CN105424935B - 多聚谷氨酰化dnajc7的新应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多聚谷氨酰化DNAJC7在制备肾癌诊断试剂或诊断设备中的应用，属于生物检测技术和医学诊断技术领域。本发明通过将血清中多聚谷氨酰化DNAJC7作为诊断肾细胞癌分子标志物，能够准确地将肾细胞癌患者与健康人群、慢性肾炎及肾结石患者鉴别开来。因此，本发明为快速准确的诊断肾细胞癌，提供了一种客观、准确的评价标准，具有操作简单，成本低，效率高，无副作用的优点。

Description

多聚谷氨酰化DNAJC7的新应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术和医学诊断领域，特别是涉及一种多聚谷氨酰化DNAJC7的新应用，即多聚谷氨酰化DNAJC7在制备肾细胞癌诊断试剂或诊断设备中的应用。

背景技术

肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)的发病率居泌尿系统肿瘤第二位(仅次于膀胱癌)，目前RCC的诊断主要依靠影像学检测以及肾脏组织活检。

但是，一方面目前临床上一些偶发肾癌、小肾癌等病例的影像学特征并不典型，易出现漏诊或良恶性肿瘤鉴别有误的现象；另一方面肾脏穿刺活检诊断RCC的创伤性大，需要严格排除禁忌症。并且，常规方法诊断RCC的成本较高，且组织活检技术操作复杂，易产生副作用。

DNAJC7(DnaJ homolog,subfamily C,member 7)属于热休克蛋白家族成员，由两个N-末端重复结构域和C-末端的DnaJ结构域组成，作为分子伴侣以ATP依赖的方式连接热休克蛋白70和热休克蛋白90,并调节其功能。有研究认为热休克蛋白是癌症发生发展过程中的关键因素，可能作为抗癌药物的靶位点。热休克蛋白也可以参与p53负反馈调节通路，从而增强p53蛋白的稳定性和转录活性，参与肿瘤抑制。但迄今为止，仍然没有关于热休克蛋白及肾细胞癌之间相关性的报道。

发明内容

基于此，本发明提供一种多聚谷氨酰化DNAJC7的新应用，通过检测生物样本中的多聚谷氨酰化DNAJC7含量，可以提示肾细胞癌的存在可能性。

实现上述目的的技术方案如下：

血清中多聚谷氨酰化DNAJC7作为诊断肾细胞癌分子标志物的应用。

本发明还公开了一种多聚谷氨酰化DNAJC7的检测试剂盒，包括有检测血清中多聚谷氨酰化DNAJC7的试剂。

在其中一个实施例中，该检测试剂盒包括：

固定相体系：包括包被于固定相的DNAJC7抗体；

标志物体系：包括直接或间接连接标记示踪物的GT335。

所述GT335为anti-Polyglutamylation Modification mAb，是一种特异的多聚谷氨酸检测抗体，能够与所有的多聚谷氨酰化形式蛋白质结合。

在其中一个实施例中，所述标志物体系中，所述间接连接标记示踪物的GT335由生物素标记的GT335，和链霉亲和素标记的标记示踪物组成。

在其中一个实施例中，所述固定相体系为包被DNAJC7抗体的微孔板，所述标记示踪物为辣根过氧化物酶。可以理解的，也可通过磁性微球等可在特定环境下固定，不被清洗掉的固定相来作为DNAJC7抗体的载体，也可采用其它标记示踪物在化学发光免疫分析方法中反应待测物的含量水平。

本发明还公开了血清中多聚谷氨酰化DNAJC7作为标志物在开发和/或制备具有诊断肾细胞癌用途的产品中的应用。

本发明还公开了检测血清中多聚谷氨酰化DNAJC7的物质在制备肾细胞癌诊断试剂或诊断设备中的应用。

本法明还公开了一种多聚谷氨酰化DNAJC7的检测方法，包括以下步骤

将DNAJC7抗体作为底物包被微孔板，加入待测血清样本、直接或间接连接标记示踪物的GT335，显色后检测各个孔的发光强度，根据发光强度计算得到多聚谷氨酰化DNAJC7的含量。

本发明还公开了一种上述的多聚谷氨酰化DNAJC7的检测方法在制备肾细胞癌诊断试剂或诊断设备中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过对大量肾细胞癌患者手术切除后的肾癌组织和癌旁组织，以及肾细胞癌患者和健康对照组的血清样本的DNAJC7mRNA水平进行了qRT-PCR检测，结果显示没有太大的差异。但是，在免疫沉淀分析中的结果显示肾细胞癌患者血清中多聚谷氨酰化DNAJC7(polyglutamylated-DNAJC7)的含量明显高于健康对照组。本发明人进一步使用生物素标记的GT335检测多聚谷氨酰化DNAJC7的水平后发现，肾癌细胞患者血清中有较强的信号，显著高于对照组(P<0.01)。证明肾癌细胞患者血清中存在polyglutamylated-DNAJC7，而健康人或者肾炎患者血清中几乎不存在，因此，多聚谷氨酰化DNAJC7可以单独作为肾细胞癌的分子标志物，通过检测血清样本中的多聚谷氨酰化DNAJC7含量，能够准确地将肾细胞癌患者与健康人群、慢性肾炎及肾结石患者鉴别开来。

本发明为快速准确的诊断肾细胞癌，提供了一种客观、准确的评价标准，减少一些影像学特征不典型案例误诊的可能，并且无需进行组织活检，具有操作简单，成本低，效率高，无副作用的优点。这也对于临床诊断试剂盒的研制具有极大的应用价值。

附图说明

图1为本发明病例样本选择、分组和实验情况示意图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例所用的部分原料来源为：

DNAJC7抗体：购自Santa Cruz Biotechnology，批号sc-100716。

biotin-GT335：购自AdipoGen,San Diego,California,USA，批号AG-20B-0020B。

strepavidin-HRP：购自Beyotime，批号A0303。

如图1所示，本发明人在临床工作中积累收集了肾细胞癌患者，慢性肾炎患者，肾结石患者和健康人群的血清样本共1585例，经过初步筛查后排除50例样本，其中：21例为其它尿路炎性疾病，17例有其他肿瘤病史，12例为重复入选病例。

将剩余的1535例样本随机分为两部分，作为后续检测分析用。

第一部分包括92例样本，其中包括30例肾细胞癌患者，15例慢性肾炎患者，17例肾结石患者和30例健康人群。用于建立诊断方法和评估标准，为检测人群。

第二部分包括1443例样本，其中包括805例肾细胞癌患者，128例慢性肾炎患者，125例肾结石患者和385例健康人群。用于验证诊断效果，为验证人群。

实施例1

多聚谷氨酰化DNAJC7作为肾细胞癌标志物方法的建立。

将上述第一部分92例的人群中30例肾细胞癌患者手术切除后的肾癌组织和癌旁组织，以及肾细胞癌患者和健康对照组的血清样本中的DNAJC7mRNA水平进行了qRT-PCR检测，方法如下：

使用RNAminiprep kit(LC Sciences,Houston,TX,USA)提取组织和血清样本中的总RNA，用M-MLV逆转录酶(Promega,Madison,WI,US)将RNA逆转录为cDNA。

进一步使用ABI 7300 qPCR系统对上述cDNA进行扩增。引物序列:β-actinforward:5'-GTCACCAACTGGGACGACAT-3'(SEQ ID NO:1),reverse:5'-AGGGATAGCACAGCCTGGAT-3'(SEQ ID NO:2),200bp；CCP6 forward:5'-CGCTTCCGAGTCTGGTTCA A-3'(SEQ ID NO:3),reverse:5'-CCATAGGGGCCATCCCATCT-3'(SEQ ID NO:4),157bp；DNAJC7forward:5'-GGTAATCGAGCAGCCACCTT-3'(SEQ ID NO:5),reverse:5'-CTCTCTGGAAGCTGCGACAT-3'(SEQ ID NO:6),169bp；mRNA水平的定量用β-actin mRNA水平进行标化，计算方法为比较CT法(2^-ΔΔCt,ΔCt＝Ct target-Ct β-actin,ΔΔCt＝ΔCttumor-ΔCt normal)。

结果经统计学的方法统计，显示没有太大的差异，p﹥0.05。

再将上述第一部分92例的人群血清样本中的细胞癌患者和健康对照组的血清样本进行了免疫沉淀分析，方法如下：

从液氮中取出组织样本，每块组织大约取1mm³，加入细胞裂解液进行组织匀浆，10000rpm、4℃离心30min去除细胞碎片。使用Bradford protein assay kit(Bio-Rad,Hercules,CA,US)提取蛋白质并测定其浓度。加入12％SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)gel分离蛋白质，然后转移到PVDF膜上(Beyotime,Beijing,China).5％牛奶封闭2h后，加入anti-CCP6(Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA,US)or anti-β-actin antibody(Sigma-Aldrich,StLouis,MO,USA)进行孵育，4℃过夜。第二天，室温下进一步加入goat anti-Rat IgG(SantaCruz Biotechnology)，孵育2h，然后加入chemiluminescence(ECL；Beyotime)kit去检测蛋白信号。每个样本CCP6蛋白浓度用β-actin进行标化。

结果显示肾细胞癌患者血清中多聚谷氨酰化DNAJC7的含量明显高于健康对照组，p＜0.01。

在上述研究基础上，发明人进行了进一步的实验，将上述第一部分92例的人群血清样本，通过使用GT335抗体进行电化学发光免疫分析(ECLIA)来检测上述不同血清样本的polyglutamylated DNAJC7发光强度。具体方法如下：

1、运用100ng/ml浓度的DNAJC7(Anti-DNAJC7 antibody)抗体作为底物包被96微孔板，每孔加入100μl DNAJC7抗体溶液，加入pH 9.5的碳酸盐缓冲液，室温孵育过夜；清洗微孔板，加入含有1％胎牛血清和1％明胶的磷酸盐缓冲液(pH 7.4),37℃孵育2小时。

2、用PBST清洗微孔板3次，依次加入50μl待测血清样本、浓度为10ng/ml的生物素标记的GT335(biotin-GT335)溶液50μl、浓度为1ng/ml的链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(strepavidin-HRP)溶液50μl，混合均匀，37℃孵育1小时，使血清样本中的多聚谷氨酰化DNAJC7与包被固定于96微孔板的DNAJC7抗体结合，biotin-GT335与多聚谷氨酰化DNAJC7结合，strepavidin-HRP与biotin-GT335结合；清洗微孔板，室温晾干，加入底物显色，再用化学发光仪检测各个孔的发光强度。

由于生物素标记的GT335是一种特异的多聚谷氨酸检测抗体，可以检测到蛋白质中所有的多聚谷氨酰化形式，本次试验通过GT335与抗DNAJC7抗体的结合来检测样本中polyglutamylated-DNAJC7强度。

检测结果如下表所示：

表1.不同血清样本中多聚谷氨酰化DNAJC7的发光强度(单位为相对光强：RLU)

注：*表示与健康组对比，p<0.01；#表示与健康组对比，p>0.05。

从上述结果中可以看出，肾细胞癌患者血清中存在明显高的多聚谷氨酰化DNAJC7(17309±10274RLU,relative light units),显著高于健康人群(2229±869)、慢性肾炎(2270±523)及肾结石患者组(2339±1111)的发光强度。但是，健康人群、慢性肾炎及肾结石患者组的发光强度没有明显的差别(p>0.05)。

参考上述结果，认为鉴别是否为肾细胞癌的最佳参考范围多聚谷氨酰化DNAJC7发光强度为4122-4200RLU。即当血清中多聚谷氨酰化DNAJC7在检测中的发光强度高于4122-4200RLU(relative light units)，则提示肾细胞癌的存在。

由于上述超过一半的肾细胞癌患者属于早期(TNM I,18/30in 30cases)，使用上述ECLIA方法检测早期RCC患者血清样本中多聚谷氨酰化DNAJC7发光强度。ROC分析证实多聚谷氨酰化DNAJC7作为肿瘤标志物，在鉴别肾细胞癌与非癌(健康人群、慢性肾炎、肾结石)中的敏感度＝83.3％，特异性＝91.9％。

实施例2

将上述第二部分1443例的人群中的血清样本，通过实施例1中的检测方法，检测样本中多聚谷氨酰化DNAJC7的发光强度。

检测结果显示肾细胞癌患者血清中存在明显高的多聚谷氨酰化DNAJC7(15969±8847，平均值±SD),显著高于健康人群(2086±941，平均值±SD)、慢性肾炎(2192±469，平均值±SD)及肾结石患者组(2169±967，平均值±SD)的发光强度。

经ROC分析证实polyglutamylated-DNAJC7作为肾细胞癌标志物，以上述鉴别标准，即发光强度高于4122-4200RLU(relative light units)，则提示肾细胞癌的存在，在鉴别肾细胞癌与非癌(健康人群、慢性肾炎、肾结石)中的敏感度＝94.3％，特异性＝99.1％。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种多聚谷氨酰化DNAJC7的检测试剂盒，其特征在于，包括有检测血清中多聚谷氨酰化DNAJC7的试剂；

该检测试剂盒包括：

固定相体系：包括包被于固定相的DNAJC7抗体；

标志物体系：包括直接或间接连接标记示踪物的GT335；

所述GT335为anti-Polyglutamylation Modification mAb，是一种特异的多聚谷氨酸检测抗体，能够与所有的多聚谷氨酰化形式蛋白质结合。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述标志物体系中，所述间接连接标记示踪物的GT335由生物素标记的GT335和链霉亲和素标记的标记示踪物组成。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述固定相体系为包被DNAJC7抗体的微孔板，所述标记示踪物为辣根过氧化物酶。

4.血清中多聚谷氨酰化DNAJC7作为标志物在开发和/或制备具有诊断肾细胞癌用途的产品中的应用。

5.检测血清中多聚谷氨酰化DNAJC7的物质在制备肾细胞癌诊断试剂或诊断设备中的应用。