止反应，在酶标仪上选择450nm波长读取每孔的吸光度读数OD450；
(5)在同一酶联板中用配制的一系列梯度已知量的SAM作为标准品，作为标准曲线，据其OD450与已知标准品浓度获得曲线方程，再将样本OD450代入方程求得其对应的反应产物SAM的生成量；
(6)根据一定质量的含有MAT的样品在单位时间内催化生成产物SAM的浓度来计算MAT酶活性。
所述步骤(2)中的待检测样品可以来源于基因工程表达的样品、生物组织细胞内被纯化出的样品、生物体液或组织培养液。
所述步骤(3)中37℃反应的时间为20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、可以直接测定产物SAM的含量而不是Pi,能直接反映了MAT的合成SAM的能力，不受MAT构型转变的影响；
2、本发明中SAM生成和测定在同一个体系内一步完成，不存在滞后，结果准确及时；
3、用免疫学方法测定SAM，不仅特异而且非常敏感，不受SAM存在形式上即结合型和游离型的影响；
4、与现有技术相比，本发明不需要特殊仪器，仅利用常规实验室中的酶标仪即可进出检测。
因此，采用本发明的试剂盒使得MAT活性测定更加准确、可靠、直接、简易而快速，可同时获得样品中MAT活性和SAM含量。
本发明的重大意义在于，提供的新的MAT测定方法和产品，使得研究人员能够随时方便而准确地测定MAT酶活性，对于不同人群中MAT1A,MAT1B，MAT2基因表达概况的了解，以及其它任何与蛋氨酸循环性关的研究和开发工作的深入了解，有助于回答蛋氨酸代谢，体内甲基化状况(甲基化过程)，为各种情况下的甲基化机制的探讨，表观遗传学的深入研究,代谢性疾病,肿瘤的发生,发展,预后,营养,疾病和健康的研究和监测有重大的意义。此外，同型半胱氨酸-半胱氨酸-谷胱甘肽生成(转硫过程)以及多胺(转氨丙基过程)等等诸多代谢过程，也与SAM的生成有关系。
本发明另一目的是提供了蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性测定试剂盒，包括以下组分：包被有抗S-腺苷蛋氨酸抗体或S-腺苷蛋氨酸抗原或其类似物的微孔板；示踪物标记的抗S-腺苷蛋氨酸抗体或示踪物标记的S-腺苷蛋氨酸抗原或标记的S-腺苷蛋氨酸类似物；S-腺苷蛋氨酸标准品；由蛋氨酸，三磷酸腺苷组成，镁离子和钾离子等缓冲液组成的酶底物液；阳性质控品(蛋氨酸腺苷转移酶)；示踪物检测系统；适当的缓冲体系。其中：包被有S-腺苷蛋氨酸抗原的微孔板，包被的可以是多聚赖氨酸(PLL)，牛血清白蛋白(BSA)或者其它载体蛋白偶联的S-腺苷蛋氨酸或S-腺苷蛋氨酸类似物抗原，或者直接包被抗S-腺苷蛋氨酸抗体(单抗和多抗)，或者通过羊或兔抗鼠间接包被S-腺苷蛋氨酸单克隆抗体到微孔板上；示踪物，包括酶，荧光素，胶体金，化学发光物质，生物素，地高辛(或地高辛原)，放射性标记物质，各种类型的乳胶微球包括荧光微球和彩色乳胶微球等；所用示踪物相对应的显示系统；微孔板为可拆卸ELISA板条组成的微孔板；底物液和缓冲系统是经过反复试验后确定每个组分的最佳浓度，pH和反应时间等等。
本发明所举实例是基于酶联免疫吸附试验(ELISA)，即:包被有S-腺苷蛋氨酸抗原，或S-腺苷蛋氨酸类似物；辣根过氧化物酶等示踪物标记的抗SAM特异性抗体；S-腺苷蛋氨酸或S-腺苷蛋氨酸类似物的标准品；MAT阳性质控品；由蛋氨酸、三磷酸腺苷等组成的底物液；合适的缓冲体系；HRP底物显色剂TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)或其它示踪物显示或检测系统；ELISA终止液。本发明实例中报告的蛋氨酸、三磷酸腺苷和蛋氨酸腺苷转移酶使用量为：蛋氨酸的浓度和三磷酸腺苷的浓度根据所使用的MAT活性高低有所不同从微摩尔到毫摩尔级，因为底物交叉应经被排除而且每次实验均设有对照，因此底物大多时候应该过量没什么不良作用。酶反应体系的pH为7.42-8.5。MAT浓度亦根据来源不同而有所不同，针对本实验室使用的是大肠杆菌MAT基因表达的产物纯化物，使用浓度为0.3-1.0mg/ml。合适的缓冲体系,包括50-100mM镁离子，50-400mM钾离子，50-200mMTris盐酸缓冲系统。
本发明技术方案的详细阐述
与现有技术相比，本发明的关键点在于：
1.一步法或同时法，即把MAT酶促化学反应和生成的关键产物的定量过程放在一起同时进行，或者首先让MAT催化的化学反应单独进行一段时间，约20min,这对于MAT活性很低的样品尤其有必要，然后再引入免疫学反应进行的定量产物的检测。由于抗原抗体的结合需要较长的时间(一般认为37℃进行1h)，在免疫反应的过程中，MAT催化的化学反应仍然在进行，即不断有信的产物SAM生成。因此无论是否先让化学反应首先单独进行一段时间，本发明的关键点，即把催化反应和免疫反应有机结合为一体的设计并不矛盾，只是为了达到最佳检测灵敏度而在形式上做的的变体。为此，(1)最精确地、没有任何延误地反映MAT活性的动态变化；(2)由于产物SAM非常不稳定，其它方法即便测定SAM定量再准确，如果不能在第一时间测定极其不稳定的产物SAM，也不能够有效地、可靠而正确地算出MAT酶活性。
2.能够以最短的时间,同时测出样品中MAT活性和SAM含量。
3.免疫学方法和生物化学反应的有机结合，使得生物化学反应中的物质能够被有效、快速、特异、敏感地测出。
4.使得该一步法或同时法能够敏感地反映MAT活性变化的反应液配方，既保证酶学催化的生物化学反应能够正常进行，又使得免疫检测步骤得以有效地实施。
体外直接测定MAT活性的原理概括为：包被有SAM抗原的酶联板中加入适量的HRP标记的抗SAM的抗体。然后加入SAM标准品或MAT活性测定体系(含有蛋氨酸和三磷酸腺苷的适当的缓冲液，加上MAT阳性对照或待测有MAT活性的样品)做为SAM待测样品。37℃孵育一定的时间，然后加入HRP底物TMB显色，读取450nm下的光密度值。再根据SAM的标准曲线算出SAM的含量，根据产物SAM的量，推算出MAT催化反应生成SAM的能力。MAT样品可以来源于基因工程表达的MAT、生物组织细胞内被纯化出的样品、组织细胞内的MAT，生物体液或组织细胞培养液，生物体液如血液，血浆，血清，唾液，尿液，脑脊液，腹腔或胸腔渗出液，组织液等。
该发明详细的技术原理和路线阐述如下：
1、MAT催化反应原理：
2、直接法竞争性ELISA测量SAM的原理和方法：
(A)包被抗原法：预先将PLL或BSA偶联SAM抗原包被在固相ELISA板中，用BSA封闭后，同时加入待检抗原(SAM样本)和HRP酶标抗SAM抗体。待检抗原与包被抗原共同竞争酶标抗体，反应后洗板，与包被抗原结合的酶标抗体保留，与待检抗原(游离抗原)结合的酶标抗体则被洗掉。最后加入底物显色，最终显色结果与待检抗原量成反比，即OD450值越高，待测样品中SAM含量越低。在实验过程中，同一ELISA板中用配制的一系列梯度已知量的SAM作为标准品，作为标准曲线。据其OD450读数与已知标准品浓度获得曲线方程，再将样本OD450代入方程求得其对应浓度值。图1所示该直接竞争性ELISA原理。
(B)包被抗体法：先将羊或兔抗鼠IgG包被的微孔板中4℃过夜包被，加入最佳剂量的抗SAM抗体孵育30-60min，或者直接包被最佳剂量的抗SAM抗体，洗板；加入HRP偶联的SAM抗原或其类似物，再加入SAM标准品和样品，该标准品和样品与HRP偶联的SAM抗原或其类似物竞争包被在酶联板上的抗SAM特异性抗体，孵育30min，洗板；加入TMB，反应15min，加入终止液；记录OD450。根据标准曲线，计算出样品中含SAM的浓度。
3、结合以上MAT的催化反应和直接法竞争性ELISA，探讨合二为一的一步法或同时法的可行性。为了使该法结果有理有据，本发明分以下几个步骤，来详细阐述改发明的技术细节：
第一步：排除抗SAM抗体与蛋氨酸腺苷转移酶底物三磷酸腺苷(ATP)和蛋氨酸(L-Met)交叉。以避免交叉反应对竞争ELISA的干扰。
第二步：摸索不同pH条件蛋氨酸腺苷转移酶与底物ATP和L-Met最佳反应配比。
第三步：确MAT合适反应时间，并设置合适时段测SAM反应生成量。制作SAM量随时间变化曲线图。证实多种抗SAM单克隆抗体118-6、84-3和兔抗SAM多克隆抗体与酶合成的SAM的反应。
第四步：在最佳反应条件下，测定小鼠肝脏细胞纯化的MAT酶活性。
第五步：在最佳反应条件下，测定正常肝细胞系L02和肝细胞癌细胞系HepG2在不同MAT调控因子作用下的MAT酶活性的变化。
第六步：试用不同的包被抗原和SAM标准品，在确定的最佳反应条件下，对测定MAT活性的影响。
4、做实验反复优化每个组分的最佳浓度，反应时间，缓冲液配方和pH值，标准曲线和标准品范围等。
上述技术路线已经在以下实例中得到充分详细的证实。从中不难看出，本发明涉及到的方法的优越性包括但不限于以下：(1)直接测定MAT的重要产物SAM而不是次级产物Pi,因而是最直接的反映MAT的SAM合成能力；(2)SAM生成和测定在同一个体系内一步同时完成，能够很好地捕捉到不同情况下MAT活性的变化，更好地控制酶反应时间，因而结果会非常准确而及时；(3)用特异性，灵敏度，亲和力都很高的抗SAM抗体及时定量SAM产物，不仅特异，而且非常敏感，不受SAM存在形式(结合型和游离型)的影响；(4)方便，快捷，因此非常有利于研究各种因素对样品中MAT活性的影响，即使影响很微妙，也能够测定出来。
本发明同时也鉴定了以BSA和血蓝蛋白(KLH)偶联的SAM或SAM抗原类似物包板，以及直接法竞争性ELISA测量SAM的(B)包被抗体法，结果与实例中所述一致。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单介绍。
图1：直接竞争性ELISA步骤与组成部分示意图。图中显示包被到板上结合的是抗原而非抗体的例子。
图2：蛋氨酸腺苷转移酶浓度、蛋氨酸底物量、反应体系pH值对S腺苷蛋氨酸合成的影响。SAM的合成产量以A/A0表示,即样品孔和对照孔OD450的比值；A/A0越低,表示与包被抗原竞争HRP标记抗体的能力越大，SAM生成量越高,MAT活性越大。
图3：体外直接测定MAT活性最佳反应时间确定。MAT酶催化底物生成SAM的量在60min前处于直线上升期；60-90min内SAM量无明显变化，处于平台期，说明1小时(h)后可能底物浓度不够或者酶活已经丧失，导致SAM生成量无增加，酶浓度1.0mg/ml比0.6mg/ml反应速率快。
图4：亚硝基谷胱甘肽(GSNO)和Met对正常肝细胞系L02和肝癌细胞系HepG2细胞不同MAT活性调控。纵坐标是MAT合成的SAM浓度。在GSNO和不同浓度的Met对L02细胞中的MAT-I/III和HepG2细胞中MAT-II的活性有调控作用。对L02细胞：500uM的Met刺激MAT-III/I活性，2mMMet刺激作用不明显。GSNO亚硝基化后对MAT-III/I的抑制作用也较明显。HepG2细胞：Met抑制MAT-II活性，GSNO对MAT-II无抑制作用。
图5：正常肝细胞L02和肝细胞癌HepG2在0.5mMMet刺激24h前后以抗SAM单克隆抗体1:400免疫荧光染色的结果对比(x200)。A:L02,0nMMet；B:L02,0.5mMMet24h；C:HepG2,0nMMet；D:HepG2,0.5mMMet24h。在黑色背景下，绿色荧光(浅色)阳性细胞示有SAM表达，黑色背景示无货极低SAM表达。可以看出，Met刺激L02细胞的MAT-III/I的活性，因而SAM表达在B组比A组有所增加；相反，Met抑制HepG2细胞的MAT-II的活性，因此SAM表达在D组比C组的低。
具体实施方式
下面结合实验结果及数据进一步对本发明作详细说明。未提到的原料为常规商品化试剂，可以从市场上购得。
实例1抗SAM抗体与蛋氨酸腺苷转移酶底物ATP和L-Met交叉反应
实验材料
HRP酶标抗SAM抗体：ArthusBiosystems,MA00201,MA00102,PA00201；多聚赖氨酸(PLL)或牛血清白蛋白(BSA)SAM包被ELISA板：ArthusBiosystems,ACT00201,ACT00204；S-腺苷蛋氨酸(aza-SAM)标准品：ArthusBiosystems,AST00201；
S-腺苷蛋氨酸(对苯磺酸二硫酸腺苷蛋氨酸，SAMe)标准品：Sigma,A2408，以及陕西先锋生物技术有限公司；蛋氨酸腺苷转移酶(MAT),Na2HPO4.12H2O：北京爱必信生物技术有限公司Abt-P-005；BSA，Tris-Cl，NaCl，NaH2PO4，Na2HPO4：北京华美加成生物技术有限公司；KCL：天津大茂化学试剂厂；MgSO4:湖南宏灏基因技术有限公司；三磷酸腺苷(ATP)：上海晶纯化学试剂有限公司；左旋蛋氨酸(L-Met)，ProClin300：Sigma；TMB显色液：湖州英创生物技术有限公司；硫酸：湖南康都制药有限公司；96孔酶联板：美国Corning高吸附酶联板条。
试剂配制：
酶反应缓冲液：100mMTris,100mMKCl,20mMMgSO4，ProClin1％调pH7.42，pH8.0，pH8.5；SAM类似物标准品(aza-SAM)：960nM、480nM、240nM、120nM、60nM、30nM、15nM、0nM，缓冲液为pH7.42酶反应缓冲液；SAM类似物质控品在(aza-SAM)：200nM,缓冲液为pH7.42酶反应缓冲液；SAM标准品(SAMe)：1-40uM，缓冲液为pH7.42酶反应缓冲液；SAM质控品在(SAMe)：8uM缓冲液为pH7.42酶反应缓冲液；0.5％或0.2％IB：10nMPB，150mMNaCl,0.5％或0.2％BSA，0.1％ProClin。
取包被PLL-SAM抗原ELSIA板条，SAM标准曲线用0.5％IB0、15、30、60、120、240、480nM标准品，ATP和L-Met交叉物浓度0、120、1200、3960、12000nM。HRP-抗SAM酶标抗体1:25000用HRP稀释液稀释。标准品和交叉类似物ATP和ADP每孔30ul，HRP-抗SAM抗体稀释后每孔加70ul。37℃反应1h，洗板后100ulTMB37℃显色15min，终止液加50ul后读数。结果如下：
表1抗SAM单克隆抗体与ADP和Met的反应率(A/A0)
SAM nM SAM标曲 ATP L-Met nM 交叉率
0 1 1 1 0
15 0.793999439 1.0513698 1.0421467 120 50％
30 0.723637723 1.0007116 1.0464435 1200 10％
60 0.585606131 1.094967 1.0118777 3960 3％
120 0.430096271 1.0861819 1.0953228 12000 1％
240 0.271109449
480 0.123357323
交叉率 <1％ <1％
A/A0；反应率(A0为0nM时OD450读数，A为游离小分子竞争孔的OD450读数)
交叉率＝(C游离抗原50％抑制/C交叉物50％抑制)*100％
反复实验结果认为，ATP，ADP和Met与抗SAM单克隆抗体118-6，84-3及兔抗SAM多抗R3交叉率都远小于1％。抗SAM抗体与蛋氨酸，腺苷，S-腺苷同型半胱氨酸交叉和甲硫腺苷的交叉也是远小于1％(见抗体产品资料)。因此，本实验不存在与反应体系内的其它成分有任何的交叉反应。
实施例2：酶活性测定体系：在不同pH条件下蛋氨酸腺苷转移酶与蛋氨酸、三磷酸腺苷最佳反应配比
取包被PLL-SAM抗原ELSIA板条，以酶反应缓冲液pH7.42、pH8.0、pH8.5配制不同浓度ATP、Met和MAT酶配方。代号A\B\C\D为四种Met浓度、三磷酸腺苷组分，代号1\2\3为三种MAT酶浓度，两者组合进行棋盘配制，共得到12种具有不同浓度的蛋氨酸腺苷转移酶与蛋氨酸、三磷酸腺苷组成的酶活性测定液。
反应混合物每孔30ul，HRP标记的抗体每孔70ul。37℃反应1h，洗板后每孔加入100ulTMB，37℃显色15min后，加入终止液50ul后读数。结果如下：
表2不同底物浓度，MAT用量和pH条件下MAT催化合成反应OD450对比
SAM的合成产量以A/A0表示,即样品孔和对照孔OD450的比值。A/A0越低,表示与包被抗原竞争HRP标记抗体的能力越大，SAM生成量越高,MAT活性越大。结果如下：
表3不同底物浓度，MAT用量和pH条件下MAT催化合成SAM的相对量对比
以得到的反应反应率，即A/A0与蛋氨酸浓度进行作图，得到附图2所示的结果：⑴不同pH条件下，底物、酶量不变时，pH8.5时A/A0最小，pH8.0最高。但SAM提高的生成量并不是很可观；⑵底物ATP不变(2.4mM)，Met从0.2、0.8、1.6、2.4mM升高时，SAM生成量明显提高；⑶MAT酶量提高时，其SAM生成量迅速提高。
从上面三个不同条件来看，影响SAM生成反应的最强因素在于MAT的量，其次是底物Met的提高，最小的是缓冲液pH。另外，由于本实验所使用的MAT是大肠杆菌MAT基因表达的产物,其催化能力不是很好，因此所需要的底物浓度较高，但是实验证明即使在毫摩尔级的Met和ATP,也没有出现交叉反应。由于本实验目的不是筛选高活性的MAT，因此，该MAT可以满足建立MAT活性检测方法的需要。由于MAT在偏碱性条件下如pH8.5活性较高，但是抗原抗体结合在pH8.5时比pH7.42时有所降低，因此出现了图2的A/A0在pH7.42和pH8.5时较低(即SAM合成量较大)，在pH8.0时A/A0较高(即SAM合成量较小)的情况。因此最佳MAT测定体系应该综合考虑多方面的因素。pH值选7.42和8.5均可。
实施例3：体外测定MAT活性最适宜反应时间段确定
取包被PLL-SAM抗原ELSIA板条，以酶反应缓冲液pH7.42配制SAM标准品0、15、30、60、120、240、480、960nM及200nM质控。配制ATP和Met2.4mM、MAT酶0.6mg/ml,ATP和Met2.4mM、MAT酶1.0mg/ml(均为终浓度)作为生成SAM底物与酶量。标准品和酶反应物每孔30ul，HRP标记的抗体每孔70ul。37℃反应时长取30min、60min、90min，洗板后100ulTMB37℃显色15min，终止液50ul后读数。
表4不同反应时间对MAT催化合成SAM的量的影响
测量浓度nM 30min 60min 90min10 -->
ATP和Met2.4mM，MAT 0.6mg/ml 116.3030073 221.5053 204.34158
ATP和Met2.4mM，MAT 1.0mg/ml 270.8731347 396.8892 410.82783
从上述结果显示，60min比30min生成的SAM量明显增加，但90min与60min持平。可从20-90min细化时段测量，得到SAM产量随时间变化曲线。
取包被PLL-SAM抗原ELSIA板条，以酶反应缓冲液pH7.42配制SAM标准品和质控。配制ATP和Met2.4mM、MAT酶0.6mg/ml,ATP和Met2.4mM、MAT酶1.0mg/ml(均为终浓度)作为生成SAM底物与酶量。标准品和酶反应物每孔30ul，HRP标记抗体每孔70ul。37℃反应时间见表5，洗板后100ulTMB于37℃显色15min，终止后读数。读数结果与数据处理同前，测量浓度如下：
表5反应时间与SAM的合成量的关系曲线
以合成的SAM浓度与反应时间进行作图，得到附图3所示的结果。该实验结果已经在不同的缓冲体系，不同MAT条件下得到多次验证。结果显示，MAT酶生成SAM量在60min前处于直线上升期，60-80min时，SAM量无明显变化，处于平台期，说明1h后可能底物浓度不够或者酶活已经丧失，导致SAM生成量无增加。酶浓度1.0mg/ml比0.6mg/ml时反应速率快。
实施例4：体外测定MAT活性最适宜缓冲体系
采用跟以上实例相似的体系，包被PLL-aza-SAM0.05ug/ml，一抗HRP-anti-SAM抗体118-61:30000孵育1h，所配制每种溶液pH＝7.40±0.05,ATP5mM、Met4mM、MAT酶1mg/ml。滴定Mg2+时，缓冲液含有KCl250mM，Tris100mM。滴定K+时，缓冲液含有MgSO420mM，Tris100mM。待Mg2+和K+最佳浓度定了以后，重新滴定Tris,结果见表6。MgSO4从4mM-100mM,A/A0逐渐降低了0.475，4-50mM时降低很快，50-100mM时降低慢，MgSO4选择50mM与100mM之间都适宜。KCl从50-400mM时其A/A0变化不大，无明显降低和升高趋势，选用150mM左右。Tris仍是100mM最好。
表6反应时间与SAM的合成量的关系曲线
实施例5：正常肝细胞系L02和肝癌细胞系HepG2在不同条件下的MAT活性
实验材料：
无菌PBS，0.25％胰酶(阿拉丁)，10％FBS(元亨圣马)的1640培养基(Gibco)，无血清MEM培养基(Gibco)，10mg/ml的Met无菌浓缩液，GSNO，15cm2方瓶，75cm2方瓶(Corning)，FITC-羊抗鼠IgG(abcam)，DAPI(LifeTechnologies)；曲利苯蓝粉末(阿拉丁)：
磷酸盐缓冲液(PBS)：NaCl8g，Na2HPO4.12H2O2.885g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，超纯水1000ml；胰酶(0.25％胰蛋白酶)：胰蛋白酶0.1g，4％EDTA溶液200μl，1×PBS溶液39.8ml；胰蛋白酶充分溶解后用0.2μm无菌过滤头(Pall)过滤。
台盼蓝溶液(4％曲利苯蓝溶液)：曲利苯蓝1.6g，超纯水40ml，用滤纸过滤。
实验设计见表7。
表7GSNO预处理及Met对L02和HepG2细胞内MAT活性影响的实验组参数
编号 1 2 3 4 5
GSNO 0mM 0mM 0mM 1mM 1mM
Met 0mM 0.5mM 2mM 0.5mM 2mM
实验步骤：
1.观察方瓶内细胞处于80％左右汇合度时，将10％胎牛血清的1640培养基去除后用PBS洗一遍；
2.分别取两组加入含1mMGSNO的无血清MEM培养基，在培养箱中处理30min；
3.去除含GSNO的无血清培养基，用PBS洗一遍；
4.按照如上表的参数分别往方瓶中放入含Met的无血清MEM培养基(含5％胎牛血清和2mM谷氨酰胺)，对照组加无Met添加的MEM，置于培养箱中孵育24h；
5.去除瓶内培养基，加入适量体积的胰酶，保证胰酶覆盖整个方瓶底部；
6.将方瓶置于37℃、5％CO2培养箱中2-3min，当细胞开始成片脱落时，加入5ml含10％FBS的1640培养基终止。
7.离心后用1ml左右PBS重悬,台盼蓝计数；
8.取1ml各组细胞悬液在冰浴中超声破碎(参见实施例5)，在15000g下离心取上清。
9.按实例3中所述方法37℃反应60min，测定所生成的在细胞上清中MAT的活性。
由于用于ELISA测定的每个实验组细胞量不会完全相同，最后L02,HepG2按细胞计数(调整后)2X107。在不同条件下MAT催化生成的SAM的量如表8和图4所示。
表8GSNO和Met对L02和HepG2细胞不同MAT活性影响
HepG2 SAM(nM) L02 SAM(nM)
0mM Met 247.4761 0mM Met 274.4578162
0.5mM Met 222.3993 0.5mM Met 377.700459
2mM Met 174.3621 2mM Met 236.4367472
0.5mM Met+1mM GSNO 200.6807 0.5mM Met+1mM GSNO 226.6779748
2mM Met+1mM GSNO 198.1654 2mM Met+1mM GSNO 176.6032683
人类正常肝细胞系L02表达MAT1a基因编码的催化亚基α1组成的二聚体MAT-III或四聚体MAT-I，而HepG2肝癌细胞则表达MAT2a/2b基因编码的催化亚基α2和调节亚基β组成的四聚体MAT-II。这两个基因编码的两种MAT酶对Met刺激的反应，表达的细胞类型和作用不尽相同。在成人肝细胞存在的MAT-III或MAT-I，对Met刺激敏感，其功能是在高Met饮食时，迅速降低血液中Met的水平，因此MAT-III或MAT-I活性在Met刺激下增高[5]，我们的结果显示500uM的Met在体外刺激24小时使得MAT-III或MAT-I活性明显增高，GSNO亚硝基化后对MAT-III或MAT-I的抑制作用也较明显；Met在2mM时未见对MAT-III或MAT-I活性的刺激作用，反而MAT活性稍有下降，原因尚不明确，但是GSNO亚硝基化修饰后的活性抑制作用在2mM的Met时的作用仍然很明显。相反，在肝癌细胞系中，Met抑制MAT-II活性的剂量关系与文献报道一致[12]，即Met浓度越高，MAT-II活性越低。此外我们的结果也显示了亚硝基化作用对MAT-II的作用及其微弱，这与文献报道的GSNO中的NO通过与MAT-III的第121位半胱氨酸结合而抑制MAT酶活性的结果相符合[5]，即GSNO主要抑制Met刺激的MAT-III/I的活性增强。
在用竞争性ELISA定量SAM的同时，对这两种细胞系进行了免疫荧光染色，方法如下：
(1)将HepG2和L02细胞从方瓶内消化下来；
(2)1050rpm离心5min，用10％FBS的1640培养基(Gibco)重悬；
(3)用台盼蓝计数后，按照7.5×104cells/孔的密度将细胞接种至24孔，每个细胞各接种8个孔；
(4)将24孔内补齐培养基至1ml/孔，并置于培养箱中培养24h；
(5)将孔内原有的培养基去除，按照表1分别加入5％FBS的MEM培养基和含500uMMet的上述培养基1ml/孔，置于培养箱孵育24h。
(6)将孔板置于培养箱中孵育24h后，弃去培养基，用37℃预热的PBS洗2遍，每孔加500ul80％冰丙酮于-20℃固定20min，PBS洗3次。
(7)一抗作用：PBS配制0.5％脱脂奶粉，1:400稀释抗SAM单抗，每孔加50μL，37℃湿盒作用1h，PBS洗3次。
(8)二抗作用：0.5％脱脂奶粉1:500稀释FITC标记羊抗鼠IgG，每孔加50μL，37℃湿盒作用45min，PBS洗5次(避光)；普通荧光显微镜观察并拍照。
(9)加入100μL的0.5mg/ml的DAPI(diamidino-2-phenylindole,二脒基-2-苯基)作用20min，染细胞核；PBS洗涤5次后，激光共聚焦直接观察并拍照。
图5显示L02和HepG2细胞在上述类似条件下以0.5mMMet刺激24h后，和与未经过Met刺激后的免疫荧光染色的结果对比。定性的结果表明0.5mMMet刺激24h后，L02细胞内SAM合成增加，其原因是MAT-III/I活性增强；而HepG2细胞由于Met抑制MAT-II活性，因此Met处理组SAM合成的量降低。免疫荧光染色激光共聚焦显微镜结果再次证实上述结果。
实施例6：小鼠肝脏纯化的MAT酶活性测定
实验设备：
PPS蛋白纯化系统(中科院工程所)；超声破碎仪(宁波新芝)；高速冷冻离心机(湘立离心机)
试剂配制：
组织匀浆液：蔗糖0.25M，Tris10mM，EGTA0.1M，β-巯基乙醇0.1％。pH7.5；缓冲液A：MgSO410mM，EDTA1mM，Tris10mM，pH7.5；缓冲液B：缓冲液A+600mMKCl；透析液：缓冲液A+75mMKCl；pH7.42酶反应缓冲液：100mMTris，100mMKCl,20mMMgSO4，ProClin1％调pH7.42；50％DMSO：缓冲液A+等体积DMSO。
肝组织匀浆：
1、解剖小鼠，去除肝脏中结缔组织，置于去重的1.5mlTube中，称量肝脏净重0.6g。
2、以生理盐水1ml清洗肝脏3-5次直至清洗液清亮透明为止。
3、将肝脏剪碎后放入干净组织匀浆器中，加入3倍肝脏重体积冰浴的组织匀浆液。在冰浴中转动研磨6-8min，充分研碎。将匀浆液倒出，匀浆器中加入1倍肝重体积组织匀浆液清洗管壁并吸出置于匀浆液中。
4、将组织液冰浴置于超声粉碎机中进行粉碎，φ6探头，功率80％，工作时间3秒，间歇时间3秒，超声30min。
5、组织液15,000xg高速冷冻离心20min，上清用定性滤纸过滤。共得匀浆液150ml
6、每100ml匀浆组织液中缓慢加入31.3g硫酸铵，边加入边搅拌，共加入47g硫酸铵，使饱和度达到50％。搅拌30min后静置60min。
7、高速冷冻离心去上清。沉淀用预冷透析液150ml溶解，于2L透析液中透析，换液一次。过DEAE柱
1、透析样品处理：将透析样品取出，高速冷冻离心去沉淀，上清用滤纸过滤,得样本230ml。
2、取60mlDEAE填料，装柱(3X20cm)，上PPS层析系统，以10ml/min流速用去离子水淋洗30min，再以透析缓冲液平衡。
3、将样本与填料在4℃冰箱内使用低速摇床混合90min。
4、装柱，上层析系统淋洗，透析缓冲液6ml/min30min。紫外归零。
5、洗脱：20min100％缓冲液B拉升盐线性梯度洗脱，流速6ml/min。待紫外监测峰出现时，开始收集，至峰结束，每管5ml。共收集38管。
DEAE洗脱样本MAT活性检测：
取包被PLL-SAM抗原ELSIA板条，以酶反应缓冲液pH7.42ATP&Met2mM，洗脱样本50％配制MAT反应体系。以无反应底物ATP&Met为对照，用SAM试剂盒测量每管洗脱液生成SAM量。间接反应MAT活性及其洗脱范围。活性单位定义为每毫克MAT酶每分钟生成SAM的nM数。
表9不同DEAE洗脱样本的反应率A/A0
洗脱1 0.994 洗脱9 0.938 洗脱17 0.774 洗脱25 0.985 洗脱33 0.966 MAT
洗脱2 0.981 洗脱10 0.897 洗脱18 0.782 洗脱26 0.956 洗脱34 1.004 MAT
洗脱3 0.958 洗脱11 0.880 洗脱19 0.830 洗脱27 0.950 洗脱35 0.986 ATP+Met
洗脱4 0.954 洗脱12 0.829 洗脱20 0.843 洗脱28 0.975 洗脱36 0.951 Buffer
洗脱5 0.976 洗脱13 0.864 洗脱21 0.844 洗脱29 0.966 洗脱37 0.963 MAT对照
洗脱6 0.985 洗脱14 0.799 洗脱22 0.865 洗脱30 0.968 洗脱38 1.002 MAT对照
洗脱7 0.971 洗脱15 0.732 洗脱23 0.878 洗脱31 0.995 前洗脱 0.956 空白
洗脱8 0.961 洗脱16 0.688 洗脱24 0.949 洗脱32 1.007 FT 0.943 空白
表9中反应率A/A0<90％的洗脱部分竞争抑制明显，取洗脱10-23管洗脱部分合并,透析过夜，以备上PhenylSepharoseFastFlow柱子。透析后浓度为5.98mg/ml，共70ml。该组分的活性：28nM/60/0.015mlx5.95mg/ml＝5.3U(nM/min/mg)
过PhenylSepharoseFastFlow
1、取20mlPhenylSepharoseFastFlow填料，装柱，以10ml/min流速用去离子水淋洗10min，再以缓冲液A+220mMKCl平衡。
2、将样本与填料在4℃冰箱内使用低速摇床混合90分钟。
3、上层析系统，紫外归零。
4、洗脱，以预冷的50％DMSO6ml/min洗脱，收集洗脱峰，透析。
洗脱样本检测
同上合并3管洗脱样品测定MAT活性,上样量15ul,SAM生成量为15nM.该组分的比活性为15nM/60/0.015mlx2.93mg/ml＝5.7U(nM/min/mg)。
由于所剩样品量有限，没有做进一步的纯化。但是2步柱层析组分已经测到MAT活性。提示本发明的测定MAT活性的方法也适用于从鼠肝中纯化的MAT酶活测定。
实施例7：不同的操作步骤对SAM生成量的影响
为了明确不同的操作步骤或方法对SAM生成量的影响，在使用上述最佳的缓冲体系和底物浓度条件下，MAT酶与底物先在包被有PLL-aza-SAM的板条里于37℃反应20min，再与HRP标记的抗SAM抗体反应40min。同时做MAT直接与底物和HRP标记的抗SAM抗体反应1h。结果显示分步法或两步法反应的生成SAM量高于一步法生成的SAM的量，原因在于前20min反应时，体系总体积只有30ul，其MAT浓度以及底物浓度均比一步法理论上高出2.33倍。表10比较了这两种不同的操作步骤对SAM生成量的影响。在MAT浓度较低0.3mg/ml时，两步法生成的SAM是一步法生成SAM的2.81倍，在MAT浓度为0.6mg/ml时，两步法生成的SAM是一步法生成SAM的1.76倍，在MAT浓度增加到1mg/ml时，两步法生成的SAM是一步法生成SAM的1.42倍。如果MAT继续增加，可以预见分步法或两步法将会与一步法所生成的SAM产量相接近。虽然SAM生成量的增加(2.81,1.76,1.42倍)没有底物浓度和MAT浓度增加(3.33倍)的幅度大，但是分步法对SAM产率的提高还是有帮助的，尤其在待测的MAT浓度或活性较低时，分步法的作用和优势更加明显。如果待测样品MAT活性较高，只是要比较各组之间在不同条件下的差别，一步法更省事更方便，对测定的值没有多大影响。
表10不同的操作步骤对SAM生成量的影响
本发明的诸多实例证明我们所建立的体系非常敏感，准确而可靠地测定MAT的生物学活性。尽管本实例中的采用了分步法，但是仅仅是为了选择性的让MAT催化的化学反应先在一个独立最佳的环境下更有效地进行，然后立即进行定量性的免疫学检测，在第二步40min的免疫检测过程中，MAT催化的化学反应仍然在不断地进行，新生成的SAM立即参与竞争性免疫反应，从而在最佳体系内，所有生成的SAM都参与了竞争示踪物标记的特异性高的抗SAM抗体，所以，结果会非常准确，不会出现生成SAM由于各种原因造成损失导致测定结果不准确性的问题。因此，本发明提出两种操作步骤都是非常有用的，可以根据具体情况正确地使用。
实施例8：利用与以上不同包被抗原和标准品测定MAT活性
除了包被抗原使用1ug/mlBSA-SAMe，标准品同样采用与包被抗原同批次的SAMe，抗SAM抗体使用HRP-anti-SAM84-3(ArthusBiosystems,MAH00202),表11示一次实验的结果，SAMe做标准品线性很好，MAT在0.3mg/ml时，测得催化生成的SAM约3uM左右。表明使用SAM类似物aza-SAM包板和做标准品类似物和以SAMe包板和做标准品都可以很好地反映MAT活性的改变，由于与抗体结合力有差别或其他因素，导致达到相同光密度读数，需要的抗原量不同，导致这两个体系测量值和线性范围有差别，但是曲线线性和灵敏地反映MAT活性变化这点是一样的，因此本发明描述的两种体系均可以使用。
但是，多次试验证明，本实例中使用SAMe包板和做为标准品的结果总体来说，与实例1-7中使用的包被SAM类似物抗原和以稳定的类似物作为标准品的方案相比，重复性差一些，线性范围不稳定。然而，如果能够很好地控制原料的SAMe的来源和规范一些相关的过程与方法，本实例中的方案也是可行的。
表11SAMe用于测定MAT活性的标准曲线和结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (12)

1.一种测定蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性的方法，使用抗S-腺苷蛋氨酸特异性抗体。
2.一种蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性测定方法，由以下两部分组成：(1)在保证蛋氨酸腺苷转移酶有生物学活性的缓冲体系中，含有酶的样品和底物进行反应以便产生S-腺苷蛋氨酸产物；(2)利用免疫学方法检测S-腺苷蛋氨酸的含量，来决定反应体系中蛋氨酸腺苷转移酶是否有活性，以及活性高低。
3.根据权利要求2所述的蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性测定方法，(1)中底物含有蛋氨酸，三磷酸腺苷，镁离子和钾离子适当酸碱性的缓冲体系。
4.根据权利要求2所述的测定蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性的方法，(1)中的样品可以来源于基因工程表达的产物、生物组织细胞内被纯化出的样品、组织细胞内的蛋氨酸腺苷转移酶，生物体液或组织细胞培养液，生物体液为血液，血浆，血清，唾液，尿液，脑脊液，腹腔或胸腔渗出液，组织液。
5.根据权利要求2所述的蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性测定方法，(2)中免疫学方法包含抗S-腺苷蛋氨酸特异性抗体，包括多种示踪物标记的抗S-腺苷蛋氨酸抗体，S-腺苷蛋氨酸或其类似物，和偶联的S-腺苷蛋氨酸或其类似物，包被上述组分之一的介质以及相应的示踪物检测体系。
6.根据权利要求2所述测定蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性的方法，蛋氨酸腺苷转移酶的催化反应和生成的产物S-腺苷蛋氨酸与(1)包被的S-腺苷蛋氨酸抗原，竞争结合示踪物标记的抗S-腺苷蛋氨酸抗体，或(2)示踪物标记的S-腺苷蛋氨酸抗原，竞争结合包被的抗S-腺苷蛋氨酸抗体的免疫反应是可以同时进行的一步或分步法原理。
7.蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性测定试剂盒，根据设计可以包括以下组分：包被有抗S-腺苷蛋氨酸抗体或S-腺苷蛋氨酸抗原或其类似物的微孔板；示踪物标记的抗S-腺苷蛋氨酸抗体或示踪物标记的S-腺苷蛋氨酸抗原或标记的S-腺苷蛋氨酸类似物；S-腺苷蛋氨酸标准品；由蛋氨酸，三磷酸腺苷组成和适当缓冲液组成的酶底物液；阳性质控品；示踪物检测系统；适当pH的缓冲体系。
8.根据权利要求7所述的蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性测定试剂盒，所述包被有S-腺苷蛋氨酸抗原的微孔板，包被的是多聚赖氨酸，牛血清白蛋白或者其它载体蛋白偶联的S-腺苷蛋氨酸或S-腺苷蛋氨酸类似物抗原，或者直接包被抗S-腺苷蛋氨酸抗体，抗S-腺苷蛋氨酸抗体包括单抗和多抗，或者通过羊或兔抗鼠间接包被S-腺苷蛋氨酸单克隆抗体到微孔板上。
9.利用权利要求7所述蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性测定试剂盒测定样品中蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性的方法，该方法包括如下步骤：
(1)不同浓度标准品的配制：取试剂盒中的S-腺苷蛋氨酸标准品，用缓冲液配制成不同浓度的标准曲线样品；
(2)在包被有蛋白-SAM(或SAM类似物)偶联物或多聚体-SAM(或SAM类似物)偶联物的微孔板中，标准曲线孔中加入配制好的不同浓度梯度的标准品，在待检测样品孔中加入待检测样品；
(3)加入辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗S-腺苷蛋氨酸单克隆抗体，蛋氨酸、三磷酸腺苷、以及待测蛋氨酸腺苷转移酶的样品，混匀后37℃反应60分钟，或者先进行酶促反应20分钟后，再加酶标抗体37℃反应40分钟，洗板；
(4)加入辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的底物，37℃显色15min，加入终止液终止反应，在酶标仪上选择450nm波长读取每孔的吸光度读数OD450；
(5)在同一酶联板中用配制的一系列已知量的SAM标准品，据其OD450与已知标准品浓度获得曲线方程，再将样本OD450代入方程求得其对应的反应产物SAM的生成量；
(6)根据含有MAT的样品在单位时间内催化生成产物SAM的浓度来计算MAT酶活性。
10.根据权利要求5、6或7所述的示踪物，包括酶，荧光素，胶体金，化学发光物质，生物素，地高辛，放射性标记物质和各种类型的乳胶微球。
11.根据权利要求7所述的适当缓冲体系，包括镁离子浓度范围在20-100mM，钾离子浓度范围在50-400mM，Tris盐酸浓度范围在50-200mM，pH范围为7.42-8.5的缓冲系统。
12.蛋氨酸腺苷转移酶生物学活性测定最适宜的缓冲体系，pH为7.42或8.5左右的Tris盐酸缓冲系统，包括镁离子浓度范围50-100mM，钾离子浓度范围50-200mM，Tris浓度范围100-200mM。
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