CN105431452A - 中和IL-1β的人单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗原结合蛋白，且具体涉及IL-1β抗原结合蛋白。本发明还提供了包含该抗原结合蛋白的组合物、该抗原结合蛋白的应用及制备方法。

Description

中和IL-1β的人单克隆抗体
技术领域
本发明涉及抗原结合蛋白，且具体涉及IL-1β抗原结合蛋白。更具体地，本发明涉及所述结合蛋白的序列及重链和轻链。本发明还提供了包含该抗原结合蛋白的组合物、该抗原结合蛋白的应用及制备方法。
发明背景
白介素细胞-1β(IL-1β)是白介素细胞-1细胞因子家族的成员，并且是炎症反应的重要介质。其为促炎症细胞因子，且参与细胞增殖、分化和凋亡。
IL-1β的过表达与许多炎性疾病和自身免疫疾病有关，如冷吡啉相关的周期性综合征和相关病症、糖尿病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、肾细胞癌、痛风和炎性痤疮。
本发明一个目的是提供对IL-1β具有特异性的抗原结合蛋白，其能够中和IL-1β的活性，以预防或治疗与IL-1β产生升高相关的疾病。
目前，已有靶向IL-1β信号转导通路的3种生物制剂被批准用于临床应用：阿那白滞素(anakinra)(IL-1受体拮抗剂)、利纳西普(rilonacept)(包含IL-1受体1的融合蛋白)和卡那单抗(canakinumab)(单克隆抗体)。
除了以上所述的3种批准的IL-1阻滞剂，目前人源化单克隆抗体XOMA-052(gevokizumab)处在临床研发中。每种分子均表现出独特的作用机制并展现不同的交叉反应性和药理特性。
发明概述
根据第一个方面，提供了分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其包含选自以下结合单元的一个或多个结合单元：
(i)结合单元L1，包含SEQIDNO:3的Kabat残基23-35或SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基24-33或它们的变体，所述变体在所述结合单元L1中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(ii)结合单元L2，包含SEQIDNO:3的Kabat残基51-57或SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基49-55或它们的变体，所述变体在所述结合单元L2中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(iii)结合单元L3，包含SEQIDNO:3的Kabat残基92-102或SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基88-96或它们的变体，所述变体在所述结合单元L3中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(iv)结合单元H1，包含SEQIDNO:1的Kabat残基31-35或SEQIDNO:2或14的Kabat残基31-35或它们的变体，所述变体在所述结合单元H1中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(v)结合单元H2，包含SEQIDNO:1的Kabat残基50-66或SEQIDNO:2或14的Kabat残基50-65或它们的变体，所述变体在所述结合单元H2中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；和
(vi)结合单元H3，包含SEQIDNO:1的Kabat残基99-114或SEQIDNO:2或14的Kabat残基98-108或它们的变体，所述变体在所述结合单元H3中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失。
根据第二个方面，提供了分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其在细胞刺激检测中以小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于5nM、小于3nM、小于1nM、小于0.5nM或小于0.2nM的IC50值中和IL-1β。
根据第三个方面，提供了分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其在细胞抑制检测中以小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于1nM、小于0.5nM或小于0.4nM的IC50值抑制IL-1β诱导的IL-6产生。
根据第四个方面，提供了分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其以小于10nM、小于5nM、小于2nM、小于1nM、小于0.5nM，或小于0.1nM的KD值结合IL-1β。
根据第五个方面，提供了分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其以1-100pM的IC50值中和人IL-1β。
根据第六个方面，提供了分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其以100-1000pM的IC50值中和鼠IL-1β。
根据第七个方面，提供了分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其中所述结合蛋白对人IL-1β具有1-100pM的亲和力(KD)。
根据第八个方面，提供了分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其中所述结合蛋白对鼠IL-1β具有5-200pM的亲和力(KD)。
根据第九个方面，提供了前述方面中任一方面的分离的抗原结合蛋白在治疗癌症、炎性疾病或自身免疫疾病中的应用，所述炎性疾病或自身免疫疾病选自：关节炎、炎性肠道疾病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、痛风、糖尿病、葡萄膜炎、冷吡啉相关的周期性综合征和炎性痤疮。
根据第十个方面，提供了如以上所定义的分离的抗原结合蛋白在制备用于治疗癌症、炎性疾病或自身免疫疾病的药物中的应用，所述炎性疾病或自身免疫疾病选自：关节炎、炎性肠道疾病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、痛风、糖尿病、葡萄膜炎、冷吡啉相关的周期性综合征和炎性痤疮。
根据第十一个方面，提供了组合物，其包含如以上所定义的抗原结合蛋白和药学上可接受的载体。
根据第十二个方面，提供了分离的细胞系，其能够产生如以上所定义的抗原结合蛋白。
根据第十三个方面，提供了分离的核酸分子，其包含选自SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或14或它们的片段的序列或由其组成。
根据第十四个方面，提供了分离的核酸分子，其包含选自SEQIDNO:3或SEQIDNO:4、15或16或它们的片段的序列或由其组成。
根据第十五个方面，提供了包含如以上所定义的核酸分子的载体。
根据第十六个方面，提供了包含如以上所定义的核酸分子的宿主细胞。
根据第十七个方面，提供了包含如以上所定义的载体的宿主细胞。
根据第十八个方面，提供了制备如以上所定义的抗原结合蛋白的方法，包括在合适的条件下培养如以上所定义的宿主细胞，以及从中回收所述蛋白。
根据第十九个方面，提供了治疗癌症、炎性疾病或自身免疫疾病的方法，所述炎性疾病或自身免疫疾病选自：关节炎、炎性肠道疾病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、痛风、糖尿病、葡萄膜炎、冷吡啉相关的周期性综合征和炎性痤疮，其中将如以上所定义的分离的抗原结合蛋白给予至对象。
定义
本文所用的以下词语和术语应具有如下所表明的含义：
如本文所用，术语“抗原结合蛋白”是指抗体、抗体片段和其他蛋白构建体如结构域，其能够结合IL-1β。
如本文所用，术语“抗体”在广义上是指具有免疫球蛋白样结构域的分子，并且包括单克隆、重组的、多克隆、嵌合的、人源化的、双特异性、多特异性和异源缀合抗体；单个可变结构域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫有效片段、单链Fv、双价抗体、TandabsTM等(关于替代性“抗体”形式的综述，参见HolligerandHudson,NatureBiotechnology,2005,Vol23,No.9,1126-1136)。
词语“单个可变结构域”是指特异性结合抗原或表位的抗原结合蛋白可变结构域(例如，VH、VHH、VL)，其与不同的可变区或结构域无关。
“结构域抗体”或“dAb”可看做与“单个可变结构域”相同，其能够结合抗原。单个可变结构域可为人抗体可变结构域，但还包括来自其他物种的单个抗体可变结构域，如啮齿类(例如，公开于WO00/29004中的)、护士鲨和骆驼科的VHHdAb。骆驼科的VHH为免疫球蛋白单个可变结构域多肽，其来源的物种包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼(guanaco)，其产生天然缺少轻链的重链抗体。这类VHH结构域可根据本领域中可用的标准技术进行人源化，且这类结构域被看做“结构域抗体”。如本文所用，VH包括骆驼科的VHH结构域。
如本文所用，术语“结构域”是指这样的折叠蛋白结构，其具有独立于蛋白的其余部分的三级结构。通常，结构域负责蛋白的离散的功能特性，并且在很多情况下可被添加、移除或转移至其他蛋白，而不失去该蛋白的剩余部分和/或该结构域的功能。“单个可变结构域”是折叠的多肽结构域，其包含具有抗体可变结构域特性的序列。因而，其包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如，其中一个或多个环已经被不具有抗体可变结构域特性的序列替代，或已经被截短或包含N或C末端延伸的抗体可变结构域，以及至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。结构域可结合抗原或表位，而与不同可变区或结构域无关。
可通过在非抗体蛋白骨架如结构域上排列一个或多个CDR的方式来提供抗原结合片段。该结构域可为结构域抗体，或者可为这样的结构域，其为选自以下的骨架的衍生物：CTLA-4(Evibody)；脂质运载蛋白；蛋白A衍生的分子如蛋白A的Z-结构域(亲和体(Affibody)，SpA)、A-结构域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白如GroEl和GroES；转铁蛋白(Trans-body)；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C-型凝集素结构域(四连接素)；人γ-晶体蛋白和人泛素(affilin)；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素Kunitz型结构域；和纤连蛋白(adnectin)；其已经接受蛋白质改造以便获得对除其天然配体以外的配体的结合。
CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关的抗原4)是主要表达于CD4+T-细胞上的CD28-家族受体。其胞外结构域具有可变结构域样Ig折叠。对应于抗体的CDR的环可用异源序列替代以赋予不同的结合特性。经改造的具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称为Evibody。详情参见，JournalofImmunologicalMethods248(1-2),31-45(2001)。
脂质运载蛋白为胞外蛋白家族，其转运小疏水分子，如类固醇、后胆色素类、类维生素A和脂类。它们具有在锥形结构的开口端带有多个环的刚性β-折叠二级结构，其可经改造以结合不同的靶抗原。Anticalin的大小为160-180个氨基酸，且源自脂质运载蛋白。详情参见，BiochimBiophysActa1482:337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。
亲和体是源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白A的骨架，其可经改造以结合抗原。该结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化生成了文库。详情参见，ProteinEng.Des.Sel.17,455-462(2004)和EP1641818A1。
Avimer是源自A-结构域骨架家族的多结构域蛋白。约35个氨基酸的天然结构域采用明确的二硫键连接的结构。通过A-结构域家族展现的天然变异的重排(shuffling)产生了多样性。详情参见，NatureBiotechnology23(12),1556-1561(2005)和ExpertOpiniononInvestigationalDrugs16(6),909-917(June2007)。
转铁蛋白是单体血清运输糖蛋白。通过在许可的表面环中插入肽序列，可对转铁蛋白进行改造以结合不同的靶抗原。改造的转铁蛋白骨架的实例包括Trans-body。详情参见，J.Biol.Chem274,24066-24073(1999)。
设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)源自锚蛋白，其为介导膜整合蛋白结合至细胞骨架的蛋白家族。单个锚蛋白重复为33个残基的基序，其由两个α-螺旋和一个β-转角组成。通过在每个重复的第一α-螺旋和β-转角中将残基随机化，可对它们进行改造以结合不同的靶抗原。通过增加模块的数目(亲和力成熟方法)可增加它们的结合界面。详情参见，J.Mol.Biol.332,489-503(2003)，PNAS100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)，以及US20040132028A1。
纤连蛋白是可经改造以结合抗原的骨架。Adnectin由人纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单元的第10个结构域的天然氨基酸序列的骨架组成。β-夹层一端的三个环可经改造而使Adnectin能够特异性识别目标治疗靶标。详情参见，ProteinEng.Des.Sel.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。
肽适体为组合的识别分子，其由恒定的骨架蛋白组成，通常为含有插入活性位点的约束性可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。详情参见，ExpertOpin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。
微体源自天然存在的长度为25-50个氨基酸的微量蛋白，其含有3-4个半胱氨酸桥-微量蛋白的实例包括KalataB1和芋螺毒素(conotoxin)和打结素(knottin)。微量蛋白具有可经改造而包含多达25个氨基酸而不影响微量蛋白的总体折叠的环。经改造的打结素结构域的详情，参见WO2008098796。
其他结合结构域包括这样的蛋白，其已经被用作骨架来改造不同的靶抗原结合特性，包括人γ-晶体蛋白和人泛素(affilin)、人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、Ras-结合蛋白AF-6的PDZ-结构域、蝎毒素(卡律蝎毒素(charybdotoxin))、C-型凝集素结构域(四连接素)，关于它们的综述参见，HandbookofTherapeuticAntibodies，第7章“非抗体骨架”(2007,StefanDubel编著)和ProteinScience15:14-27(2006)。本发明的结合结构域可源自这些替代性的蛋白结构域中的任一结构域。
抗原结合片段或免疫有效片段可包含部分重链或轻链可变序列。片段长度为至少5、6、8或10个氨基酸。可选择地，所述片段长度为至少15、至少20、至少50、至少75或至少100个氨基酸。
如本说明书全文所用，术语“中和”是指在体外或体内，在如本文所述的抗原结合蛋白存在下IL-1β的生物活性相比该抗原结合蛋白不存在下IL-1β的活性降低了。中和可能是由于以下一种或多种情形：封阻IL-1β结合其受体、阻止IL-1β激活其受体、下调IL-1β或其受体，或影响效应物功能。
生物活性的降低或抑制可以是部分的或全部的。相比抗原结合蛋白不存在下的IL-1β活性，中和性抗原结合蛋白可中和至少20％、30％40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的IL-1β活性。
可采用本领域技术人员已知的或如本文所述的一种或多种检测方法来测定或测量中和。例如，可在夹层ELISA检测中通过BIAcoreTM、FMAT、FORTEbio或类似的体外分析，以及在基于细胞的功能分析中，评估结合IL-1β的抗原结合蛋白。
“CDR”被定义为抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列。其为免疫球蛋白重链和轻链的高变区。在免疫球蛋白的可变部分中存在3个重链和3个轻链CDR(或CDR区)。因而，如本文所用，“CDR”是指所有3个重链CDR、所有3个轻链CDR、所有重链和轻链CDR或至少2个CDR。
在整个本说明书中，可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基根据Kabat编号规定进行编号。类似地，实施例中所用的术语“CDR”、“CDRL1”、“CDRL2”、“CDRL3”、“CDRH1”、“CDRH2”、“CDRH3”也遵循Kabat编号规定。进一步的信息参见，Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第4版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NationalInstitutesofHealth(1987)。
对本领域技术人员来说显而易见的是，还有针对可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基的替代性编号规定。也有针对CDR序列的替代性编号规定，例如，在Chothiaetal.(1989)Nature342:877-883中陈述的那些。抗体的结构和蛋白折叠可能意味着其他残基可被看做CDR序列的一部分，且本领域技术人员也会这么理解。
本领域技术人员可利用的CDR序列的其他编号规定包括“AbM”法(巴斯大学)和“接触”法(伦敦大学学院)。采用Kabat、Chothia、AbM和接触法中的至少两种方法可确定最小重叠区以提供“最小结合单元”。所述最小结合单元可为CDR的子部分。
以下表格表示将每种编号规定用于每种CDR或结合单元的一个定义。所述Kabat编号方案被用于表1中，以对所述可变结构域氨基酸序列编号。应注意到，一些CDR定义可根据所用的个别出版物而改变。
对于核苷酸和氨基酸序列，术语“相同的”或“序列同一性”表示当进行最佳比对并与合适的插入或缺失比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的相同程度。
两个序列之间的同一性百分比与这两个序列共有的相同位置的数目呈函数关系(即，％同一性＝相同位置的数目/位置总数*100)，其中考虑了空位的数目和每个空位的长度，其需要引入两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可使用数学算法来完成，如下文所述。
两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用GCG软件包中的GAP程序来确定，其采用NWSgapdna.CMP矩阵，且空位权重为40、50、60、70或80，且长度权重为1、2、3、4、5或6。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比也可采用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))来确定，其已被并入到ALIGN程序(2.0版)中，其采用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，且空位罚分为4。此外，两个氨基酸序列间的同一性百分比可采用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法确定，其已被并入到GCG软件包中的GAP程序中，其使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，且长度权重为1、2、3、4、5或6。
例如，多核苷酸序列可与如本文所述的参考多核苷酸序列(参见例如，SEQIDNO:X)相同，即为100％相同，或者相比参考序列其可包含多达某个整数的核苷酸改变，如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。这类改变选自至少一个核苷酸缺失、替换(包括转换和颠换)或插入，且其中所述改变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或者这些末端位置之间的任何地方，其单独散置于参考序列中的核苷酸之间或在参考序列内的一个或多个连续的组内。核苷酸改变的数目通过如下进行确定：用参考多核苷酸序列的核苷酸总数乘以各自的同一性百分比(除以100)的百分数，然后用所述参考多核苷酸序列的核苷酸总数减去该得数：
nn≤xn-(xn·y),
其中nn为核苷酸改变的数目，xn为参考多核苷酸序列的核苷酸总数，且y对于50％为0.50、对于60％为0.60、对于70％为0.70、对于75％为0.75、对于80％为0.80、对于85％为0.85、对于90％为0.90、对于95％为0.95、对于98％为0.98、对于99％为0.99，或对于100％为1.00，·是乘法运算符号，且其中将xn与y的任何非整数得数下舍为最接近的整数，然后将其从xn中减去。
类似地，多肽序列可与多肽参考序列相同，即为100％相同，或者相比参考序列其可包含多达某个整数的氨基酸改变，使得％同一性小于100％，如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。这类改变选自至少一个氨基酸缺失、替换(包括保守的和非保守的替换)或插入，且其中所述改变可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置，或者这些末端位置之间的任何地方，其单独散置于参考序列中的氨基酸之间或在参考序列内的一个或多个连续的组内。给定％同一性的氨基酸改变的数目通过如下进行确定：用参考多肽序列编码的多肽序列的氨基酸总数乘以各自的同一性百分比(除以100)的百分数，然后用所述参考多肽序列的氨基酸总数减去该得数：
na≤xa-(xa·y),
其中na为氨基酸改变的数目，xa为参考多肽序列的氨基酸总数，且y对于50％为0.50、对于60％为0.60、对于70％为0.70、对于75％为0.75、对于80％为0.80、对于85％为0.85、对于90％为0.90、对于95％为0.95、对于98％为0.98、对于99％为0.99，或对于100％为1.00，·是乘法运算符号，且其中将xa与y的任何非整数得数下舍为最接近的整数，然后将其从xa中减去。可测定经序列长度的％同一性。
如整个本说明书中所用，涉及抗原结合蛋白的术语“特异性结合”是指，相比结合非靶标表位时产生的亲和力，所述抗原结合蛋白以更大的亲和力结合IL-1β上的靶标表位。在某些实施方案中，特异性结合是指，相比对非靶标表位的亲和力，以至少10、50、100、250、500或1000倍的亲和力结合靶标。例如，结合亲和力可通过常规方法进行测量，例如通过竞争性ELISA或通过用BIACORETM、KINEXATM或PROTEONTM测量Kd。
如本文所用，术语“IC50”是指针对特定测试物质，将参考激动剂的效力或生物靶标的组成性活性降低为拮抗剂曲线(顶-底)的50％的物质(拮抗剂)摩尔浓度。
如本文所用，术语“EC50”是指诱导的响应为剂量-响应曲线最大效应的50％的物质(激动剂)摩尔浓度。
在整个本说明书中，可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基按照Kabat编号规定来编号。进一步信息参见，Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第4版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NationalInstitutesofHealth(1987)。
对本领域技术人员来说显而易见的是，还有针对可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基的替代性编号规定。也有针对CDR序列的替代性编号规定，例如，在Chothiaetal.(1989)Nature342:877-883中陈述的那些。抗体的结构和蛋白折叠可能意味着其他残基可被看做CDR序列的一部分，且本领域技术人员也会这么理解。
本领域技术人员可利用的针对CDR序列的其他编号规定包括“AbM”法(巴斯大学)和“接触”法(伦敦大学学院)。采用Kabat、Chothia、AbM和接触法中的至少两种方法可确定最小重叠区，以提供“最小结合单元”。所述最小结合单元可为CDR的子部分。
术语“药学上可接受的载体”旨在包括溶剂、分散媒介、包衣料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。将这类媒介和试剂用于药学活性物质为本领域技术人员所熟知。除了在任何常规媒介或试剂与所述化合物不相容的情况下，本发明包括其在治疗组合物中的应用和治疗和预防的方法。也可将补充性活性化合物掺入本发明的组合物中。尤其有利的是，将肠胃外组合物配制为单位剂量形式以便于给药和剂量一致。
如本文所用，核酸是指任何单链或双链的RNA或DNA分子，如mRNA、cDNA和基因组DNA。
如本文所用，术语“约”在配方的组分浓度的语境下，通常是指所表述的值的+/-5％，更通常为所表述的值的+/-4％，更通常为所表述的值的+/-3％，更通常为所表述的值的+/-2％，甚至更通常为所表述的值的+/-1％，并且甚至更通常为所表述的值的+/-0.5％。
在整个本公开中，某些实施方案可能以范围值形式公开。应理解，以范围值形式描述仅仅是为了便利和简洁，而不应解释为对本公开的范围值的保护范围的刚性限定。因此，范围值的描述应理解为明确公开了该范围值内的所有可能子范围值和单个数值。例如，描述的范围值如1-6应理解为明确公开了子范围值如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及该范围值内的单个数字，例如，1、2、3、4、5和6。该适用与所述范围值的宽度无关。
优选实施方式的公开
以下将公开分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白的示例性且非限制性的实施方案。
在一个实施方案中，所述分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白包含选自以下结合单元的一个或多个结合单元：
(i)结合单元L1，包含SEQIDNO:3的Kabat残基23-35或SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基24-33或它们的变体，所述变体在所述结合单元L1中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(ii)结合单元L2，包含SEQIDNO:3的Kabat残基51-57或SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基49-55或它们的变体，所述变体在所述结合单元L2中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(iii)结合单元L3，包含SEQIDNO:3的Kabat残基92-102或SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基88-96或它们的变体，所述变体在所述结合单元L3中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(iv)结合单元H1，包含SEQIDNO:1的Kabat残基31-35或SEQIDNO:2或14的Kabat残基31-35或它们的变体，所述变体在所述结合单元H1中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(v)结合单元H2，包含SEQIDNO:1的Kabat残基50-66或SEQIDNO:2或14的Kabat残基50-65或它们的变体，所述变体在所述结合单元H2中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；和
(vi)结合单元H3，包含SEQIDNO:1的Kabat残基99-114或SEQIDNO:2或14的Kabat残基98-108或它们的变体，所述变体在所述结合单元H3中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失.
在一个实施方案中，所述分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白包含重链和/或轻链，其中所述重链包含由选自SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或14的核苷酸序列编码的氨基酸序列或者由其组成，且其中所述轻链包含由选自SEQIDNO:3或SEQIDNO:4、15或16的核苷酸序列编码的氨基酸序列或者由其组成。
所述重链可选自：α、δ、ε、γ和μ重链。优选地，所述重链为γ。
优选地，所述轻链选自λ或κ轻链。优选地，所述轻链为λ。
在一个实施方案中，所述SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基88-96可选自以下残基，其由选自SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12或SEQIDNO:13的氨基酸1-9组成。
在一个实施方案中，所述分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白在细胞功能中和检测中以小于约20nM的IC50值中和IL-1β。
在另一个实施方案中，所述分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白在细胞刺激检测中以小于约15nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约3nM、小于约1nM、小于约0.5nM、小于约0.2nM、小于约100pM、小于50pM、小于10pM、小于5pM或约1pM的IC50值中和IL-1β。
在一些实施方案中，所述分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白选自人IL-1β，并与鼠或猿猴IL-1β进行交叉反应。
在一个实施方案中，如本文所述的分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白在细胞抑制检测中以选自小于约20nM的IC50值抑制IL-1β诱导的IL-6产生。在另一个实施方案中，如本文所述的分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白在细胞抑制检测中以选自小于约15nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约1nM、小于约0.5nM或小于约0.4nM、小于约300pM、小于约200pM、小于约100pM、小于约50pM、小于约10pM或小于约5pM的IC50值抑制IL-1β诱导的IL-6产生。
在一个实施方案中，所述分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白以小于约10nM的KD值结合IL-1β。在另一个实施方案中，所述分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白以小于约5nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约0.5nM、小于约200pM、小于约100pM、小于约5pM或小于约1pM的KD值结合IL-1β。
在一个实施方案中，所述分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白以1pM至5nM的IC50值中和人IL-1β。
在一个实施方案中，所述分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白以100pM至15nM的IC50值中和鼠IL-1β。
在一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白为能够特异性结合IL-1β。
在一些实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含或以下组成：
(i)由SEQIDNO:1的核苷酸序列编码的重链和由SEQIDNO:3的核苷酸序列编码的轻链；或
(ii)由SEQIDNO:2或14的核苷酸序列编码的重链和由SEQIDNO:4、15或16的核苷酸序列编码的轻链。
在一个实施方案中，所述SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基88-96可选自以下残基，其由选自SEQID9、SEQID10、SEQID11、SEQID12或SEQIDNO:13的氨基酸1-9组成。
在一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白或其片段包含与SEQIDNO:1、2、14、3、4、15或16具有选自至少50％、至少60％、至少70％、至少80％和至少90％的同一性的氨基酸序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白为抗体。优选地，所述抗体为单克隆、多克隆、双特异性或异源缀合的抗体。
在一个实施方案中，所述抗体可为完全的人抗体。
在一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白为选自亚型IgG1、IgG2、IgG4或IgG3的抗体。
在一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白为单个可变结构域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫有效片段、单链Fv、双价抗体或四价双特异性抗体(Tandab)。在一个实施方案中，所述抗原结合片段可包含在非-抗体蛋白骨架如结构域上的一个或多个CDR的排列。
在一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白为重组蛋白。
在一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含选自以下的试剂：免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。
所述免疫粘附分子可包含细胞粘附分子(CAMs)的免疫球蛋白(Ig)超家族、整合素、钙粘素和选择素中的一种或多种。
在一个实施方案中，所述显像剂可选自：放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。
合适的放射性标记的实例，包括但不限于：32-磷或氚标记胸苷形式的氚。
合适的荧光标记的实例，包括青色素、荧光素、若丹明、AlexaFluor、DylightFluor、ATTO染料和BODIPY染料。
合适的发光标记的实例包括，包括但不限于发光氨和钌探针的化学发光标记，和包括但不限于荧光素的生物发光标记。
在一个实施方案中，所述试剂为治疗剂或细胞毒性剂。所述治疗剂或细胞毒性剂可选自：抗-代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗-血管生成剂、抗-有丝分裂剂、蒽环霉素、毒素和细胞凋亡剂。
在一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白被用于治疗癌症、炎性疾病或自身免疫疾病，所述炎性疾病或自身免疫疾病选自：关节炎、炎性肠道疾病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、痛风、糖尿病、葡萄膜炎、冷吡啉相关的周期性综合征和炎性痤疮。
在一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白被用于制备用于治疗癌症和炎性疾病或自身免疫疾病的药物，所述炎性疾病或自身免疫疾病选自：关节炎、炎性肠道疾病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、痛风、糖尿病、葡萄膜炎、冷吡啉相关的周期性综合征和炎性痤疮。
在一个实施方案中，所述冷吡啉相关的周期性综合征可选自家族性冷自发炎症综合征(FCAS)、穆-韦二氏(Muckle-Wells)综合征(MWS)和新生儿多系统炎性疾病(NOMID，也称慢性婴儿期神经性皮肤和关节综合征或CINCA)。
在一个实施方案中，提供了包含如本文所述的抗原结合蛋白和药学上可接受的载体的组合物。
在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白可通过注射给药。在可注射溶液的情况下，所述载体可为溶剂或分散媒介，其包含例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、它们的合适的混合物和植物油。可维持恰当的流动性，例如，通过使用包衣料如卵磷脂，在分散剂的情况下通过维持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂。可通过包含各种抗细菌和/或抗真菌剂来实现防止微生物作用。合适的试剂为本领域技术人员熟知，且包括例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、苄醇、抗坏血酸、硫柳汞等。在很多情况下，优选在所述组合物中包含等渗剂，例如，糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇和氯化钠。所述可注射的组合物的长效吸收可通过在该组合物中包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶引起。
可通过如下来制备无菌可注射的溶液：按要求将类似物以所需的量与以上所列举成分的一种或其组合一起掺入合适的溶剂中，然后进行过滤除菌。通常，分散剂按如下制备：将类似物掺入含有基本分散媒介和所需的以上列举的其他成分的无菌赋形剂中。
优选地，所述药物组合物还可包含合适的缓冲剂以使酸水解作用最小化。合适的缓冲剂为本领域技术人员熟知且其包括但不限于，磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐和它们的混合物。
可进行本发明的药物组合物单次或多次给药。本领域技术人员能够通过常规实验来确定本发明的化合物和/或组合物的有效非毒性剂量水平，和适于治疗应用所述化合物和组合物的疾病和/或感染的给药方式。
而且，对本领域技术人员来说显而易见的是，治疗的最佳进程，如本发明的化合物或组合物在确定的天数中每天给予的剂量数，可采用治疗测试的常规过程来确定。
通常，每24小时的有效剂量范围可为每kg体重约0.0001mg至约1000mg；合适地，每kg体重约0.001mg至约750mg；每kg体重约0.01mg至约500mg；每kg体重约0.1mg至约500mg；每kg体重约0.1mg至约250mg；或每kg体重约1.0mg至约250mg。更合适地，每24小时的有效剂量范围可为每kg体重约1.0mg至约200mg；每kg体重约1.0mg至约100mg；每kg体重约1.0mg至约50mg；每kg体重约1.0mg至约25mg；每kg体重约5.0mg至约50mg；每kg体重约5.0mg至约20mg；或每kg体重约5.0mg至约15mg。
可选择地，有效剂量可达约500mg/m2。例如，通常，有效剂量预期的范围为：约25至约500mg/m2，约25至约350mg/m2，约25至约300mg/m2，约25至约250mg/m2，约50至约250mg/m2，以及约75至约150mg/m2。
在一个实施方案中，所述组合物还包含如本文所述的一种或多种治疗剂。
还提供了分离的细胞系，其能够产生如本文所述的抗原结合蛋白。
能够产生所述抗原结合蛋白的细胞系的实例包括HEK293和CHO。
还提供了分离的核酸分子，其包含选自SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或14或它们的片段的序列或者由其组成。
还提供了分离的核酸分子，其包含选自SEQIDNO:3或SEQIDNO:4、15或16或它们的片段的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述分离的核酸分子或其片段，包含与SEQIDNO:1、2、14、3、4、15或16具有选自至少50％、至少60％、至少70％、至少80％和至少90％的同一性的核苷酸序列或者由其组成。
还提供了包含如本文所定义的核酸分子的载体。
在一个实施方案中，所述载体可为质粒或病毒。本领域技术人员应理解，存在很多合适的载体，且其包括在本公开的范围内。
优选地，所述载体包含可操作地连接至所述核酸分子的表达调控序列。
所述表达调控序列可为促进、增强或抑制目标基因或蛋白表达的核酸片段。
还提供了包含如以上所定义的核酸分子的宿主细胞。
所述宿主细胞可为培养的细胞系、体内细胞或离体细胞。
在一个实施方案中，所述宿主细胞包含如本文所述的载体。
还提供了制备如本文所述的抗原结合蛋白的方法，包括在合适条件下培养如本文所述的宿主细胞，以及从中回收所述蛋白。
还提供了治疗癌症、炎性疾病或自身免疫疾病的方法，所述炎性疾病或自身免疫疾病选自：关节炎、炎性肠道疾病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、痛风、糖尿病、葡萄膜炎、冷吡啉相关的周期性综合征和炎性痤疮，其中将如本文所述的分离的抗原结合蛋白给予至对象。
附图说明
所附附图说明了公开的实施方案，并用于解释公开的实施方案的原理。然而应理解，所述附图仅用于说明的目的，而非作为本发明范围的限定。
图1显示了由Fab克隆1H和2H中和IL-1β。基于655nm处的光密度(OD)读数和Fab的浓度来测量IL-1β中和。结果显示，克隆1H和2H分别以1.31和0.21的IC50值抑制了IL-1β的激活。
图2显示了1H和2HFab克隆的重链和轻链的测序结果。
图3显示了由IgG11H和2H中和人IL-1β。基于655nm处的光密度(OD)读数和IgG的浓度来测量IL-1β中和。结果显示，克隆1H和2H分别以2.6nM和0.17nM的效价(EC50)中和人IL-1β。
图4显示了由IgG11H和2H中和小鼠IL-1β。基于655nm处的光密度(OD)读数和IgG的浓度来测量IL-1β中和。结果显示，克隆1H和2H分别以11.5nM和1.5nM的效价(EC50)中和小鼠IL-1β。
图5显示了IgG1H和2H抑制MRC5细胞中人IL-1β诱导的IL-6产生。通过测量在IgG1H和2H存在下产生的IL-6水平来确定人IL-1β中和效价。用4pM的IL-1β和不同浓度的IgG1H和2H一起刺激了MRC5细胞。结果显示，IgG1H和2H分别具有3.92nM和0.35nM的抑制效价(EC50)。
图6显示IgG2H在Balb/c小鼠体内抑制了人IL-1β诱导的IL-6产生。通过用4或20mg/kg的2H或者400μL的PBS经腹腔内注射小鼠，且第二天用人IL-1β或PBS注射，评估了IgG2H的中和效价。采集血样，并通过ELISA测量IL-6。结果显示，IgG2H能够在小鼠中以剂量依赖性方式抑制人IL-1β诱导的IL-6产生。
图7显示IgG2H对于IL-1β具有特异性，且不识别IL-1α。基于460nm处的光密度(OD)和IgG2H的浓度来测定IgG2H的结合特异性。结果显示，当IgG2H以剂量依赖性方式结合至人和小鼠的IL-1β二者时，其不能结合人或小鼠IL-1α。
图8和9显示了从IgG2H的亲和力成熟获得的5个IgG克隆的中和效价。基于分泌的IL-6的浓度对每个IgG克隆的浓度来确定中和效价。结果显示，所有成熟的IgG克隆对小鼠和人IL-1β均呈现高中和效价。结果还显示，相比未成熟的IgG2H，成熟的克隆中和小鼠IL-1β的效率为2-8倍高(图8)，而其中和人IL-1β的效率为3-23倍高(图9)。
图10显示了P2D7KK的序列。P2D7KK来源于P2D7，其是通过在重链可变区的75和81位置用赖氨酸残基(粗体下划线)变换一个精氨酸和一个丝氨酸残基。
图11显示了在DBA小鼠中用抗-胶原蛋白抗体诱导关节炎后的关节炎分数。用5mg/kg同种型、5mg/kgP2D7KK或15mg/kgP2D7KK注射小鼠。结果显示，用P2D7KK处理的小鼠具有的关节炎分数大大低于用同种型对照注射的小鼠的关节炎分数。
图12显示了在关节炎诱导并给予同种型对照(左)、P2D7KK5mg/kg(中)或P2D7KK15mg/kg(右)后，典型的前爪(上面的图)和后爪(下面的图)肿胀。结果显示，P2D7KK明显抑制了炎症，因为相比用同种型对照注射的小鼠，用P2D7KK处理的小鼠没有经历爪肿胀。
图13显示了用同种型抗体注射(左)或者用5mg/kg(中)或15mg/kg(右)的P2D7KK处理的小鼠前爪(上面的图)和后爪(下面的图)关节的典型的组织学分析。结果显示，在用P2D7KK处理的小鼠中，关节基本上保持无免疫细胞浸润，而用同种型注射的小鼠的关节是高度炎症反应的位点。
图14显示了注射PBS(1)或尿酸单钠晶体然后给予PBS(2)、阿那白滞素30mg/kg(3)、同种型人抗体15mg/kg(4)、P2D7KK5mg/kg(5)或P2D7KK15mg/kg(6)后，腹腔内的免疫细胞浸润。所示为均值±s.e.m。非配对t-检验:*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；n.s.不显著。
图15显示了用P2D7KK或用同种型对照处理的小鼠中，癌细胞接种后第7-17天的肿瘤生长。所示为均值±SD、双因素ANOVA检测(Turkey多重比较)*＝p<0.05。
图16显示了小鼠耳部引流淋巴结中的细胞绝对数。图形1表示未感染痤疮丙酸杆菌(P.acne)的小鼠；图形4表示感染了痤疮丙酸杆菌并注射了PBS的小鼠；图形3表示感染了痤疮丙酸杆菌并注射了同种型对照的小鼠；图形2表示感染了痤疮丙酸杆菌并注射了P2D7KK的小鼠。
图17显示了未感染痤疮丙酸杆菌的小鼠(每组从左起的第一个柱)、感染了痤疮丙酸杆菌并注射了PBS的小鼠(每组从左起的第二个柱)、感染了痤疮丙酸杆菌并注射了同种型对照的小鼠(每组从左起的第三个柱)，或感染了痤疮丙酸杆菌并注射了P2D7KK的小鼠(每组从左起的第四个柱)的表皮中的淋巴细胞数。p-值是指非配对t-检验的值。
实施例
本发明的非限制性实例，包括最佳实施方式和比较例，将参照具体实施例进一步进行更详细的描述，这些实施例不应解释为以任何形式限制本发明的范围。
实施例1–分离抗人IL-1β抗体并在基于细胞的分析中表征IL-1β中和能力
通过体外选择从人抗体噬菌体展示文库(HumanyxHX-02文库)分离了抗-IL-1β抗体。Fab形式的IL-1β特异性单克隆抗体最初通过ELISA鉴别。将这些ELISA-阳性Fab添加至HEK-BlueTMIL-1β细胞(InvivoGen,USA)，其为经改造的过表达重组人IL-1受体的HEK293细胞系。
HEK-BlueTMIL-1β细胞表面上IL-1β与其受体IL-1R的结合引发了信号转导级联，导致NF-kB激活且随后产生分泌的碱性磷酸酶(SEAP)。采用比色的SEAP底物QUANTI-BlueTM可便利地评估HEK-BlueTMIL-1β细胞上清液中SEAP的检测。HEK-Blue细胞对人和小鼠IL-1β均敏感，但对人IL-1α或TNF-α不敏感。
在22个ELISA-阳性Fab中，发现两个克隆即1H和2H分别通过以1.31和0.21nM的IC50(抑制50％的IL-1β活性的浓度)刺激IL-1β，抑制HEK-BlueIL-1β细胞的激活(图1)。测序结果揭示，两个克隆均具有λ轻链。克隆1H和2H的重链和轻链序列如图2所示。
实施例2–在HEK-Blue细胞分析中通过IgG11H和2H中和IL-1β
通过PCR分别扩增每个克隆的重链和轻链，将两个Fab克隆1H和2H转化为全长IgG，并克隆至哺乳动物细胞表达载体中。随后通过瞬时转染至哺乳动物细胞中，将所得的具有人IgG1亚型的质粒用于全长抗体表达。通过蛋白G柱纯化抗体。
人IL-1β
然后，使用如上所述的HEK-Blue细胞分析IgG克隆1H和2H对人IL-1β的中和效价。用4pM的人IL-1β与不同浓度的抗体一起刺激细胞。通过S型(Sigmoidal)非线性回归(可变斜率)方程拟合剂量响应曲线，从该方程计算EC50(半最大有效浓度)。在这个分析中，克隆1H和2H分别以2.6nM和0.17nM的效价(EC50)中和人IL-1β(图3)。
小鼠IL-1β
使用如上所述的HEK-Blue细胞检测IgG克隆1H和2H对小鼠IL-1β的中和效价。然而，用小鼠IL-1β与不同浓度的抗体一起刺激细胞。在这个分析中，克隆1H和2H分别以11.5nM和1.5nM的效价(EC50)中和小鼠IL-1β(图4)。
实施例3–通过IgG1H和2H抑制人IL-1β诱导的IL-6产生
体外
使用人成纤维细胞细胞系MRC5在体外检测了通过IgG1H和2H抑制人IL-1β诱导的IL-6产生。用IL-1β刺激人肺成纤维细胞细胞MRC5导致IL-6产生。
通过测量在所述抗体存在下产生的IL-6水平来检测IgG1H和2H的人IL-1β中和效价。用人IL-1β与不同浓度的抗体一起刺激细胞，并通过ELISA定量IL-6。在这个分析中，IgG1H和2H分别显示了3.92和0.35nM的抑制效价(EC50)(图5)。
体内
在Balb/C小鼠体内，检测了通过IgG1H和2H抑制人IL-1β诱导的IL-6产生。将人IL-1β给予至Balb/c小鼠后，小鼠IL-6得到快速分泌，其可通过ELISA在血清中检测到。
为评估IgG2H的中和效价，用4或20mg/kg的2H或者400μL的PBS经腹腔内注射小鼠。第二天，小鼠接受了人IL-1β或PBS(阴性对照)。注射IL-1β两个小时后采集血样，并通过ELISA测量血清中的IL-6。
结果显示，2H能够在小鼠中以剂量依赖性方式抑制人IL-1β-诱导的IL-6产生(图6)。
实施例4–IgG2H的特异性
通过直接ELISA针对IL-1的两种亚型α和β检测了IgG2H的结合特异性。结果显示，当IgG2H以剂量依赖性方式结合人和小鼠IL-1β二者时，其不能在检测的浓度范围下结合人或小鼠IL-1α(图7)。因此，相对于IL-1α，IgG2H展示了对IL-1β的强选择性。因此，IgG2H对IL-1β具有特异性且不识别IL-1α。
实施例5–IgG2H的亲和力成熟
采用噬菌体展示法对IgG2H进行亲和力成熟，并挑选了在轻链的CDR3区具有突变的5个成熟的克隆，然后在MRC5细胞上进行IL-1β中和分析。
在该分析中，所有成熟的IgG克隆对小鼠和人IL-1β均呈现了高中和效价。相比初始的IgG2H，成熟克隆中和小鼠IL-1β的效率为2-8倍大，且其中和人IL-1β的效率为3-23倍大，其对小鼠细胞因子的效价范围的EC50为158.4-623.2pM(图8)，而对其人等同物的EC50为6.5-45.3pM(图9)。
采用ProteOn生物分析仪(BioRad,Hercules,USA)检测成熟的克隆(除了P1E8)对小鼠和人IL-1β的亲和力。
结果显示，相比IgG2H，成熟的克隆对小鼠IL-1β的亲和力为3-13倍高，而关于人IL-1β，为8-25倍高(表1)。
表1：相比IgG2H，成熟的克隆对小鼠和人IL-1β的亲和力。
亲和力成熟克隆的序列
将成熟的克隆测序，且其轻链CDR3区的氨基酸序列如表2所示。
表2:每个成熟的克隆的轻链CD3区氨基酸序列。
逆翻译后的轻链CDR3区的相应核苷酸序列如以下所示：>2H
>P1D9
>P1E8
>P1H8
>P2D7
>P2D8
实施例6-P2D7KK的体内效力
P2D7KK的衍生
从5个亲和力成熟的克隆中选择了P2D7，并将其改造为生殖系样抗体，命名为P2D7KK。P2D7KK是通过在重链可变区的75和81位点用赖氨酸残基变换一个精氨酸和一个丝氨酸残基而从P2D7获得的(图10)。
然后在以下4种不同的疾病动物模型中检测了P2D7KK的初步体内效力：(1)CAIA：胶原抗体诱导的关节炎，类风湿性关节炎模型，(2)MSU：尿酸单钠晶体诱导的炎症，模拟痛风的模型，(3)RCC：肾细胞癌生长，以评估IL-1β抗体在肿瘤微环境中抑制肿瘤生长的应用，和(4)痤疮丙酸杆菌：使用痤疮丙酸杆菌的炎性痤疮模型。
CAIA–胶原抗体诱导的关节炎
在Balb/c小鼠中，于第0天通过腹膜内注射1.5mg/只小鼠的抗-胶原抗体混合物，然后在第3天注射25μg的脂多糖(LPS)，以诱导关节炎。
8只小鼠的一个组在第2、5和9天经腹膜内接受了5mg/kg的P2D7KK。按照同样的方案，另一组接受了15mg/kg的P2D7KK，且一个对照组接受了5mg/kg的同种型对照。
结果表明，用P2D7KK处理的小鼠相比注射同种型对照的小鼠具有低得多的关节炎分数(图11)。因此，给予P2D7KK抑制了关节炎的发展。
结果还表明，P2D7KK明显抑制了炎症，因为相比注射了同种型抗体的小鼠，用P2D7KK处理的小鼠没有经历爪肿胀(图12)。
后爪的组织学分析表明，在用P2D7KK处理的小鼠中，关节保持基本上无免疫细胞浸润，而用同种型注射的小鼠的关节是高度炎症反应的位点(图13)。
MSU-尿酸单钠晶体引发的炎症
对六组C57/BL6小鼠经腹腔内注射于200μLPBS中的3mg尿酸单钠，或者对于对照组仅注射PBS。然后给小鼠注射以下物质：
·P2D7KK5mg/kg于300μLPBS中(n＝5)
·P2D7KK15mg/kg于300μLPBS中(n＝4)
·同种型抗体15mg/kg于300μLPBS中(n＝5)
·阿那白滞素30mg/kg于300μLPBS中(n＝5)
·300μLPBS(n＝3,媒介物对照组)
·300μLPBS(n＝5,无MSU对照组)
给予抗体6小时后，选取小鼠并用5mL冷的完全媒介物进行腹膜灌洗。通过流式细胞术计数灌洗液中的嗜中性粒细胞和单核细胞。
结果表明，腹膜内注射MSU诱导了嗜中性粒细胞和单核细胞的募集。和阿那白滞素一样，P2D7KK能够在腹腔中明显降低嗜中性粒细胞(在15和5mg/kg下)和单核细胞(仅在15mg/kg下)的浸润(图14)。
RCC-人肾细胞癌异种移植物
对6-8周龄的雌性SCID小鼠经肌肉内注射2x106RCC4细胞。然后，6只小鼠的一个组于肿瘤接种后第1、3、5、7和9天在肿瘤位点接受了100μg/只小鼠的P2D7KK注射。6只小鼠的另一个组接受了同种型对照抗体。
在第7-17天每2天监测肿瘤生长。
结果表明，P2D7KK明显降低了处理的小鼠中的肿瘤生长(图15)。
痤疮丙酸杆菌-炎性痤疮
C57/BL6小鼠在第-1天和第1天经腹腔内注射了400μg的P2D7KK或同种型对照。在第0天，用108个集落形成单位的痤疮丙酸杆菌在小鼠的右耳进行感染，并在左耳接受PBS。一些对照小鼠没有感染，一些感染了但没有接受任何抗体。
在第2、5和9天评估真皮和表皮中的免疫参数。
结果表明，在第9天，P2D7KK降低了炎症，这通过淋巴结中的细胞数目降低观察到(图16)。不受理论的约束，很可能P2D7KK降低了表皮中的淋巴细胞浸润(图17)。
因此，P2D7KK在4种不同的人疾病模型也即类风湿性关节炎、痛风、肾细胞癌和炎性痤疮中显示了体内效力。
应用
显然，对本领域技术人员来说，在阅读了以上公开的内容后，在不背离本发明的精神和范围下，对本发明进行的各种其他的修改和调整是显而易见的，并且本发明旨在将所有这些修改和调整包括在所附权利要求的范围内。

Claims (43)

1.分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其包含一个或多个结合单元，所述结合单元选自以下结合单元：
(i)结合单元L1，包含SEQIDNO:3的Kabat残基23-35或SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基24-33或它们的变体，所述变体在所述结合单元L1中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(ii)结合单元L2，包含SEQIDNO:3的Kabat残基51-57或SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基49-55或它们的变体，所述变体在所述结合单元L2中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(iii)结合单元L3，包含SEQIDNO:3的Kabat残基92-102或SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基88-96或它们的变体，所述变体在所述结合单元L3中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(iv)结合单元H1，包含SEQIDNO:1的Kabat残基31-35或SEQIDNO:2或14的Kabat残基31-35或它们的变体，所述变体在所述结合单元H1中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(v)结合单元H2，包含SEQIDNO:1的Kabat残基50-66或SEQIDNO:2或14的Kabat残基50-65或它们的变体，所述变体在所述结合单元H2中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；和
(vi)结合单元H3，包含SEQIDNO:1的Kabat残基99-114或SEQIDNO:2或14的Kabat残基98-108或它们的变体，所述变体在所述结合单元H3中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失。
2.如权利要求1所述的分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，包含重链和/或轻链，其中所述重链包含由选自SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或14的核苷酸序列编码的氨基酸序列或者由其组成，且其中所述轻链包含由选自SEQIDNO:3或SEQIDNO:4、15或16的核苷酸序列编码的氨基酸序列或者由其组成。
3.如权利要求1所述的分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其中所述SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基88-96选自以下残基，其由选自SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12或SEQIDNO:13的氨基酸1-9组成。
4.分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其在细胞功能中和检测中以小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于5nM、小于3nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.2nM、小于100pM、小于50pM、小于10pM或小于5pM的IC50值中和IL-1β。
5.如权利要求4所述的分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其中所述IL-1β为人、鼠或猿猴的IL-1β。
6.分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其在细胞抑制检测中以小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于1nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于约300pM、小于约200pM、小于约100pM、小于约50pM、小于约10pM或小于约5pM的IC50值抑制IL-1β诱导的IL-6产生。
7.如权利要求6中所述的分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其中所述IL-1β为人、鼠或猿猴的IL-1β。
8.分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其以小于10nM、小于5nM、小于2nM、小于1nM、小于0.5nM、小于约200pM、小于约100pM或小于约5pM的亲和力(KD值)结合IL-1β。
9.如权利要求8中所述的分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其中所述IL-1β为人、鼠或猿猴的IL-1β。
10.如权利要求6-9中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述结合蛋白包含选自以下结合单元的一个或多个结合单元：
(i)结合单元L1，包含SEQIDNO:3的Kabat残基23-35或SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基24-33或它们的变体，所述变体在所述结合单元L1中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(ii)结合单元L2，包含SEQIDNO:3的Kabat残基51-57或SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基49-55或它们的变体，所述变体在所述结合单元L2中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(iii)结合单元L3，包含SEQIDNO:3的Kabat残基92-102或SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基88-96或它们的变体，所述变体在所述结合单元L3中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(iv)结合单元H1，包含SEQIDNO:1的Kabat残基31-35或SEQIDNO:2或14的Kabat残基31-35或它们的变体，所述变体在所述结合单元H1中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；
(v)结合单元H2，包含SEQIDNO:1的Kabat残基50-66或SEQIDNO:2或14的Kabat残基50-65或它们的变体，所述变体在所述结合单元H2中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失；和
(vi)结合单元H3，包含SEQIDNO:1的Kabat残基99-114或SEQIDNO:2或14的Kabat残基98-108或它们的变体，所述变体在所述结合单元H3中含有至少一个氨基酸替换、插入或缺失。
11.如权利要求4-10中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，包含重链和/或轻链，其中所述重链包含由选自SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或14的核苷酸序列编码的氨基酸序列或由其组成，且其中所述轻链包含由选自SEQIDNO:3或SEQIDNO:4、15或16的核苷酸序列编码的氨基酸序列或由其组成。
12.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述分离的抗原结合蛋白能够特异性结合IL-1β。
13.如权利要求12所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述IL-1β为人、鼠或猿猴的IL-1β。
14.分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其以1pM至5nM的IC50值中和人IL-1β。
15.分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其以100pM至15nM的IC50值中和鼠IL-1β。
16.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，包含或由以下组成：
(iii)由SEQIDNO:1的核苷酸序列编码的重链和由SEQIDNO:3的核苷酸序列编码的轻链；或
(iv)由SEQIDNO:2或14的核苷酸序列编码的重链和由SEQIDNO:4、15或16的核苷酸序列编码的轻链。
17.如前述权利要求中任一项所述的分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其中所述SEQIDNO:4、15或16的Kabat残基88-96选自以下残基，其由选自SEQID9、SEQID10、SEQID11、SEQID12或SEQIDNO:13的氨基酸1-9组成。
18.分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其中所述结合蛋白对人IL-1β具有1-200pM的亲和力(KD)。
19.分离的IL-1β特异性抗原结合蛋白，其中所述结合蛋白对鼠IL-1β具有5-500pM的亲和力(KD)。
20.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述蛋白为抗体。
21.如权利要求20所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体为单克隆、多克隆、双特异性、多特异性或异源缀合的抗体。
22.如权利要求20或21所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体为完全的人抗体。
23.如权利要求20-22中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体为亚型IgG1、亚型IgG2、亚型IgG4或亚型IgG3。
24.如权利要求1-23中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述蛋白为单个可变结构域、结构域抗体、抗原结合片段、免疫有效片段、单链Fv、双价抗体或四价双特异性抗体(Tandab)。
25.如权利要求24所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述片段包含或者由以下组成：(i)由SEQIDNO:1的核苷酸序列编码的重链和由SEQIDNO:3的核苷酸序列编码的轻链；或(ii)由SEQIDNO:2或14的核苷酸序列编码的重链和由SEQIDNO:4、15或16的核苷酸序列编码的轻链。
26.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述蛋白为重组蛋白。
27.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述结合蛋白还包含选自以下的试剂：免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。
28.如权利要求27所述的结合蛋白，其中所述试剂为选自以下的显像剂：放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。
29.如权利要求27所述的结合蛋白，其中所述试剂为选自以下的治疗剂或细胞毒性剂：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环霉素、毒素和细胞凋亡剂。
30.前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，用于治疗癌症、炎性疾病或自身免疫疾病，所述炎性疾病或自身免疫疾病选自：关节炎、炎性肠道疾病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、痛风、糖尿病、葡萄膜炎、冷吡啉相关的周期性综合征和炎性痤疮。
31.权利要求1-29中任一项所述的分离的抗原结合蛋白在制备用于治疗癌症、炎性疾病或自身免疫疾病的药物中的应用，所述炎性疾病或自身免疫疾病选自：关节炎、炎性肠道疾病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、痛风、糖尿病、葡萄膜炎、冷吡啉相关的周期性综合征和炎性痤疮。
32.组合物，其包含权利要求1-29中任一项所述的抗原结合蛋白和药学上可接受的载体。
33.如权利要求32所述的组合物，还包含一种或多种治疗剂。
34.分离的细胞系，其能够产生权利要求1-29中任一项所述的抗原结合蛋白。
35.分离的核酸分子，包含选自SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或14或它们的片段的序列或者由其组成。
36.分离的核酸分子，包含选自SEQIDNO:3或SEQIDNO:4、15或16或它们的片段的序列或者由其组成。
37.如权利要求35或36所述的分离的核酸分子，其中所述片段包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成，其与SEQIDNO:1、2、14、3、4、15或16具有选自至少50％、至少60％、至少70％、至少80％和至少90％的同一性。
38.载体，包含权利要求35、36或37所述的核酸分子。
39.如权利要求38所述的载体，其中所述载体包含可操作地连接至所述核酸分子的表达调控序列。
40.宿主细胞，包含权利要求35、36或37所述的核酸分子。
41.宿主细胞，包含权利要求38或39所述的载体。
42.制备权利要求1-29中任一项所述的抗原结合蛋白的方法，包括在合适条件下培养权利要求40或41所述的宿主细胞，以及从中回收所述蛋白。
43.治疗癌症、炎性疾病或自身免疫疾病的方法，所述炎性疾病或自身免疫疾病选自：关节炎、炎性肠道疾病、克罗恩氏病、类风湿性关节炎、痛风、糖尿病、葡萄膜炎、冷吡啉相关的周期性综合征和炎性痤疮，其中将权利要求1-29中任一项所述的分离的抗原结合蛋白给予至对象。
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