JP4150797B2

JP4150797B2 - プロテインキナーゼ活性の測定方法

Info

Publication number: JP4150797B2
Application number: JP2006306615A
Authority: JP
Inventors: 栄一民谷; ケルマンカーン
Original assignee: Japan Advanced Institute of Science and Technology
Current assignee: Japan Advanced Institute of Science and Technology
Priority date: 2006-11-13
Filing date: 2006-11-13
Publication date: 2008-09-17
Anticipated expiration: 2026-11-13
Also published as: JP2008122239A

Description

本発明は、電気化学測定を利用したプロテインキナーゼ活性の測定方法に関する。

生体内で起きる様々な生命現象は、タンパク質リン酸化反応により巧妙に制御されている。したがって生命現象の仕組みを理解するためには、そのカギを握る５００種類以上のプロテインキナーゼ群あるいはその阻害剤、さらにはその活性化剤のそれぞれの活性を効率的に測定する手法の開発が非常に重要な意味を持つ。プロテインキナーゼの中でもチロシン残基のリン酸化に関与するチロシンキナーゼは、これまで５０種以上が同定されており、色々な情報伝達系、例えば成長因子やホルモン、Ｔ細胞やＢ細胞の活性化等の最初のステップに関与している。また、チロシンキナーゼの活性や発現量に影響するような変異やウイルス型チロシンキナーゼの発現が、細胞のがん化に関係していることが立証されている。したがって、チロシンキナーゼ等の活性の測定は特に重要と言える。

チロシンキナーゼ等のプロテインキナーゼ活性及びその阻害活性、活性化剤の測定方法としては例えば^３２Ｐで標識されたＡＴＰを酵素反応時に用い、オートラジオグラフィーにより放射性標識を測定する方法が知られており、良好な感度を得ることができる。しかしながら、前記測定方法には取扱いに大きな制約のある放射性同位体を用いなければならないという欠点がある。

そこで、ＥＬＩＳＡの原理を利用する方法も知られている。例えば特許文献１においては、リン酸化された基質に特異的に結合する抗体を用いて特異的に反応させ、酵素標識二次抗体を用い、吸光度測定により活性を測定する方法が開示されている（例えば、特許文献１等参照）。
特開平７−２５８２９６号公報

しかしながら、特許文献１に記載される方法のように吸光度測定等を利用する場合、光学系が必要であるため検出装置が大型化、複雑化する等の問題がある。また、酵素反応により発色させるため、測定操作が煩雑で測定に長時間を要するという問題も有している。

本発明はこのような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、例えばチロシンキナーゼ等のプロテインキナーゼの活性を小型の検出装置にて迅速、簡便且つ高感度に測定可能なプロテインキナーゼ活性の測定方法を提供することを目的とする。

ところで、チロシンキナーゼが反応する基質に含まれているチロシン等のように、電気化学的に酸化されるアミノ酸が存在することが知られている。本発明者は、チロシンキナーゼの基質に含まれるチロシンの電気化学酸化シグナルがリン酸化により消失することを見出し、これを利用してプロテインキナーゼ活性を測定可能であることを明らかにした。

本発明はこのような知見に基づき完成されたものである。すなわち、本発明に係るプロテインキナーゼ活性の測定方法は、電気化学的に酸化又は還元されるとともに、前記酸化又は還元に伴う電流がリン酸化によって消失するアミノ酸を含む基質と、前記基質中の前記アミノ酸にリン酸基供与体のリン酸基を付加するプロテインキナーゼとを接触させた後、前記基質を電極の表面に集めた状態で酸化電流値又は還元電流値を測定することを特徴とする。

以上のようなプロテインキナーゼ活性の測定方法においては、例えば、電気化学的に酸化されるアミノ酸がプロテインキナーゼの作用を受けてリン酸化されると、そのアミノ酸を電気化学的に酸化して得られる酸化電流値が基質のリン酸化の程度に応じて減少するので、これを指標としてプロテインキナーゼ活性測定が実現される。また、電気化学的に還元されるアミノ酸がプロテインキナーゼの作用を受けてリン酸化されると、そのアミノ酸を電気化学的に還元して得られる還元電流値が基質のリン酸化に応じて減少するので、これを指標としてプロテインキナーゼ活性測定が実現される。

本発明によれば、従来のオートラジオグラフィーやＥＬＩＳＡのような複雑な操作を必要とせず、電気化学的に簡便にプロテインキナーゼ活性を測定することができる。また、本発明によれば、例えばＥＬＩＳＡの検出工程において用いられるような大型の測定機器を必要とすることなく、小型の電気化学測定装置を用いて、プロテインキナーゼの活性の高感度且つ正確な測定を実現することができる。さらに、本発明によれば、これらの活性測定に要する時間も大幅に短縮することができる。

以下、本発明に係るプロテインキナーゼ活性の測定方法について、図面を参照しながら詳細に説明する。

本発明においては、先ず、電気化学的に酸化又は還元されるアミノ酸を構成成分として含む基質と、リン酸基供与体と、基質中のアミノ酸にリン酸基を付加するプロテインキナーゼと、リン酸基供与体とを所定時間例えば反応溶液中で接触させ、反応させる。これにより、プロテインキナーゼの作用を受けて基質中の特定のアミノ酸がリン酸化される。

ここで、電気化学的に酸化又は還元されるアミノ酸とは、具体的には電気化学的に酸化されたときに酸化電流が観察されるアミノ酸、又は電気化学的に還元されたときに還元電流が観察されるアミノ酸のことを言う。それとともに、電気化学的に酸化又は還元されるアミノ酸は、前記還元又は酸化に伴う電流がリン酸化によって消失するものでなければならない。このような条件を満たすアミノ酸としては、例えば、電気化学的酸化に伴う酸化電流が観察されるアミノ酸であるチロシン、チロシンアナログ等が挙げられる。

プロテインキナーゼとしては、基質中の電気化学的に活性なアミノ酸にリン酸基を付加することが可能なプロテインキナーゼを用いることができ、具体的には、チロシンキナーゼを用いることができる。

リン酸基供与体としては、分子中にリン酸基を含み、そのリン酸基が前記プロテインキナーゼの作用により前記アミノ酸に転移可能な分子であれば制限無く用いることができ、例えばＡＴＰ、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）、ＩＴＰ（イノシン三リン酸）等が挙げられる。

酵素反応は、反応溶液に基質を分散させた状態、任意の担体に基質を固定化した状態のいずれで行ってもよい。なお、後述する測定工程で用いられる電極の表面に基質を固定化した状態で酵素反応を行うことも可能であるが、この場合、反応溶液中に含まれるプロテインキナーゼが電極の表面に非特異的に吸着し、プロテインキナーゼの構成成分として含まれるチロシン等によりノイズを生じるおそれがある。

担体としては、磁気ビーズ、樹脂ビーズ等のビーズ担体、電極等、任意の担体を使用可能であるが、分離及び洗浄を確実に行うことができることから、ビーズ担体の使用が好ましい。特に磁気ビーズは、反応溶液からの収集及び電極表面へ集める作業を迅速且つ確実に行うことができる。

反応終了後、基質を電極の表面に集めた状態で電気化学測定を行う。電極の表面に基質を集めた状態で電気化学測定を行うことで、基質中の電気化学的に酸化又は還元されるアミノ酸残基と電極との間での電子授受を確実に行うことができ、また、反応後の基質が電極表面に濃縮されるので、より高感度な測定が実現される。

基質を電極の表面に集めた状態とするには、例えば基質を固定化したビーズ担体を用いる場合、酵素反応終了後の反応溶液からビーズ担体を捕集し洗浄した後、ビーズ担体を懸濁した溶液を電極表面に滴下し、ビーズ担体を沈殿させることにより実現される。また、より確実にビーズ担体を電極の表面に近づけて測定感度を高めるために、ビーズ担体を懸濁した溶液を電極表面に滴下し、乾燥させ、物理的に吸着させてもよい。さらに、ビーズ担体として磁気ビーズを用いる場合、電極の裏面に磁石を置いた状態とし、磁石の磁気吸着力を利用して磁気ビーズを電極表面に吸着させることで、測定感度をより一層高めることができる。

前記の状態で電気化学測定を行う。例えばチロシン等のアミノ酸を電気化学的に酸化する際に生じる電流値を測定する。この場合、アミノ酸残基のリン酸化の程度に応じて酸化電流値が減少する傾向を示すので、これを指標としてプロテインキナーゼ活性の測定が実現される。一方、アミノ酸の電気化学的還元に伴う還元電流値を指標としてプロテインキナーゼ活性測定を行うこともできる。

電気化学測定としては、例えば、微分パルスボルタンメトリー、サイクリックボルタンメトリー等のボルタンメトリー、アンペロメトリー、クロノメトリー等が挙げられる。

以下、本発明のプロテインキナーゼ活性の測定方法の一実施形態として、磁気ビーズに基質ペプチドを固定化し、チロシン残基の酸化電流値を測定することにより、チロシンキナーゼ活性を測定する方法について、図１を参照しながら説明する。

先ず、チロシン残基Ｙを含む基質ペプチド１を固定化した磁気ビーズ２を用意する。次に、磁気ビーズ２に固定化された基質ペプチド１と、チロシンキナーゼと、ＡＴＰとを含む反応溶液を所定時間インキュベートする。チロシンキナーゼが有る場合には、図１上段に示すように、チロシンキナーゼ活性の強さに応じて基質ペプチド１に含まれるチロシン残基Ｙがリン酸化される。一方、基質ペプチド１に対するチロシンキナーゼが含まれていない場合や、チロシンキナーゼ活性が阻害されている場合等には、図１下段に示すように、基質ペプチド１に含まれるチロシン残基Ｙはリン酸化を受けない。

反応後、磁気ビーズ２を反応溶液から分離し、洗浄した後、電極３の表面に集める。この状態で電気化学測定を行う。電気化学測定を行う際には、例えば作用極の電位を正方向に変化させていき、電位変化に伴う電流変化を測定する。電極電位を正方向に変化させていくと、基質ペプチド１に含まれるチロシン残基Ｙが電気化学的に酸化されることによる酸化電流ピークが観察されるので、これを測定する。阻害剤の存在によりチロシンキナーゼ活性が阻害されていたり、基質ペプチド１に対するチロシンキナーゼが含まれていない場合等、反応溶液に含まれるチロシンキナーゼ活性が弱い場合には、図１（ｂ）に示すようにチロシン残基Ｙがリン酸化されないので、チロシン残基Ｙの酸化電流ピークが観察される。一方、図１（ａ）に示すようにチロシンキナーゼによりチロシン残基Ｙがリン酸化されると、チロシン残基Ｙの酸化電流ピークが消失する。

図２は、チロシンのみを含む溶液とリン酸化したチロシンを含む溶液とのそれぞれについて、微分パルスボルタンメトリーにより、作用極の電位を印刷電極内の銀／塩化銀参照電極に対し０Ｖから１Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定したものである。チロシンのみでは０．５５Ｖあたりに酸化電流ピークが観察されるが、リン酸化後はそのシグナルが消失していることが示された。このことから、チロシンの酸化電流を指標としてチロシンキナーゼ活性の有無を評価することが可能となることがわかる。

なお、前述の説明においては、プロテインキナーゼの酵素活性を測定する方法を例に挙げて説明したが、本発明によれば、酵素反応の際に阻害剤を共存させ、求めたプロテインキナーゼ活性から阻害剤の活性を間接的に測定することも可能である。また、プロテインキナーゼの活性化剤の存在下で酵素反応させ、プロテインキナーゼの活性を測定することにより、活性化剤の活性を間接的に測定することも可能である。

本実施例では、基質を固定した磁気ビーズを用い、チロシンキナーゼ反応後の基質を電極の表面に濃縮、分離し、リン酸化による基質中のチロシン酸化シグナルの消失を観察することによりプロテインキナーゼの活性又はその阻害活性の測定を試みた。

１. 基質固定磁気ビーズの作製
１００μＬのカルボキシル化磁気ポリスチレンビーズを１．５ｍＬのマイクロチューブに取り、４００μＬのＰＢＳ−Ｔ（０．１％のＴｗｅｅｎを含む５０ｍＭリン酸バッファー）を加えて５分間撹拌した。洗浄後１００μＬのＥＤＣとＮＨＳを最終濃度が２ｍＭと５ｍＭになるようにＰＢＳ−Ｔを加えて１時間撹拌した。磁気ビーズを分離後、基質ペプチドとしてＲａｙｔｉｄｅのＰＢＳ−Ｔ溶液を、最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、１時間撹拌した。その後１００μＬのエタノールアミンを最終濃度が１００ｍＭとなるように添加して１時間インキュベートして、ビーズ表面をブロッキング、洗浄し、再び１００μＬ中のＰＢＳ−Ｔに縣濁させて基質固定ビーズ溶液とした。

２．反応溶液中のチロシンキナーゼ活性の測定
反応溶液として、任意濃度のチロシンキナーゼ（ｐ６０^{ｃ−Ｓｒｃ}）、１４ｍＭ酢酸マグネシウム、３ｍＭアミノフィリン、４ｍＭジチオスレイトール、０．０５ｍＭのＡＴＰ、０．８３％カゼインを含む５０ｍＭのリン酸バッファー溶液を調製した。この反応溶液１００μＬに、１００μＬの基質固定磁気ビーズを加え、３０分間、３０℃でインキュベートした。反応は２５０μＬのトリクロロ酢酸を最終濃度が６．７５％になるように加えて終了させた。磁気的にビーズを収集し、洗浄後、５０μＬのリン酸バッファーに縣濁させた。

縣濁させたビーズ溶液を、印刷電極上に滴下し、電気化学的測定を行ってチロシンの酸化シグナルを観察した。具体的には、微分パルスボルタンメトリーにより、作用極の電位を０Ｖから１Ｖに変化させていき、電位変化に対する電流変化を測定した。ボルタンメトリーの条件は電位増加０．００４Ｖ、パルス振幅０．０５Ｖ、パルス期間０．２秒、掃引速度０．０１Ｖ／ｓであった。電位に対する電流変化の特性図を図３に示す。＋０．７Ｖ付近に観察されていたチロシンの酸化に伴う電流のピークは、チロシンキナーゼによるリン酸化により消失することが観察された。また、反応溶液中のチロシンキナーゼ活性とチロシンの酸化電流値との関係を図４に示す。これより、キナーゼ活性が高くなるにつれて酸化電流値が減少することが示された。

本発明の一実施形態について説明するための模式図であり、（ａ）は阻害剤なしの場合、（ｂ）は阻害剤ありの場合を示す。チロシンを１０ｎｇ／ｍＬ含む溶液と、リン酸化チロシンを１０ｎｇ／ｍＬ含む溶液とについて、それぞれ電位変化に対する電流変化を測定した結果を示す特性図である。反応溶液中のチロシンキナーゼ活性を測定するために電位変化に対する電流変化を測定した結果を示す特性図である。チロシンキナーゼ活性とチロシンの酸化電流値との関係を示す特性図である。

符号の説明

１基質ペプチド、２磁気ビーズ、３電極

Claims

電気化学的に酸化又は還元されるとともに、前記酸化又は還元に伴う電流がリン酸化によって消失するアミノ酸を含む基質と、前記基質中の前記アミノ酸にリン酸基供与体のリン酸基を付加するプロテインキナーゼとを接触させた後、前記基質を電極の表面に集めた状態で酸化電流値又は還元電流値を測定することを特徴とするプロテインキナーゼ活性の測定方法。
前記アミノ酸がチロシンであり、前記プロテインキナーゼがチロシンキナーゼであることを特徴とする請求項１記載のプロテインキナーゼ活性の測定方法。
前記基質を固定化したビーズ担体を用いて反応液から前記基質を分離することを特徴とする請求項１又は２記載のプロテインキナーゼ活性の測定方法。
前記ビーズ担体として磁気ビーズを用いることを特徴とする請求項３記載のプロテインキナーゼ活性の測定方法。