CN105412985B - 一种神经导管的制备工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种神经导管的制备工艺，属于生物组织工程支架技术领域，它依次包括依次包括载GDNF明胶微球的制备的制备工艺、明胶‑甲基丙烯酰胺水凝胶的合成工艺、聚己内酯/明胶电纺神经管的制备方法和电纺神经管与载GDNF明胶微球的结合方法。本发明提供了具有良好降解性、生物相容性与生物安全性的支架结构，并通过载GDNF微球控释GDNF，与空白组和胶原管组相比可以有效促进外周神经再生，恢复受损神经的结构和功能，达到与自体移植组相似的恢复效果；一能够桥接缺损的神经，可维持轴突再生环境的稳定，二能阻止外周结缔组织侵入；既能解决较小的神经缺损近远心断端的缝合，也能解决较大的神经缺损的恢复。

Description

一种神经导管的制备工艺
技术领域
本发明涉及生物神经组织工程技术领域，具体涉及是一种神经导管的制备工艺。
背景技术
由于外伤或肿瘤造成的外周神经(peripHeral nervous system， PNS)损伤常导致靶器官功能的永久丧失和神经疼痛，使患者的生活质量显著降低。因此如何修复缺损的神经，恢复靶器官的功能，一直是研究的难点和热点。目前在外周神经损伤修复中主要有以下几个难点：①如何构建一个适合神经再生的微环境；②如何减少神经再生过程中神经元的凋亡和靶器官的萎缩。在临床上较小的神经缺损通常缝合近远心断端的神经外膜来进行修复能取得较好的效果。然而当神经缺损较大时,由于张力过大难以直接缝合。自体神经移植术被认为是修复外周神经缺损、恢复神经结构和功能的“金标准”。但是供体神经的取材有限，和供体区术后的伤口疼痛、功能丧失和疤痕形成限制了自体经移植的应用。
通过自体神经替代物来桥接神经缺损取得了一定的治疗效果。生物可降解材料制备的NGS(nerve guide scaffold，神经导管)，多具有良好的生物相容性和生物安全性，是一种比较理想的神经修复材料。NGS通常由支架材料，种子细胞或生长因子组成。通过选择不同的材料和制作工艺可以调节神经管的尺寸和理化特性。国内外许多研究显示NGS有望构建一种适合神经轴突再生和支持神经细胞增殖、迁移的微环境，从而促进神经的再生和靶器官功能的恢复。
神经导管材料的选择和优化对于神经再生是十分重要的。神经导管应该具备以下功能：①能够桥接缺损的神经；②维持轴突再生环境的稳定，并阻止外周结缔组织侵入；③支架材料能够完全降解使得神经继续再生。多种不同材料制备的神经导管已被用来代替自体神经桥接缺损的神经断端。许多研究证实单独使用支架材料也能起到促进神经修复的作用，但是如果结合生长因子或种子细胞可以取得更好的再生效果。如何将生长因子或种子细胞通过一种方便、高效的方式结合，共同构建一个适合神经生长的微环境是目前研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种神经导管的制备工艺，能提供具有良好降解性、生物相容性与生物安全性的支架结构，还能通过载GDNF微球控释GDNF，与空白组和胶原管组相比可以有效促进外周神经再生，恢复受损神经的结构和功能，达到与自体移植组相似的恢复效果；并能够桥接缺损的神经，可维持轴突再生环境的稳定，并阻止外周结缔组织侵入，并且支架材料电纺纤维管能够完全降解使得神经继续再生；既能解决较小的神经缺损近远心断端的缝合，也能解决较大的神经缺损的恢复。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：
本发明所述的一种神经导管的制备工艺，依次包括载GDNF明胶微球的制备的制备工艺、明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶的合成工艺、聚己内酯/明胶电纺神经管的制备方法和电纺神经管与载GDNF明胶微球的结合方法。
优选地，所述载GDNF明胶微球的制备的制备工艺具体包括如下步骤：
A1.配制质量体积分数为10％的B型明胶水溶液，预热至45℃备用；
A2.将包含1％span80的液体石蜡于45℃水浴20min后，将上述 10mL明胶水溶液缓慢滴入，在45℃水浴条件下磁力搅拌15min形成乳液；
A3.将所述步骤A2所得乳液通过冰浴使乳液迅速降温至4℃，继续磁力搅拌30min后，向上述乳液中加入预冷至4℃的丙酮，保持上述体系温度低于4℃，继续搅拌1h，即形成空白明胶微球一；
A4.将所述步骤A3所得空白明胶微球通过丙酮洗涤3次，乙醚洗涤2次，冷冻干燥24h，即可获得干燥的空白明胶微球二；
A5.称取空白明胶微球二与浓度为10-50mmol/L的EDC丙酮水溶液按空白明胶微球二与EDC的质量比为125:12～60的比例进行混合均匀，在4℃下磁力搅拌2h后在室温下继续搅拌8h，得交联后的空白明胶微球三；
A6.所述步骤A5所得的交联后的空白明胶微球三用超纯水洗3次后，用20μm的滤器过滤获得粒径小于20μm的微球，冷冻干燥24h，得交联后干燥且均匀的空白明胶微球四；
A7.将浓度为8μg/mL，pH值为7.0-7.5的GDNF溶液滴加入空白明胶微球四上，并按体积与质量比为1uL/1mg的比例滴入，然后在4℃下孵育20h后冷冻干燥，即得载GDNF的空白明胶微球。
优选地，所述步骤A1、A2和A3中B型明胶水溶液、液体石蜡和丙酮的体积比为1：5：5。
优选地，所述步骤A5中EDC丙酮水溶液是由一定量的EDC溶液加入到溶剂丙酮的水溶液中混合均匀制成，使得最终EDC的浓度为 10mmol/L，其中丙酮与水的体积比为4:1。
优选地，所述步骤A7中滴加的GDNF溶液的体积小于空白明胶微球四完全溶胀时所需液体的体积，使GDNF溶液完全被空白明胶微球四吸收，此时可认为载药率为100％。
优选地，所述明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶的合成工艺具体包括如下步骤：
B1.将质量体积分数为15％的B型明胶水溶液于50℃水浴1h；
B2.向所述步骤B1所得水浴后质量体积分数为15％的B型明胶溶液中加入适量的甲基丙烯酸酐，获得的溶液继续在50℃下磁力搅拌 1h；
B3.将步骤B2所得磁力搅拌后的溶液用截留分子量为12KDa的透析膜在双蒸水中透析3天，且每8小时更换一次透析液，去除反应副产物—甲基丙烯酸；
B4.将步骤B3所得透析后的溶液于-20℃～-40℃冷冻干燥1天，于-40℃保存备用；
B5.所述步骤B4所得备用的材料在使用时要将冻干后的材料用水溶解为0.15g/mL的工作液。
优选地，所述步骤B2中甲基丙烯酸酐与B型明胶的溶液的体积比为1：400。
优选地，所述聚己内酯/明胶电纺神经管的制备方法具体包括如下步骤：
C1.分别称取一定量的聚己 内酯和B型明胶，将聚己 内酯和B型明胶分别溶于一定体积的三氟乙醇中；
C2.将完全溶解于三氟乙醇中的聚己 内酯和B型明胶混合成均质溶液；
C3.将步骤C2所得均质溶液转入接有注射泵的微量注射器内，注射器的金属注射针头接有15-18KV的高压电源正极，在对侧，一个直径为2cm的不锈钢转轴与电源的负极连接来收集纳米电纺丝；
C4.调节注射针头到转轴的距离为14cm、注射泵的速度为 1mL/h，转轴转速为500-600rpm；
C5.开启高压电源，进行电纺，电纺完成后将制成的聚己内酯/ 明胶电纺神经管在一定时间后通过戊二醛蒸汽交联1.5h，交联后的电纺神经管冷冻干燥24h后，储存于-4℃冰箱备用。
优选地，所述步骤C1中聚己 内酯和B型明胶分别与三氟乙醇按质量比均为1:14。
优选地，所述电纺神经管与载GDNF明胶微球的结合方法具体包括如下步骤：
D1.所述步骤A7所得的载GDNF的空白明胶微球、步骤B5所得的明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶解后的工作液、步骤C5所得交联后的聚己内酯/明胶电纺神经管在紫外灯下消毒12h备用；
D2.将步骤B5所得的明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶解后的工作液在37℃下配置为质量体积分数为15％浓度的水溶液备用；
D3.将步骤A7所得的载GDNF的空白明胶微球与所述步骤D2所得的质量体积分数为15％浓度明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶液按质量与体积比为1mg/11uL的比例混合均匀，制成含有载GDNF的空白明胶微球的明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶液；
D4.向所述步骤D3所得的含有载GDNF的空白明胶微球的明胶- 甲基丙烯酰胺水凝胶溶液中依次加入体积相同的浓度为 600-1100mmol/L的过硫酸铵溶液和浓度为600-1100mmol/L四甲基乙二胺溶液，且过硫酸铵溶液与所述步骤D3中明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶液的体积比为1/22,然后将混合液迅速注入制备好的电纺神经管中，在37℃中反应20min，即可成胶并与电纺神经管相结合，且在最终反应体系中，APS和TEMED的摩尔浓度都为25-50mmol/L，全过程在无菌条件下完成，制成GelMA水凝胶混合载GDNF明胶微球结合的电纺神经管，即最终的神经导管。
本发明的有益效果在于，
(1)本发明通过EDC(可溶于水的碳二亚胺)交联的B型明胶微球可以通过离子聚合的方式结合GDNF(神经胶质细胞源性的神经营养因子)。并能利用载GDNF明胶微球实现GDNF的控制释放。通过 GelMA(明胶-甲基丙烯酰胺)水凝胶将载GDNF明胶微球和电纺纤维管结合制备组织工程化神经导管用于神经组织工程。通过动物实验我们发现，这种新型的复合神经导管除了能提供具有良好降解性、生物相容性与生物安全性的支架结构，还能通过载GDNF微球控释GDNF，与空白组和胶原管组相比可以有效促进外周神经再生，恢复受损神经的结构和功能，达到与自体移植组相似的恢复效果；既能解决较小的神经缺损近远心断端的缝合，也能解决较大的神经缺损的恢复；
(2)本发明中使用APS/TEMED(过硫酸铵溶液/四甲基乙二胺溶液)对明胶-甲基丙烯酰胺(GelMA)水凝胶进行交联，这种交联相对与其它交联方式具有以下优点：①成胶环境温和，在37℃下即可成胶；②交联只针对甲基丙烯酸酯化的明胶，对水凝胶中的其他有机物影响小，如：生长因子、种子细胞等；③APS/TEMED用量少，细胞毒性低。交联后的GelMA水凝胶与明胶相比在体内具有较高的稳定性；
(3)本发明制备的神经导管能够桥接缺损的神经，可维持轴突再生环境的稳定，并阻止外周结缔组织侵入，并且支架材料电纺纤维管能够完全降解使得神经继续再生；
(4)本发明的神经导管由于不含活细胞成分，材料来源充分，成本较低，避免了天然材料来源不足，成本高，改性复杂的缺点，贮存运输简单，且使用的B型明胶是I型胶原蛋白水解的产物，具有良好的生物相容性、无细胞毒性、可完全降解，并且降解产物无毒性，因此国内外许多研究将明胶作为组织工程支架材料。
附图说明
图1是本发明所述方法制备的神经导管的结构示意图；
图中，1、受损神经近心端，2、GelMA水凝胶混合载GDNF明胶微球结合的电纺神经管，3、GelMA水凝胶，4、载GDNF明胶微球，5、受损神经远心端。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施实例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
一种神经导管的制备工艺，依次包括载GDNF明胶微球的制备的制备工艺、明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶的合成工艺、聚己内酯/明胶电纺神经管的制备方法和电纺神经管与载GDNF明胶微球的结合方法。
所述载GDNF明胶微球的制备的制备工艺具体包括如下步骤：
A1.配制质量体积分数为10％的B型明胶水溶液，预热至45℃备用；
A2.将包含1％span80的液体石蜡于45℃水浴20min后，将上述10mL明胶水溶液缓慢滴入，在45℃水浴条件下磁力搅拌15min形成乳液；
A3.将所述步骤A2所得乳液通过冰浴使乳液迅速降温至4℃，继续磁力搅拌30min后，向上述乳液中加入预冷至4℃的丙酮，保持上述体系温度低于4℃，继续搅拌1h，即形成空白明胶微球一；
A4.将所述步骤A3所得空白明胶微球通过丙酮洗涤3次，乙醚洗涤2次，冷冻干燥24h，即可获得干燥的空白明胶微球二；
A5.称取500mg空白明胶微球二与25mL浓度为10mmol/L的EDC 丙酮水溶液混合均匀，在4℃下磁力搅拌2h后在室温下继续搅拌8h，得交联后的空白明胶微球三；所述步骤A5中EDC丙酮水溶液是由一定量的EDC溶液加入到溶剂丙酮的水溶液中混合均匀制成，使得最终 EDC的浓度为10-50mmol/L，其中丙酮与水的体积比为4:1；
A6.所述步骤A5所得的交联后的空白明胶微球三用超纯水洗3次后，用20μm的滤器过滤获得粒径小于20μm的微球，冷冻干燥24h，得交联后干燥且均匀的空白明胶微球四；
A7.将10μl浓度为8μg/mL，pH值为7.4的GDNF溶液滴加入 10mg空白明胶微球四，在4℃下孵育20h后冷冻干燥，即得载GDNF 的空白明胶微球，且滴加的GDNF溶液的体积小于空白明胶微球四完全溶胀时所需液体的体积，使GDNF溶液完全被空白明胶微球四吸收，此时可认为载药率为100％。
值得注意的是，所述步骤A1、A2和A3中B型明胶水溶液、液体石蜡和丙酮的体积比为1：5：5。
所述明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶的合成工艺具体包括如下步骤：
B1.将质量体积分数为15％的B型明胶水溶液于50℃水浴1h；
B2.向所述步骤B1所得水浴后质量体积分数为15％的B型明胶溶液中加入适量的甲基丙烯酸酐，获得的溶液继续在50℃下磁力搅拌 1h；所述步骤B2中甲基丙烯酸酐与B型明胶的溶液的体积比为1： 400；
B3.将步骤B2所得磁力搅拌后的溶液用截留分子量为12KDa的透析膜在双蒸水中透析3天，且每8小时更换一次透析液，去除反应副产物—甲基丙烯酸；
B4.将步骤B3所得透析后的溶液于-20℃～-40℃冷冻干燥1天，于-40℃保存备用；
B5.所述步骤B4所得备用的材料在使用时要将冻干后的材料用水溶解为0.15g/mL的工作液。
所述聚己内酯/明胶电纺神经管的制备方法具体包括如下步骤：
C1.分别称取一定量的聚己 内酯和B型明胶，将聚己 内酯和B型明胶分别溶于一定体积的三氟乙醇中；所述步骤C1中聚己 内酯和B 型明胶分别与三氟乙醇按质量比均为1:14；具体为将200mg的聚己内酯(PCL)和明胶分别溶解于2mL的四氟乙烯中；
C2.将完全溶解于三氟乙醇中的聚己 内酯和B型明胶混合成均质溶液；
C3.将步骤C2所得均质溶液转入接有注射泵的微量注射器内，注射器的金属注射针头接有15-18KV的高压电源正极，在对侧，一个直径为2cm的不锈钢转轴与电源的负极连接来收集纳米电纺丝；
C4.调节注射针头到转轴的距离为14cm、注射泵的速度为 1mL/h，转轴转速为500-600rpm；
C5.开启高压电源，进行电纺，电纺完成后将制成的聚己内酯/ 明胶电纺神经管在一定时间后通过戊二醛蒸汽交联1.5h，交联后的电纺神经管冷冻干燥24h后，储存于-4℃冰箱备用。
所述电纺神经管与载GDNF明胶微球的结合方法具体包括如下步骤：
D1.所述步骤A7所得的载GDNF的空白明胶微球、步骤B5所得的明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶解后的工作液、步骤C5所得交联后的聚己内酯/明胶电纺神经管在紫外灯下消毒12h备用；
D2.将步骤B5所得的明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶解后的工作液在37℃下配置为质量体积分数为15％浓度的水溶液备用；
D3.将10mg步骤A7所得的载GDNF的空白明胶微球与110μl所述步骤D2所得的质量体积分数为15％浓度明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶液混合均匀，制成含有载GDNF的空白明胶微球的明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶液；
D4.向所述步骤D3所得的含有载GDNF的空白明胶微球的明胶- 甲基丙烯酰胺水凝胶溶液中依次加入5μl浓度为800mmol/L的过硫酸铵和5μl浓度为800mmol/L四甲基乙二胺，然后将混合液迅速注入制备好的电纺神经管中，在37℃中反应20min，即可成胶并与电纺神经管相结合，且在最终反应体系中，APS和TEMED的摩尔浓度都为 25-50mmol/L，全过程在无菌条件下完成，制成GelMA水凝胶混合载 GDNF明胶微球结合的电纺神经管，即最终的神经导管。如图1所示，所述神经导管的两端分别端接入1mmol/L的受损神经近心端1和受损神经远心端5，所述神经导管的支架材料为电纺纤维管2，其内部载有GelMA水凝胶3混合的载GDNF明胶微球4。
基于上述，本发明通过EDC(可溶于水的碳二亚胺)交联的B 型明胶微球可以通过离子聚合的方式结合GDNF(神经胶质细胞源性的神经营养因子)。并能利用载GDNF明胶微球实现GDNF的控制释放。通过GelMA(明胶-甲基丙烯酰胺)水凝胶将载GDNF明胶微球和电纺纤维管结合制备组织工程化神经导管用于神经组织工程。通过动物实验我们发现，这种新型的复合神经导管除了能提供具有良好降解性、生物相容性与生物安全性的支架结构，还能通过载GDNF微球控释 GDNF，与空白组和胶原管组相比可以有效促进外周神经再生，恢复受损神经的结构和功能，达到与自体移植组相似的恢复效果；既能解决较小的神经缺损近远心断端的缝合，也能解决较大的神经缺损的恢复；本发明中使用APS/TEMED(过硫酸铵/四甲基乙二胺)对明胶-甲基丙烯酰胺(GelMA)水凝胶进行交联，这种交联相对与其它交联方式具有以下优点：①成胶环境温和，在37℃下即可成胶；②交联只针对甲基丙烯酸酯化的明胶，对水凝胶中的其他有机物影响小，如：生长因子、种子细胞等；③APS/TEMED用量少，细胞毒性低。交联后的GelMA水凝胶与明胶相比在体内具有较高的稳定性；本发明制备的神经导管能够桥接缺损的神经，可维持轴突再生环境的稳定，并阻止外周结缔组织侵入，并且支架材料电纺纤维管能够完全降解使得神经继续再生；本发明的神经导管由于不含活细胞成分，材料来源充分，成本较低，避免了天然材料来源不足，成本高，改性复杂的缺点，贮存运输简单，且使用的B型明胶是I型胶原蛋白水解的产物，具有良好的生物相容性、无细胞毒性、可完全降解，并且降解产物无毒性，因此国内外许多研究将明胶作为组织工程支架材料。
实施例2
同实施例1所不同的是，步骤A7中所述10μl浓度为8μg/mL， GDNF溶液的pH值为7.0；步骤D4中向所述步骤D3所得的含有载GDNF 的空白明胶微球的明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶液中依次加入体积相同的过硫酸铵和四甲基乙二胺的浓度均为600mmol/L。
实施例3
同实施例1所不同的是，步骤A7中所述10μl浓度为8μg/mL， GDNF溶液的pH值为7.5；步骤D4中向所述步骤D3所得的含有载GDNF 的空白明胶微球的明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶液中依次加入体积相同的过硫酸铵和四甲基乙二胺的浓度均为1100mmol/L。
由技术常识可知，本发明可以通过其他的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明所包含。

Claims (6)

1.一种神经导管的制备工艺，其特征在于，依次包括载GDNF明胶微球的制备的制备工艺、明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶的合成工艺、聚己内酯/明胶电纺神经管的制备方法和电纺神经管与载GDNF明胶微球的结合方法；
所述载GDNF明胶微球的制备的制备工艺具体包括如下步骤：
A1.配制质量体积分数为10％的B型明胶水溶液，预热至45℃备用；
A2.将包含1％span80的液体石蜡于45℃水浴20min后，将上述10mL明胶水溶液缓慢滴入，在45℃水浴条件下磁力搅拌15min形成乳液；
A3.将所述步骤A2所得乳液通过冰浴使乳液迅速降温至4℃，继续磁力搅拌30min后，向上述乳液中加入预冷至4℃的丙酮，保持上述体系温度低于4℃，继续搅拌1h，即形成空白明胶微球一；
A4.将所述步骤A3所得空白明胶微球通过丙酮洗涤3次，乙醚洗涤2次，冷冻干燥24h，即可获得干燥的空白明胶微球二；
A5.称取空白明胶微球二与浓度为10-50mmol/L的EDC丙酮水溶液按空白明胶微球二与EDC的质量比为125:12～60的比例进行混合均匀，在4℃下磁力搅拌2h后在室温下继续搅拌8h，得交联后的空白明胶微球三；
A6.所述步骤A5所得的交联后的空白明胶微球三用超纯水洗3次后，用20μm的滤器过滤获得粒径小于20μm的微球，冷冻干燥24h，得交联后干燥且均匀的空白明胶微球四；
A7.将浓度为8μg/mL，pH值为7.0-7.5的GDNF溶液滴加入空白明胶微球四上，并按体积与质量比为1uL/1mg的比例滴入，然后在4℃下孵育20h后冷冻干燥，即得载GDNF的空白明胶微球；
所述明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶的合成工艺具体包括如下步骤：
B1.将质量体积分数为15％的B型明胶水溶液于50℃水浴1h；
B2.向所述步骤B1所得水浴后质量体积分数为15％的B型明胶溶液中加入适量的甲基丙烯酸酐，获得的溶液继续在50℃下磁力搅拌1h；
B3.将步骤B2所得磁力搅拌后的溶液用截留分子量为12KDa的透析膜在双蒸水中透析3天，且每8小时更换一次透析液，去除反应副产物—甲基丙烯酸；
B4.将步骤B3所得透析后的溶液于-20℃～-40℃冷冻干燥1天，于-40℃保存备用；
B5.所述步骤B4所得备用的材料在使用时要将冻干后的材料用水溶解为0.15g/mL的工作液；
所述聚己内酯/明胶电纺神经管的制备方法具体包括如下步骤：
C1.分别称取一定量的聚己 内酯和B型明胶，将聚己 内酯和B型明胶分别溶于一定体积的三氟乙醇中；
C2.将完全溶解于三氟乙醇中的聚己 内酯和B型明胶混合成均质溶液；
C3.将步骤C2所得均质溶液转入接有注射泵的微量注射器内，注射器的金属注射针头接有15-18KV的高压电源正极，在对侧，一个直径为2cm的不锈钢转轴与电源的负极连接来收集纳米电纺丝；
C4.调节注射针头到转轴的距离为14cm，注射泵的速度为1mL/h，转轴转速为500-600rpm；
C5.开启高压电源，进行电纺，电纺完成后将制成的聚己内酯/明胶电纺神经管在一定时间后通过戊二醛蒸汽交联1.5h，交联后的电纺神经管冷冻干燥24h后，储存于-4℃冰箱备用；
所述电纺神经管与载GDNF明胶微球的结合方法具体包括如下步骤：
D1.所述步骤A7所得的载GDNF的空白明胶微球、步骤B5所得的明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶解后的工作液、步骤C5所得交联后的聚己内酯/明胶电纺神经管在紫外灯下消毒12h备用；
D2.将步骤B5所得的明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶解后的工作液在37℃下配置为质量体积分数为15％浓度的水溶液备用；
D3.将步骤A7所得的载GDNF的空白明胶微球与所述步骤D2所得的质量体积分数为15％浓度明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶液按质量与体积比为1mg/11uL的比例混合均匀，制成含有载GDNF的空白明胶微球的明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶液；
D4.向所述步骤D3所得的含有载GDNF的空白明胶微球的明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶液中依次加入体积相同的浓度为600-1100mmol/L的过硫酸铵溶液和浓度为600-1100mmol/L四甲基乙二胺溶液，且过硫酸铵溶液与所述步骤D3中明胶-甲基丙烯酰胺水凝胶溶液的体积比为1/22,然后将混合液迅速注入制备好的电纺神经管中，在37℃中反应20min，即可成胶并与电纺神经管相结合，且在最终反应体系中，APS和TEMED的摩尔浓度都为25-50mmol/L，全过程在无菌条件下完成，制成GelMA水凝胶混合载GDNF明胶微球结合的电纺神经管，即最终的神经导管。
2.根据权利要求1所述的一种神经导管的制备工艺，其特征在于，所述步骤A1、A2和A3中B型明胶水溶液、液体石蜡和丙酮的体积比为1：5：5。
3.根据权利要求1所述的一种神经导管的制备工艺，其特征在于，所述步骤A5中EDC丙酮水溶液是由一定量的EDC溶液加入到溶剂丙酮的水溶液中混合均匀制成，使得最终EDC的浓度为10mmol/L，其中丙酮与水的体积比为4:1。
4.根据权利要求1所述的一种神经导管的制备工艺，其特征在于，所述步骤A7中滴加的GDNF溶液的体积小于空白明胶微球四完全溶胀时所需液体的体积，使GDNF溶液完全被空白明胶微球四吸收，此时可认为载药率为100％。
5.根据权利要求1所述的一种神经导管的制备工艺，其特征在于，所述步骤B2中甲基丙烯酸酐与B型明胶的溶液的体积比为1：400。
6.根据权利要求1所述的一种神经导管的制备工艺，其特征在于，所述步骤C1中聚己内酯和B型明胶分别与三氟乙醇按质量比均为1:14。
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