CN105441428A - 一种冰草着丝粒特异的Gypsy逆转座子序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种冰草着丝粒特异的Gypsy逆转座子序列及其应用。本发明提供的冰草着丝粒特异的Gypsy逆转座子，为如下(a)或(b)：(a)序列1自5’末端第37-803位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列1所示的DNA分子。本发明还保护由序列表的序列2所示的单链DNA分子和序列表的序列3所示的单链DNA分子组成的特异引物对。本发明的意义如下：(1)着丝粒逆转座子pAcCR1的获得对于研究冰草属植物的演化具有重要作用；(2)由于大量小麦-冰草易位系的获得，使得对外源冰草染色质的快速检测提出了新的挑战，而基于P基因组着丝粒区的逆转座子特异分子标记的获得可以对小麦背景下的冰草着丝粒区的P染色质进行高效检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种冰草着丝粒特异的Gypsy逆转座子序列及其应用。
背景技术
逆转座子可以分为长末端逆转座子和非长末端逆转座子，它在谷类作物中是常见的。在植物着丝粒中，逆转座子和微卫星DNA是最丰富的DNA元件，并且和着丝粒特异组蛋白CENH3相关联。小麦中由于缺少微卫星重复使得着丝粒逆转座子占主导地位。长末端逆转座子有Ty1-copia和Ty3-gypsy两个大群组成。CCS1和pSau3A9是Ty3-gypsy类逆转座子的一部分，在谷类作物的着丝粒处是非常保守的。除了小麦族特异的着丝粒逆转座子外，一些物种特异的着丝粒逆转座子也分离获得，而冰草属中还未见这方面的研究。所以，获得一个冰草特异的着丝粒逆转座子对于研究冰草着丝粒的结构、功能以及演化过程具有重要意义。
作为小麦改良重要的遗传资源，冰草属含有许多高产特性，如分蘖能力强、多花多小穗等，同时对旱、寒等非生物胁迫及白粉病、锈病等生物胁迫具有抗性。李立会等利用采自中国新疆的冰草(A.cristatum)Z559与普通小麦(TriticumaestivumL.)Fukuho杂交，通过进一步回交和自交获得了多个小麦-冰草异源二体附加系。小麦-冰草远缘杂交的成功及异源附加系的建立为将冰草P基因组的优异基因转移到小麦提供了前提。大量易位系的获得为冰草优异基因的有效利用提供了可能，而冰草染色质的追踪和鉴定就需要一个简单有效的手段。P基因组特异的着丝粒逆转座子序列的获得和基于此开发的PCR分子标记可以作为基因组特异的分子标签来对导入小麦的外源染色质进行追踪检测。
综上所述，由于着丝粒逆转座子在植物演化中的意义，以及冰草在小麦改良中的重要作用，急需在冰草属中开发P基因组特异的着丝粒逆转座子序列。
发明内容
本发明的目的是提供一种冰草着丝粒特异的Gypsy逆转座子序列及其应用。
本发明提供的冰草着丝粒特异的Gypsy逆转座子(分子标记，命名为特异DNA分子)，为如下(a)或(b)：(a)序列表的序列1自5’末端第37-803位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列1所示的DNA分子。
本发明还保护一种特异引物对，由序列表的序列2所示的单链DNA分子和序列表的序列3所示的单链DNA分子组成。
本发明还保护所述特异引物对在鉴定待测植物材料是否含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质中的应用。
本发明还保护一种检测待测植物材料是否含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质的方法，包括如下步骤：以待测植物材料的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物、待测植物材料含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质，如果没有得到PCR扩增产物、待测植物材料可能不含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质。
所述PCR扩增产物的大小具体可为767bp±5bp。
本发明还保护所述特异DNA分子在鉴定待测植物材料是否含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质中的应用。
本发明还保护一种检测待测植物材料是否含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质的方法，包括如下步骤：采用所述特异DNA分子作为探针，对待测植物染色体进行荧光原位杂交，如果具有荧光信号、待测植物材料含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质，如果不具有荧光信号、待测植物材料可能不含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质。
以上任一所述待测植物可为冰草Z559、冰草Z1842、冰草Z589、冰草Z1750、小麦中国春、小麦Fukuho、栽培一粒小麦MO4、硬粒小麦京DR3、提莫菲维小麦TI1、尾状山羊草Ae14、粗山羊草Y93、顶芒山羊草Y258、拟斯卑尔脱山羊草Ae49、小伞山羊草Y39、黑麦RM2161、大麦浙皮1号、长穗偃麦草PI547326、簇毛麦Z1731、新麦草R429、假鹅观草Z1365、鹅观草Z2192、小麦-冰草6P二体附加系4844-12、小麦-冰草6P长臂端体系、小麦-冰草6P短臂端体系、小麦-冰草附加系5113、小麦-冰草附加系5114、小麦-冰草附加系II-26、小麦-冰草附加系II-29-2i、小麦-冰草附加系5106、小麦-冰草附加系II-5-1、小麦-冰草附加系II-4-2、小麦-冰草附加系5038、小麦-冰草附加系5043、小麦-冰草附加系II-21-2、小麦-冰草附加系II-21-6、小麦-冰草附加系II-9-3、小麦-冰草附加系II-30-5、小麦-冰草附加系II-1-3、小麦-冰草附加系II-3-1、小麦-冰草附加系II-7-1或小麦-冰草附加系II-8-1。
本发明还保护序列表的序列1所示的DNA分子作为逆转座子的应用。
本发明的意义如下：(1)着丝粒逆转座子pAcCR1的获得对于研究冰草属植物的演化具有重要作用；(2)由于大量小麦-冰草易位系的获得，使得对外源冰草染色质的快速检测提出了新的挑战，而基于P基因组着丝粒区的逆转座子特异分子标记的获得可以对小麦背景下的冰草着丝粒区的P染色质进行高效检测。
附图说明
图1为小麦-冰草6P二体附加系4844-12的FISH结果。
图2为冰草Z1842的FISH结果。
图3为冰草Z589的FISH结果。
图4为实施例2中琼脂糖凝胶电泳的电泳图。
图5为实施例3中琼脂糖凝胶电泳的电泳图。
图6为实施例4中采用AcPR1F和AcPR1R组成的特异引物对进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳的电泳图。
图7为实施例4中采用ControlF和ControlR组成的对照引物对进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳的电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
冰草Z559(四倍体，4n＝28)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,J.,X.Yang,H.Wang,H.Li,L.Li,X.Li,etal.2006.Theintrogressionofchromosome6PspecifyingforincreasednumbersoffloretsandkernelsfromAgropyroncristatumintowheat.TheoreticalandAppliedGenetics114:13-20.)。
冰草Z1842(二倍体，2n＝14，P基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心。
冰草Z589(四倍体，4n＝28，P基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心。
冰草Z1750(六倍体，6n＝42，P基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
小麦中国春(普通小麦，六倍体，6n＝42，ABD基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(杨国辉,杨欣明,王睿辉,高爱农,李立会,刘伟华.2010.小麦-冰草附加系1·4重组P染色体对Ph基因的抑制作用.科学通报:463-467.)。
小麦Fukuho(普通小麦，六倍体，6n＝42，ABD基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
栽培一粒小麦MO4(二倍体，2n＝14，A基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
硬粒小麦京DR3(四倍体，4n＝28，AB基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
提莫菲维小麦TI1(四倍体，4n＝28，AG基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
尾状山羊草Ae14(二倍体，2n＝14，C基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
粗山羊草Y93(二倍体，2n＝14，D基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
顶芒山羊草Y258(二倍体，2n＝14，M基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
拟斯卑尔脱山羊草Ae49(二倍体，2n＝14，S基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
小伞山羊草Y39(二倍体，2n＝14，U基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
黑麦RM2161(二倍体，2n＝14，R基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心。
大麦浙皮1号(二倍体，2n＝14，H基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心。
长穗偃麦草PI547326(二倍体，2n＝14，E基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
簇毛麦Z1731(二倍体，2n＝14，V基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
新麦草R429(二倍体，2n＝14，Ns基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
假鹅观草Z1365(二倍体，2n＝14，St基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
鹅观草Z2192(二倍体，2n＝14，Y基因组)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
小麦-冰草6P二体附加系4844-12(具有42小麦条染色体+1对冰草6P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,J.,X.Yang,H.Wang,H.Li,L.Li,X.Li,etal.2006.Theintrogressionofchromosome6PspecifyingforincreasednumbersoffloretsandkernelsfromAgropyroncristatumintowheat.TheoreticalandAppliedGenetics114:13-20.)。
小麦-冰草6P长臂端体系(具有42条小麦染色体+1对冰草6P染色体长臂)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心。
小麦-冰草6P短臂端体系(具有42条小麦染色体+1对冰草6P染色体短臂)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心。
小麦-冰草附加系5113(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Han,H.,L.Bai,J.Su,J.Zhang,L.Song,A.Gao,etal.2014.GeneticrearrangementsofsixWheat–Agropyroncristatum6Padditionlinesrevealedbymolecularmarkers.PloSone9:e91066.)。
小麦-冰草附加系5114(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Han,H.,L.Bai,J.Su,J.Zhang,L.Song,A.Gao,etal.2014.GeneticrearrangementsofsixWheat–Agropyroncristatum6Padditionlinesrevealedbymolecularmarkers.PloSone9:e91066.)。
小麦-冰草附加系II-26(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Han,H.,L.Bai,J.Su,J.Zhang,L.Song,A.Gao,etal.2014.GeneticrearrangementsofsixWheat–Agropyroncristatum6Padditionlinesrevealedbymolecularmarkers.PloSone9:e91066.)。
小麦-冰草附加系II-29-2i(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Han,H.,L.Bai,J.Su,J.Zhang,L.Song,A.Gao,etal.2014.GeneticrearrangementsofsixWheat–Agropyroncristatum6Padditionlinesrevealedbymolecularmarkers.PloSone9:e91066.)。
小麦-冰草附加系5106(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Han,H.,L.Bai,J.Su,J.Zhang,L.Song,A.Gao,etal.2014.GeneticrearrangementsofsixWheat–Agropyroncristatum6Padditionlinesrevealedbymolecularmarkers.PloSone9:e91066.)。
小麦-冰草附加系II-5-1(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
小麦-冰草附加系II-4-2(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
小麦-冰草附加系5038(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
小麦-冰草附加系5043(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心。
小麦-冰草附加系II-21-2(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
小麦-冰草附加系II-21-6(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
小麦-冰草附加系II-9-3(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心(Wu,M.,J.Zhang,J.Wang,X.Yang,A.Gao,X.Zhang,etal.2010.CloningandcharacterizationofrepetitivesequencesanddevelopmentofSCARmarkersspecificforthePgenomeofAgropyroncristatum.Euphytica172:363-372.)。
小麦-冰草附加系II-30-5(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心。
小麦-冰草附加系II-1-3(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心。
小麦-冰草附加系II-3-1(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心。
小麦-冰草附加系II-7-1(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心。
小麦-冰草附加系II-8-1(具有42条小麦染色体+1对冰草P染色体)：中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源保护与研究中心。
实施例1、pAcCR1的发现及其在冰草染色体上的分布特征
一、pAcCR1的发现
以小麦-冰草6P短臂端体系为材料，通过显微切割和DOP-PCR的方法得到了6P短臂的DNA序列片段。将这些序列连接到pMD19-T载体，导入大肠杆菌中，得到6P短臂的DNA序列片段库。用斑点杂交筛选出冰草Z559和小麦Fukuho有差异的DNA克隆进行测序。
经BLAST分析，存在一个长度为871bp、GC含量为46.3％的DNA片段，将该DNA片段命名为pAcCR1，如序列表的序列1所示，pAcCR1具有长末端(LTR)Gypsy类反转录转座子的特征。
pAcCR1与乌拉尔图小麦基因组中的scaffold23384有70％的序列相似性。
pAcCR1是一个新的冰草染色体着丝粒序列。
二、pAcCR1在冰草染色体上的分布特征与特异性验证
以pAcCR1为探针，分别对小麦-冰草6P二体附加系4844-12、冰草Z1842和冰草Z589进行FISH(荧光原位杂交)分析。
小麦-冰草6P二体附加系4844-12的FISH结果见图1。结果表明，pAcCR1只在6P染色体的着丝粒处有分布，而在小麦源的42条染色体上均无信号。
冰草Z1842的FISH结果见图2。pAcCR1在14条染色体的着丝粒处均有分布，染色体着丝粒以外的区域均无信号。
冰草Z589的FISH结果见图3，pAcCR1在28条染色体的着丝粒处均有分布，染色体着丝粒以外的区域均无信号。
结果表明，pAcCR1是冰草P基因组染色体着丝粒区特异的。
实施例2、特异引物对的开发
1、基于pAcCR1设计了特异引物对如下：
AcCR1F(上游引物，序列表的序列2)：5’-GGCAAGGGAGTAACACAAGC-3’；
AcCR1R(下游引物，序列表的序列3)：5’-CCCCTCCAATTGTGAAAAGA-3’。
2、分别提取各个待测样本的基因组DNA。
3、分别以各个基因组DNA为模板，采用步骤1得到的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
4、将步骤3得到的各个PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图4。
图4中，M对应marker，1对应冰草Z559，2对应小麦Fukuho，3对应小麦-冰草6P二体附加系4844-12，4对应小麦-冰草附加系5113，5对应小麦-冰草附加系5114，6对应小麦-冰草附加系II-26，7对应小麦-冰草附加系II-29-2i，8对应小麦-冰草附加系5106，9对应小麦-冰草附加系II-5-1，10对应小麦-冰草附加系II-4-2，11对应小麦-冰草附加系5038，12对应小麦-冰草附加系5043，13对应小麦-冰草附加系II-21-2，14对应小麦-冰草附加系II-21-6，15对应小麦-冰草附加系II-9-3，16对应小麦-冰草附加系II-30-5，17对应小麦-冰草附加系II-1-3，18对应小麦-冰草附加系II-3-1，19对应小麦-冰草附加系II-7-1，20对应小麦-冰草附加系II-8-1，21对应小麦-冰草6P长臂端体系，22对应小麦-冰草6P短臂端体系。
结果表明：采用所述特异引物对，在冰草Z559、各个小麦-冰草附加系、小麦-冰草6P长臂端体系、小麦-冰草6P短臂端体系上均可以扩增得到特异条带，而在小麦Fukuho上不能扩增得到特异条带，说明所述特异引物对的靶序列为P基因组特异的分子标记。
回收各个特异条带并进行测序，测序结果表明，各个特异条带的大小均为767bp±5bp。
实施例3、特异引物对的特异性
1、分别提取各个待测样本的基因组DNA。
2、分别以各个基因组DNA为模板，采用AcCR1F和AcCR1R组成的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、将步骤2得到的各个PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图5。
图5中，M对应marker，1对应冰草Z1842，2对应冰草Z559，3对应冰草Z1750，4对应小麦中国春，5对应小麦Fukuho，6对应栽培一粒小麦MO4，7对应硬粒小麦京DR3，8对应提莫菲维小麦TI1，9对应尾状山羊草Ae14，10对应粗山羊草Y93，11对应顶芒山羊草Y258，12对应拟斯卑尔脱山羊草Ae49，13对应小伞山羊草Y39，14对应黑麦RM2161，15对应栽培大麦浙皮1号，16对应长穗偃麦草PI547326，17对应簇毛麦Z1731，18对应新麦草R429，19对应假鹅观草Z1365，20对应鹅观草Z2192。
结果表明，AcCR1F和AcCR1R组成的特异引物对对小麦族中的A、B、D、S、C、G、M、U、R、H、E、V、St、Ns、Y等基因组无扩增，特异性强。
实施例4、特异引物对与对照引物对的性能比较
1、分别提取各个待测样本的基因组DNA。
2、分别以各个基因组DNA为模板，采用AcPR1F和AcPR1R组成的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、将步骤2得到的各个PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图6。
图6中，M对应marker，1对应冰草Z559，2对应小麦-冰草6P二体附加系4844-12，小麦-冰草附加系5113，4对应小麦-冰草附加系II-9-3，5对应小麦-冰草附加系II-5-1，6对应小麦-冰草附加系5043，7对应小麦Fukuho，8对应提莫菲维小麦TI1，9对应尾状山羊草Ae14，10对应黑麦RM2161，11对应拟斯卑尔脱山羊草Ae49，12对应簇毛麦Z1731。
结果表明，AcCR1F和AcCR1R组成的特异引物对在冰草、各个小麦-冰草附加系上均可以扩增得到特异条带，而在小麦族各个品种上不能扩增得到特异条带，即其靶序列为冰草基因组特异。
4、分别以各个基因组DNA为模板，采用ControlF和ControlR组成的对照引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
ControlF(上游引物)：5’-ATTTTACCGTCCTTGCTTAC-3’；
ControlR(下游引物)：5’-TTCAAAAATCCCCACCAAAA-3’。
5、将步骤4得到的各个PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图7。
图7中，M对应marker，1对应冰草Z559，2对应小麦-冰草6P二体附加系4844-12，小麦-冰草附加系5113，4对应小麦-冰草附加系II-9-3，5对应小麦-冰草附加系II-5-1，6对应小麦-冰草附加系5043，7对应小麦Fukuho，8对应提莫菲维小麦TI1，9对应尾状山羊草Ae14，10对应黑麦RM2161，11对应拟斯卑尔脱山羊草Ae49，12对应簇毛麦Z1731。
结果表明，ControlF和ControlR组成的对照引物对在冰草、各个小麦-冰草附加系、小麦族各个品种上均可以扩增得到条带，特异性很差。
Claims (7)
1.一种特异引物对，由序列表的序列2所示的单链DNA分子和序列表的序列3所示的单链DNA分子组成。
2.权利要求1所述特异引物对在鉴定待测植物材料是否含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质中的应用。
3.一种检测待测植物材料是否含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质的方法，包括如下步骤：以待测植物材料的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述特异引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物、待测植物材料含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质，如果没有得到PCR扩增产物、待测植物材料可能不含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质。
4.一种DNA分子，为如下(a)或(b)：
(a)序列表的序列1自5’末端第37-803位核苷酸所示的DNA分子；
(b)序列表的序列1所示的DNA分子。
5.权利要求4所述DNA分子在鉴定待测植物材料是否含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质中的应用。
6.一种检测待测植物材料是否含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质的方法，包括如下步骤：采用权利要求4所述DNA分子作为探针，对待测植物染色体进行荧光原位杂交，如果具有荧光信号、待测植物材料含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质，如果不具有荧光信号、待测植物材料可能不含有来源于冰草染色体着丝粒区的遗传物质。
7.序列表的序列1所示的DNA分子作为逆转座子的应用。
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