JPH1132796A - 糖転移酵素活性の測定法 - Google Patents
糖転移酵素活性の測定法Info
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- JPH1132796A JPH1132796A JP19690297A JP19690297A JPH1132796A JP H1132796 A JPH1132796 A JP H1132796A JP 19690297 A JP19690297 A JP 19690297A JP 19690297 A JP19690297 A JP 19690297A JP H1132796 A JPH1132796 A JP H1132796A
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- sugar
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 被検体、標識された糖供与体及び糖受容
体を反応させ、反応混合物を糖受容体の非反応性糖鎖を
認識するレクチン（Ａ）と反応させ、該レクチン（Ａ）
に結合した反応生成物の標識量を測定する被検体中の糖
転移酵素活性の測定法。 【効果】 この方法によれば反応混合物中に存在する種
々の糖類による測定値への影響を受けることなく、高精
度で糖転移酵素活性が測定できる。
体を反応させ、反応混合物を糖受容体の非反応性糖鎖を
認識するレクチン（Ａ）と反応させ、該レクチン（Ａ）
に結合した反応生成物の標識量を測定する被検体中の糖
転移酵素活性の測定法。 【効果】 この方法によれば反応混合物中に存在する種
々の糖類による測定値への影響を受けることなく、高精
度で糖転移酵素活性が測定できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は糖転移酵素活性の測
定法に関し、更に詳しくは血液等の生体試料中の糖転移
酵素活性の正確な測定法に関する。
定法に関し、更に詳しくは血液等の生体試料中の糖転移
酵素活性の正確な測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖転移酵素は、一般に糖供与体から糖受
容体にグリコシル基を転移する反応を触媒する酵素であ
り、生体内でオリゴ糖、多糖、糖蛋白質、糖脂質等の糖
鎖の合成に関与している。近年、糖転移酵素活性の変化
と種々の疾患との関係が明らかになりつつある。例え
ば、α１，２、α１，３及びα１，４フコース転移酵素
活性と癌疾患との関係などが知られている。
容体にグリコシル基を転移する反応を触媒する酵素であ
り、生体内でオリゴ糖、多糖、糖蛋白質、糖脂質等の糖
鎖の合成に関与している。近年、糖転移酵素活性の変化
と種々の疾患との関係が明らかになりつつある。例え
ば、α１，２、α１，３及びα１，４フコース転移酵素
活性と癌疾患との関係などが知られている。
【０００３】かかる糖転移酵素活性の測定法としては、
（１）糖受容体と標識糖供与体との反応生成物を電気泳
動や種々のクロマトグラフィーで分離した後、反応生成
物中の標識量を測定する方法、（２）14Ｃ標識糖ヌクレ
オチドと不溶性オリゴ糖とを反応させ、とりこまれた放
射性同位元素を測定する方法（Arch. Biochem. Biophy
s., 254, 329-341, 1987）、（３）糖供与体と糖受容体
とを反応させ、生成した糖転移アクセプターに対して特
異的に結合する物質を利用して測定する方法（特開昭63
-152998号公報）、（４）不溶性担体等に結合させた糖
受容体と糖供与体とを反応させ、反応生成物を抗体やレ
クチンに結合させて測定する方法（特開平1-260364号公
報、同3-15761号公報）等が知られている。
（１）糖受容体と標識糖供与体との反応生成物を電気泳
動や種々のクロマトグラフィーで分離した後、反応生成
物中の標識量を測定する方法、（２）14Ｃ標識糖ヌクレ
オチドと不溶性オリゴ糖とを反応させ、とりこまれた放
射性同位元素を測定する方法（Arch. Biochem. Biophy
s., 254, 329-341, 1987）、（３）糖供与体と糖受容体
とを反応させ、生成した糖転移アクセプターに対して特
異的に結合する物質を利用して測定する方法（特開昭63
-152998号公報）、（４）不溶性担体等に結合させた糖
受容体と糖供与体とを反応させ、反応生成物を抗体やレ
クチンに結合させて測定する方法（特開平1-260364号公
報、同3-15761号公報）等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記
（１）の方法では、反応生成物と他の成分との分離が困
難であり実用的でなく、また（２）及び（３）の方法
は、いずれも検体中に存在する、反応生成物と部分的に
同じ構造を有する糖類を区別して測定できない、用いる
オリゴ糖が不溶性のものに限られる等の欠点があった。
更に、（４）の方法では、検体中に存在する糖類による
ノイズをある程度は抑制できるものの、未だ定量性は十
分満足できるものではなく、また高価な糖受容体を反応
前に不溶性担体に固定化しておくことは経済的でないこ
と、糖鎖に対する特異的な抗体は入手が困難であること
等の欠点があった。
（１）の方法では、反応生成物と他の成分との分離が困
難であり実用的でなく、また（２）及び（３）の方法
は、いずれも検体中に存在する、反応生成物と部分的に
同じ構造を有する糖類を区別して測定できない、用いる
オリゴ糖が不溶性のものに限られる等の欠点があった。
更に、（４）の方法では、検体中に存在する糖類による
ノイズをある程度は抑制できるものの、未だ定量性は十
分満足できるものではなく、また高価な糖受容体を反応
前に不溶性担体に固定化しておくことは経済的でないこ
と、糖鎖に対する特異的な抗体は入手が困難であること
等の欠点があった。
【０００５】従って、本発明の目的は、目的とする糖受
容体と糖供与体との反応生成物のみを、反応混合物中に
存在する種々の糖類と区別して高精度で定量できる糖転
移酵素活性の測定法を提供することにある。
容体と糖供与体との反応生成物のみを、反応混合物中に
存在する種々の糖類と区別して高精度で定量できる糖転
移酵素活性の測定法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、上記
課題を解決すべく種々検討した結果、被検体と標識され
た糖供与体と糖受容体とを反応させ、その反応混合物
を、糖受容体構造中の反応に関与しない糖鎖を認識する
レクチンとに接触せしめるか、又はこのレクチン及び目
的とする反応によって生じる糖鎖を認識するレクチンの
両者と接触せしめ、このレクチンに結合した物質の標識
量を測定すれば、反応混合物中に存在する種々の糖類、
例えば未反応糖受容体、未反応糖供与体及びそれらの分
解物による測定値への影響を排除でき、目的とする糖転
移酵素の活性のみが高精度で定量できることを見出し、
本発明を完成するに至った。
課題を解決すべく種々検討した結果、被検体と標識され
た糖供与体と糖受容体とを反応させ、その反応混合物
を、糖受容体構造中の反応に関与しない糖鎖を認識する
レクチンとに接触せしめるか、又はこのレクチン及び目
的とする反応によって生じる糖鎖を認識するレクチンの
両者と接触せしめ、このレクチンに結合した物質の標識
量を測定すれば、反応混合物中に存在する種々の糖類、
例えば未反応糖受容体、未反応糖供与体及びそれらの分
解物による測定値への影響を排除でき、目的とする糖転
移酵素の活性のみが高精度で定量できることを見出し、
本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、被検体、標識された
糖供与体及び糖受容体を反応させ、反応混合物を糖受容
体の非反応性糖鎖を認識するレクチン（Ａ）と反応さ
せ、該レクチン（Ａ）に結合した反応生成物の標識量を
測定することを特徴とする被検体中の糖転移酵素活性の
測定法を提供するものである。
糖供与体及び糖受容体を反応させ、反応混合物を糖受容
体の非反応性糖鎖を認識するレクチン（Ａ）と反応さ
せ、該レクチン（Ａ）に結合した反応生成物の標識量を
測定することを特徴とする被検体中の糖転移酵素活性の
測定法を提供するものである。
【０００８】また、本発明は、被検体、標識された糖供
与体及び糖受容体を反応させ、反応混合物を糖受容体の
非反応性糖鎖を認識するレクチン（Ａ）と反応させ、該
レクチン（Ａ）に結合しなかった成分を除去した後、該
レクチン（Ａ）に結合した成分を、糖受容体と糖供与体
との反応によって生じた糖鎖を認識するレクチン（Ｂ）
と反応させ、該レクチン（Ｂ）に結合した反応生成物の
標識量を測定することを特徴とする被検体中の糖転移酵
素活性の測定法を提供するものである。
与体及び糖受容体を反応させ、反応混合物を糖受容体の
非反応性糖鎖を認識するレクチン（Ａ）と反応させ、該
レクチン（Ａ）に結合しなかった成分を除去した後、該
レクチン（Ａ）に結合した成分を、糖受容体と糖供与体
との反応によって生じた糖鎖を認識するレクチン（Ｂ）
と反応させ、該レクチン（Ｂ）に結合した反応生成物の
標識量を測定することを特徴とする被検体中の糖転移酵
素活性の測定法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明は、標識された糖供与体と
糖受容体との反応を被検体中の糖転移酵素の作用によっ
て行い、レクチン（Ａ）、又はレクチン（Ａ）及び
（Ｂ）を用いて、反応混合物中から目的とする反応生成
物のみを選択的に測定するものである。前記のように血
液中には、例えば血液型特異的糖転移酵素、癌の診断に
有用な糖転移酵素等が含有されており、これらの酵素活
性測定の目的で被検体として血清、血漿が用いられる。
かかる糖転移酵素としては例えば、フコース転移酵素、
ガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン転移
酵素、シアル酸転移酵素、マンノース転移酵素、Ｎ−ア
セチルガラクトサミン転移酵素等が挙げられる。ここで
血液型判定糖転移酵素としては、Ｈ物質合成α１，２フ
コース転移酵素、Ａ型物質合成α１，３Ｎ−アセチルガ
ラクトサミン転移酵素、Ｂ型物質合成α１，３ガラクト
ース転移酵素、Ｌｅ型物質合成α１，４フコース転移酵
素、Ｔ型物質合成β１，３ガラクトース転移酵素などが
挙げられる。また、癌診断に有用な糖転移酵素としては
α１，３フコース転移酵素、α２，３シアル酸転移酵
素、α２，６シアル酸転移酵素、α２，８シアル酸転移
酵素、β１，３Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、β
１，４ガラクトース転移酵素、β１，６Ｎ−アセチルグ
ルコサミン転移酵素、β１，３ガラクトース転移酵素な
どが挙げられる。また、肝臓癌、肝硬変、慢性肝炎など
の肝臓疾患診断に有用な糖転移酵素としてα１，６フコ
ース転移酵素が挙げられる。
糖受容体との反応を被検体中の糖転移酵素の作用によっ
て行い、レクチン（Ａ）、又はレクチン（Ａ）及び
（Ｂ）を用いて、反応混合物中から目的とする反応生成
物のみを選択的に測定するものである。前記のように血
液中には、例えば血液型特異的糖転移酵素、癌の診断に
有用な糖転移酵素等が含有されており、これらの酵素活
性測定の目的で被検体として血清、血漿が用いられる。
かかる糖転移酵素としては例えば、フコース転移酵素、
ガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン転移
酵素、シアル酸転移酵素、マンノース転移酵素、Ｎ−ア
セチルガラクトサミン転移酵素等が挙げられる。ここで
血液型判定糖転移酵素としては、Ｈ物質合成α１，２フ
コース転移酵素、Ａ型物質合成α１，３Ｎ−アセチルガ
ラクトサミン転移酵素、Ｂ型物質合成α１，３ガラクト
ース転移酵素、Ｌｅ型物質合成α１，４フコース転移酵
素、Ｔ型物質合成β１，３ガラクトース転移酵素などが
挙げられる。また、癌診断に有用な糖転移酵素としては
α１，３フコース転移酵素、α２，３シアル酸転移酵
素、α２，６シアル酸転移酵素、α２，８シアル酸転移
酵素、β１，３Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、β
１，４ガラクトース転移酵素、β１，６Ｎ−アセチルグ
ルコサミン転移酵素、β１，３ガラクトース転移酵素な
どが挙げられる。また、肝臓癌、肝硬変、慢性肝炎など
の肝臓疾患診断に有用な糖転移酵素としてα１，６フコ
ース転移酵素が挙げられる。
【００１０】本発明に用いられる標識された糖供与体と
糖受容体は、前記の測定しようとする糖転移酵素に応じ
て適宜選択すればよい。ここで標識された糖供与体とし
ては、標識された供与すべき糖を含む糖ヌクレオチドが
好ましく、例えばＧＤＰ−フコース、ＧＤＰ−マンノー
ス、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ−Ｎ
−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−ガラクトース、ＣＭ
Ｐ−Ｎ−アセチルノイラミン酸等が挙げられる。ここで
標識は、3Ｈ、14Ｃなどの放射性同位元素が好ましい。
糖受容体は、前記の測定しようとする糖転移酵素に応じ
て適宜選択すればよい。ここで標識された糖供与体とし
ては、標識された供与すべき糖を含む糖ヌクレオチドが
好ましく、例えばＧＤＰ−フコース、ＧＤＰ−マンノー
ス、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＵＤＰ−Ｎ
−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−ガラクトース、ＣＭ
Ｐ−Ｎ−アセチルノイラミン酸等が挙げられる。ここで
標識は、3Ｈ、14Ｃなどの放射性同位元素が好ましい。
【００１１】糖受容体としては、オリゴ糖、糖脂質、糖
蛋白等が挙げられる。具体的にはＮ−アセチルラクトサ
ミン（Galβ1,4GlcNAc）、ラクトース（Galβ1,4Gl
c）、ルイスｃ（Galβ1,3GlcNAc）、Ｈ抗原タイプＩ鎖
（Fucα1,2Galβ1,3GlcNAc）、Ｈ抗原タイプII鎖（Fuc
α1,2Galβ1,4GlcNAc）、Ｎ−アセチルガラクトサミン
（GalNAc）、Ｔ型抗原（Galβ1,3GalNAc）、ルイスａ
（Galβ1,3[Fucα1,4]GlcNAc）、ルイスＸ（Galβ1,4[F
ucα1,3]GlcNAc）、
蛋白等が挙げられる。具体的にはＮ−アセチルラクトサ
ミン（Galβ1,4GlcNAc）、ラクトース（Galβ1,4Gl
c）、ルイスｃ（Galβ1,3GlcNAc）、Ｈ抗原タイプＩ鎖
（Fucα1,2Galβ1,3GlcNAc）、Ｈ抗原タイプII鎖（Fuc
α1,2Galβ1,4GlcNAc）、Ｎ−アセチルガラクトサミン
（GalNAc）、Ｔ型抗原（Galβ1,3GalNAc）、ルイスａ
（Galβ1,3[Fucα1,4]GlcNAc）、ルイスＸ（Galβ1,4[F
ucα1,3]GlcNAc）、
【００１２】
【化３】
【００１３】等が挙げられる。
【００１４】被検体と標識された糖供与体と糖受容体と
の反応は、通常の酵素反応条件、例えば室温から３７
℃、１〜１２時間程度行えばよい。
の反応は、通常の酵素反応条件、例えば室温から３７
℃、１〜１２時間程度行えばよい。
【００１５】これらの標識された糖供与体と糖受容体に
前記酵素を作用させた反応生成物の例としては、Ａ型抗
原（GalNAcα1,3[Fucα1,2]Gal）、Ｂ型抗原（Galα1,3
[Fucα1,2]Gal）、ルイスａ型抗原（Galβ1,3[Fucα1,
4]GlcNAc）、ルイスｂ型抗原（Fucα1,2Galβ1,3[Fucα
1,4]GlcNAc）、ルイスＸ（Galβ1,4[Fucα1,3]GlcNA
c）、ルイスＹ（Fucα1,2Galβ1,4[Fucα1,3]GlcNA
c）、シアリル・ルイスＸ（NeuAcα2,3Galβ1,4[Fucα
1,3]GlcNAc）、シアリル・ルイスａ（NeuAcα2,3Galβ
1,3[Fucα1,4]GlcNAc）、シアリルＴｎ抗原（NeuAcα2,
6GalNAcα）、Ｔ型抗原（Galβ1,3GalNAc）、シアリル
Ｔ型抗原（NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAc）、Galβ1,3[Glc
NAcβ1,6]GalNAc、GlcNAcβ1,6GalNAc、
前記酵素を作用させた反応生成物の例としては、Ａ型抗
原（GalNAcα1,3[Fucα1,2]Gal）、Ｂ型抗原（Galα1,3
[Fucα1,2]Gal）、ルイスａ型抗原（Galβ1,3[Fucα1,
4]GlcNAc）、ルイスｂ型抗原（Fucα1,2Galβ1,3[Fucα
1,4]GlcNAc）、ルイスＸ（Galβ1,4[Fucα1,3]GlcNA
c）、ルイスＹ（Fucα1,2Galβ1,4[Fucα1,3]GlcNA
c）、シアリル・ルイスＸ（NeuAcα2,3Galβ1,4[Fucα
1,3]GlcNAc）、シアリル・ルイスａ（NeuAcα2,3Galβ
1,3[Fucα1,4]GlcNAc）、シアリルＴｎ抗原（NeuAcα2,
6GalNAcα）、Ｔ型抗原（Galβ1,3GalNAc）、シアリル
Ｔ型抗原（NeuAcα2,3Galβ1,3GalNAc）、Galβ1,3[Glc
NAcβ1,6]GalNAc、GlcNAcβ1,6GalNAc、
【００１６】
【化４】
【００１７】等が挙げられる。
【００１８】本発明における上記反応終了後の反応混合
物中には、上記の目的とする反応生成物の他に、未反応
の標識糖供与体、未反応の糖受容体、標識糖供与体分解
物、糖受容体分解物等が含まれている。これらの測定結
果に悪影響を及ぼす可能性のある成分を除去する目的
で、反応混合物を、糖受容体の非反応性糖鎖を認識する
レクチン（Ａ）と反応させる。このレクチン（Ａ）と結
合し得る成分としては、上記成分のうち未反応の糖受容
体と糖受容体分解物があるが、これらは標識物質を含ま
ないので、測定結果には影響しない。従って、レクチン
（Ａ）に結合しなかった成分を洗浄等により除去した
後、レクチン（Ａ）に結合した成分の標識量を定量すれ
ば、正確に目的とする糖転移酵素活性が測定できる。
物中には、上記の目的とする反応生成物の他に、未反応
の標識糖供与体、未反応の糖受容体、標識糖供与体分解
物、糖受容体分解物等が含まれている。これらの測定結
果に悪影響を及ぼす可能性のある成分を除去する目的
で、反応混合物を、糖受容体の非反応性糖鎖を認識する
レクチン（Ａ）と反応させる。このレクチン（Ａ）と結
合し得る成分としては、上記成分のうち未反応の糖受容
体と糖受容体分解物があるが、これらは標識物質を含ま
ないので、測定結果には影響しない。従って、レクチン
（Ａ）に結合しなかった成分を洗浄等により除去した
後、レクチン（Ａ）に結合した成分の標識量を定量すれ
ば、正確に目的とする糖転移酵素活性が測定できる。
【００１９】また、反応混合物と上記レクチン（Ａ）を
反応させ、該レクチン（Ａ）に結合しなかった成分を除
去した後、該レクチン（Ａ）に結合した成分を、糖受容
体と糖供与体との反応によって生じた糖鎖を認識するレ
クチン（Ｂ）と反応させ、該レクチン（Ｂ）に結合した
反応生成物の標識量を測定すれば、更に本発明の測定値
の精度は向上する。
反応させ、該レクチン（Ａ）に結合しなかった成分を除
去した後、該レクチン（Ａ）に結合した成分を、糖受容
体と糖供与体との反応によって生じた糖鎖を認識するレ
クチン（Ｂ）と反応させ、該レクチン（Ｂ）に結合した
反応生成物の標識量を測定すれば、更に本発明の測定値
の精度は向上する。
【００２０】ここで、糖受容体の非反応性糖鎖を認識す
るレクチン（Ａ）としては、反応部位と異なる部位を認
識するレクチンであればよく、例えば式（１）の糖受容
体を用いた場合は、（GlcNAcβ1,2Man）2 構造を認識す
るレクチン、例えばムジナタケレクチン（PVL）等が挙
げられる。
るレクチン（Ａ）としては、反応部位と異なる部位を認
識するレクチンであればよく、例えば式（１）の糖受容
体を用いた場合は、（GlcNAcβ1,2Man）2 構造を認識す
るレクチン、例えばムジナタケレクチン（PVL）等が挙
げられる。
【００２１】一方、糖受容体と糖供与体との反応によっ
て生じた糖鎖を認識するレクチン（Ｂ）は、糖受容体と
糖供与体とが被検対象糖転移酵素の作用により生じた糖
鎖構造を認識するレクチンであり、例えば式（１）の糖
受容体と標識フコースヌクレオチドを用いてα１，６フ
コース転移酵素を測定しようとする場合のレクチン
（Ｂ）は、Fucα1,6GlcNAc 構造を認識するレクチンで
あり、特にヒイロチャワンタケレクチン（AAL）が好ま
しい。
て生じた糖鎖を認識するレクチン（Ｂ）は、糖受容体と
糖供与体とが被検対象糖転移酵素の作用により生じた糖
鎖構造を認識するレクチンであり、例えば式（１）の糖
受容体と標識フコースヌクレオチドを用いてα１，６フ
コース転移酵素を測定しようとする場合のレクチン
（Ｂ）は、Fucα1,6GlcNAc 構造を認識するレクチンで
あり、特にヒイロチャワンタケレクチン（AAL）が好ま
しい。
【００２２】これらのレクチン（Ａ）及びレクチン
（Ｂ）は、それぞれ不溶性担体に固定化して用いるのが
好ましい。かかる不溶性担体としては、アガロース、ア
クリルアミド、セルロース等が挙げられる。担体の形状
としては、粒子、球、容器の型等が使用できる。これら
のレクチン（Ａ）固定化担体及びレクチン（Ｂ）固定化
担体は、それぞれこれらの固定化担体を充填したカラム
の形態にして用いるのがより好ましい。
（Ｂ）は、それぞれ不溶性担体に固定化して用いるのが
好ましい。かかる不溶性担体としては、アガロース、ア
クリルアミド、セルロース等が挙げられる。担体の形状
としては、粒子、球、容器の型等が使用できる。これら
のレクチン（Ａ）固定化担体及びレクチン（Ｂ）固定化
担体は、それぞれこれらの固定化担体を充填したカラム
の形態にして用いるのがより好ましい。
【００２３】レクチン（Ａ）固定化カラムを用いた場合
の反応は、例えば反応混合物をレクチン（Ａ）固定化カ
ラムにかけ、該レクチン（Ａ）に結合しなかった成分を
洗浄して除去した後、カラムから結合した成分を溶出さ
せ、溶出液中の標識量を測定すればよい。またレクチン
（Ａ）固定化カラムとレクチン（Ｂ）固定化カラムを用
いた場合の反応は、例えば反応混合物をレクチン（Ａ）
固定化カラムにかけ、該レクチン（Ａ）に結合しなかっ
た成分を洗浄して除去し、該カラムから結合した成分を
溶出させ、次いでレクチン（Ｂ）固定化カラムにかけ、
該レクチン（Ｂ）に結合しなかった成分を洗浄して除去
し、該カラムから結合した成分を溶出させ、得られた溶
出液中の標識量を測定すればよい。
の反応は、例えば反応混合物をレクチン（Ａ）固定化カ
ラムにかけ、該レクチン（Ａ）に結合しなかった成分を
洗浄して除去した後、カラムから結合した成分を溶出さ
せ、溶出液中の標識量を測定すればよい。またレクチン
（Ａ）固定化カラムとレクチン（Ｂ）固定化カラムを用
いた場合の反応は、例えば反応混合物をレクチン（Ａ）
固定化カラムにかけ、該レクチン（Ａ）に結合しなかっ
た成分を洗浄して除去し、該カラムから結合した成分を
溶出させ、次いでレクチン（Ｂ）固定化カラムにかけ、
該レクチン（Ｂ）に結合しなかった成分を洗浄して除去
し、該カラムから結合した成分を溶出させ、得られた溶
出液中の標識量を測定すればよい。
【００２４】本発明方法においては、標識糖供与体とし
て標識フコースヌクレオチドを、糖受容体として式
（１）の２本鎖オリゴ糖を、レクチン（Ａ）として（Gl
cNAcβ1,2Man）2 構造を認識するレクチンを、所望によ
りレクチン（Ｂ）としてFucα1,6GlcNAc 構造を認識す
るレクチンを用いるα１，６フコース転移酵素活性の測
定法が特に好ましい。
て標識フコースヌクレオチドを、糖受容体として式
（１）の２本鎖オリゴ糖を、レクチン（Ａ）として（Gl
cNAcβ1,2Man）2 構造を認識するレクチンを、所望によ
りレクチン（Ｂ）としてFucα1,6GlcNAc 構造を認識す
るレクチンを用いるα１，６フコース転移酵素活性の測
定法が特に好ましい。
【００２５】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
【００２６】実施例１ 次の手順により、健常者２３名の血漿中のα１，６フコ
ース転移酵素活性を測定した。 （１）酵素受容体の調製 卵黄から大量分離・精製された下記式で表されるジシア
リシル２本鎖１１糖オリゴ糖（YDS；Koketsu, M., June
ja, LR, Kim, M., Ohta, M., Matsuura, F. and Yamamo
to, T. Sialyloligosaccharides of delipidated egg y
olk fraction,J. Food Sci., 58(4)：743-747, 1993）
を原料として用いた。
ース転移酵素活性を測定した。 （１）酵素受容体の調製 卵黄から大量分離・精製された下記式で表されるジシア
リシル２本鎖１１糖オリゴ糖（YDS；Koketsu, M., June
ja, LR, Kim, M., Ohta, M., Matsuura, F. and Yamamo
to, T. Sialyloligosaccharides of delipidated egg y
olk fraction,J. Food Sci., 58(4)：743-747, 1993）
を原料として用いた。
【００２７】
【化５】
【００２８】このＹＤＳ（２０mg）及びArthrobactor u
reafaciens（ナカライテスク）のシアリダーゼ０．２Ｕ
を０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー４００μｌ中で３
７℃４８時間作用させて、下記式で表されるAsialo-YDS
を得た。
reafaciens（ナカライテスク）のシアリダーゼ０．２Ｕ
を０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー４００μｌ中で３
７℃４８時間作用させて、下記式で表されるAsialo-YDS
を得た。
【００２９】
【化６】
【００３０】得られたAsialo-YDSを分離することなく、
蒸留水で２倍に希釈した（８００μｌ）この液とStrept
ococcus 6646K（生化学工業）のβガラクトシダーゼ５
ｍＵを０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（pH６．
０）１．６ml中で、３７℃４８時間作用させて、
蒸留水で２倍に希釈した（８００μｌ）この液とStrept
ococcus 6646K（生化学工業）のβガラクトシダーゼ５
ｍＵを０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（pH６．
０）１．６ml中で、３７℃４８時間作用させて、
【００３１】
【化７】
【００３２】を得た。このオリゴ糖は、HiLoad Superde
x pg（ファルマシア）及びSuperdex Peptide HR（ファ
ルマシア）によるゲルろ過で分離、精製した。
x pg（ファルマシア）及びSuperdex Peptide HR（ファ
ルマシア）によるゲルろ過で分離、精製した。
【００３３】（２）レクチン固定化ゲルの作成 ムジナタケレクチン（PVL）を精製し、保護基となるハ
プテン（GlcNAc）を加えたのち、バイオラッドのマニュ
アルに従い、Affi-Gel 10（バイオラッド）に固定し
た。一方、ヒイロチャワンタケレクチン（AAL）を精製
し、保護基となるハプテン（Fuc）を加えたのち、バイ
オラッドのマニュアルに従い、Affi-Gel 10（バイオラ
ッド）に固定した。
プテン（GlcNAc）を加えたのち、バイオラッドのマニュ
アルに従い、Affi-Gel 10（バイオラッド）に固定し
た。一方、ヒイロチャワンタケレクチン（AAL）を精製
し、保護基となるハプテン（Fuc）を加えたのち、バイ
オラッドのマニュアルに従い、Affi-Gel 10（バイオラ
ッド）に固定した。
【００３４】（３）酵素反応 酵素反応液組成：HEPES-NaOH, pH7.0 ４μmol、（１）
で調製したASAG-YDS ２０nmol、GDP-[3H]フコース１０n
mol及び被検血漿２０μｌをとり、全量５０μｌとし
た。この反応液を３７℃、４時間保温して、エタノール
を等量加えて反応を止めた。
で調製したASAG-YDS ２０nmol、GDP-[3H]フコース１０n
mol及び被検血漿２０μｌをとり、全量５０μｌとし
た。この反応液を３７℃、４時間保温して、エタノール
を等量加えて反応を止めた。
【００３５】（４）活性の測定 （３）の反応液の遠心上清を５mlのPVL-Affi-Gel １０
を充填したカラムにかける。なお、カラムは予め、５Ｍ
CaCl2 を含む０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．
０）生理食塩水（Ca-TBS）で平衡化しておく。次に、室
温で３０分放置、洗浄液Ca-TBS １５mlで洗浄する。次
に、GlcNAc５０mMを含むCa-TBS３mlを流す。更に、GlcN
Ac５０mMを含むCa-TBS７mlを加えて、その溶出液を集め
る。溶出液は直ちにAAL-Affi-Gel １０を充填したカラ
ムにかける。なお、カラムは予め、０．０１Ｍリン酸緩
衝液（pH７．０）生理食塩水（PBS）で平衡化してお
く。カラムをPBS １５mlで洗浄する。次に、Fuc ２０mM
を含むPBS ３mlを流す。更に、Fuc ２０mMを含むPBS ７
mlを加えて、その溶出液を集め、シンチレーターを加え
た後、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測
定する。
を充填したカラムにかける。なお、カラムは予め、５Ｍ
CaCl2 を含む０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．
０）生理食塩水（Ca-TBS）で平衡化しておく。次に、室
温で３０分放置、洗浄液Ca-TBS １５mlで洗浄する。次
に、GlcNAc５０mMを含むCa-TBS３mlを流す。更に、GlcN
Ac５０mMを含むCa-TBS７mlを加えて、その溶出液を集め
る。溶出液は直ちにAAL-Affi-Gel １０を充填したカラ
ムにかける。なお、カラムは予め、０．０１Ｍリン酸緩
衝液（pH７．０）生理食塩水（PBS）で平衡化してお
く。カラムをPBS １５mlで洗浄する。次に、Fuc ２０mM
を含むPBS ３mlを流す。更に、Fuc ２０mMを含むPBS ７
mlを加えて、その溶出液を集め、シンチレーターを加え
た後、液体シンチレーションカウンターで放射活性を測
定する。
【００３６】（５）測定結果 （ｉ）上記（４）において、PVL-Affi-Gel １０を充填
したカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーの
結果を図１に示す。図１中、黒丸は糖受容体を加えた場
合を、黒四角は糖受容体を加えなかった場合を示す。図
１の結果から明らかなように、フコシル化糖受容体がPV
L 固定化カラムに選択的に結合し、GluNAcで特異的に溶
出されていることがわかる。 （ii）上記（４）において、AAL-Affi-Gel １０を充填
したカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーの
結果を図２に示す。図から明らかなように、PVL溶出分
画は全てAAL 固定化カラムに結合し、Fuc で特異的に溶
出された。このことから、PVL-Affi-Gel １０を充填し
たカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーのみ
で、正確に測定できることがわかる。 （iii）健常者２３名の結果を表１に示す。酵素活性は
単位時間（ｈ）、血漿１ml当たり基質（ASAG-YDS）に取
り込まれたフコース量（pmole）として計算した。
したカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーの
結果を図１に示す。図１中、黒丸は糖受容体を加えた場
合を、黒四角は糖受容体を加えなかった場合を示す。図
１の結果から明らかなように、フコシル化糖受容体がPV
L 固定化カラムに選択的に結合し、GluNAcで特異的に溶
出されていることがわかる。 （ii）上記（４）において、AAL-Affi-Gel １０を充填
したカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーの
結果を図２に示す。図から明らかなように、PVL溶出分
画は全てAAL 固定化カラムに結合し、Fuc で特異的に溶
出された。このことから、PVL-Affi-Gel １０を充填し
たカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーのみ
で、正確に測定できることがわかる。 （iii）健常者２３名の結果を表１に示す。酵素活性は
単位時間（ｈ）、血漿１ml当たり基質（ASAG-YDS）に取
り込まれたフコース量（pmole）として計算した。
【００３７】
【表１】
【００３８】また、上記（４）においてPVL-Affi-Gel
１０を充填したカラムの溶出液の標識量を測定したとこ
ろ、表１とほぼ同様の結果が得られた。
１０を充填したカラムの溶出液の標識量を測定したとこ
ろ、表１とほぼ同様の結果が得られた。
【００３９】実施例２ 実施例１と同様にして、肝臓癌（n=18）、肝硬変（n=1
3）、慢性肝炎（n=10）患者血漿中のα１，６フコース
転移酵素活性を測定した。
3）、慢性肝炎（n=10）患者血漿中のα１，６フコース
転移酵素活性を測定した。
【００４０】
【表２】
【００４１】その結果、表１及び表２から明らかなよう
に、血漿中のα１，６フコース転移酵素活性と肝臓疾患
との間には明らかな相関関係が認められ、α１，６フコ
ース転移酵素活性の測定が肝臓疾患の診断法として有用
であることが判明した。
に、血漿中のα１，６フコース転移酵素活性と肝臓疾患
との間には明らかな相関関係が認められ、α１，６フコ
ース転移酵素活性の測定が肝臓疾患の診断法として有用
であることが判明した。
【００４２】
【発明の効果】本発明方法によれば反応混合物中に存在
する種々の糖類による測定値への影響を受けることな
く、高精度で糖転移酵素活性が測定できる。
する種々の糖類による測定値への影響を受けることな
く、高精度で糖転移酵素活性が測定できる。
【図１】PVL-Affi-Gel １０充填カラムを用いたアフィ
ニティクロマトグラフィーの結果を示す図である。
ニティクロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図２】AAL-Affi-Gel １０充填カラムを用いたアフィ
ニティクロマトグラフィーの結果を示す図である。
ニティクロマトグラフィーの結果を示す図である。
Claims (8)
- 【請求項１】 被検体、標識された糖供与体及び糖受容
体を反応させ、反応混合物を糖受容体の非反応性糖鎖を
認識するレクチン（Ａ）と反応させ、該レクチン（Ａ）
に結合した反応生成物の標識量を測定することを特徴と
する被検体中の糖転移酵素活性の測定法。 - 【請求項２】 糖受容体の非反応性糖鎖を認識するレク
チン（Ａ）が、不溶性担体に固定化されたものである請
求項１記載の測定法。 - 【請求項３】 被検体、標識された糖供与体及び糖受容
体を反応させ、反応混合物を糖受容体の非反応性糖鎖を
認識するレクチン（Ａ）と反応させ、該レクチン（Ａ）
に結合しなかった成分を除去した後、該レクチン（Ａ）
に結合した成分を糖受容体と糖供与体との反応によって
生じた糖鎖を認識するレクチン（Ｂ）と反応させ、該レ
クチン（Ｂ）に結合した反応生成物の標識量を測定する
ことを特徴とする被検体中の糖転移酵素活性の測定法。 - 【請求項４】 糖受容体の非反応性糖鎖を認識するレク
チン（Ａ）及び糖受容体と糖供与体との反応によって生
じた糖鎖を認識するレクチン（Ｂ）が、それぞれ不溶性
担体に固定化されたものである請求項３記載の測定法。 - 【請求項５】 被検体、標識フコースヌクレオチド及び
式（１） 【化１】 で表される２本鎖オリゴ糖を反応させ、反応混合物を、
（GlcNAcβ1,2Man）2 構造を認識するレクチン（Ａ１）
と反応させ、該レクチン（Ａ１）に結合した反応生成物
の標識量を測定することを特徴とする被検体中のα１，
６フコース転移酵素活性の測定法。 - 【請求項６】 （GlcNAcβ1,2Man）2 構造を認識するレ
クチン（Ａ１）が、不溶性担体に固定化されたものであ
る請求項５記載の測定法。 - 【請求項７】 被検体、標識フコースヌクレオチド及び
式（１） 【化２】 で表される２本鎖オリゴ糖を反応させ、反応混合物を、
（GlcNAcβ1,2Man）2 構造を認識するレクチン（Ａ１）
と反応させ、該レクチン（Ａ１）に結合しなかった成分
を除去した後、該レクチン（Ａ１）に結合した成分をFu
cα1,6GlcNAc 構造を認識するレクチン（Ｂ１）と反応
させ、該レクチン（Ｂ１）に結合した反応生成物の標識
量を測定することを特徴とする被検体中のα１，６フコ
ース転移酵素活性の測定法。 - 【請求項８】 （GlcNAcβ1,2Man）2 構造を認識するレ
クチン（Ａ１）及びFucα1,6GlcNAc 構造を認識するレ
クチン（Ｂ１）が、それぞれ不溶性担体に固定化された
ものである請求項７記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19690297A JPH1132796A (ja) | 1997-07-23 | 1997-07-23 | 糖転移酵素活性の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19690297A JPH1132796A (ja) | 1997-07-23 | 1997-07-23 | 糖転移酵素活性の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1132796A true JPH1132796A (ja) | 1999-02-09 |
Family
ID=16365555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19690297A Pending JPH1132796A (ja) | 1997-07-23 | 1997-07-23 | 糖転移酵素活性の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1132796A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007333132A (ja) * | 2006-06-16 | 2007-12-27 | Kokusan Buhin Kogyo Kk | メタルガスケット |
| CN101838833A (zh) * | 2009-03-17 | 2010-09-22 | 诺沃皮尼奥内有限公司 | 生产涡轮机构件用防护涂层的方法、该构件及相应的机器 |
| JP2018536873A (ja) * | 2015-11-07 | 2018-12-13 | フーナン スカイワールド バイオテクノロジーズ コンパニー | メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（ｍａｔ）の生物活性測定の方法及び試薬キット |
-
1997
- 1997-07-23 JP JP19690297A patent/JPH1132796A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007333132A (ja) * | 2006-06-16 | 2007-12-27 | Kokusan Buhin Kogyo Kk | メタルガスケット |
| CN101838833A (zh) * | 2009-03-17 | 2010-09-22 | 诺沃皮尼奥内有限公司 | 生产涡轮机构件用防护涂层的方法、该构件及相应的机器 |
| JP2018536873A (ja) * | 2015-11-07 | 2018-12-13 | フーナン スカイワールド バイオテクノロジーズ コンパニー | メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（ｍａｔ）の生物活性測定の方法及び試薬キット |
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