CN105412123B

CN105412123B - 布地奈德联合三唑类抗真菌药物的应用及其产品

Info

Publication number: CN105412123B
Application number: CN201510753280.8A
Authority: CN
Inventors: 孙淑娟; 李秀云; 刘伟国; 赵霞; 时银萍
Original assignee: Shandong Qianfoshan Hospital
Current assignee: Shandong Qianfoshan Hospital
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2018-03-13
Anticipated expiration: 2035-11-06
Also published as: CN105412123A

Abstract

本发明公开了一种布地奈德联合三唑类抗真菌药物的应用及其产品，BUD分别与FLC、ITR、VRC联合应用时，可以增强三唑类抗真菌药物对耐药CA的抗菌活性，可以产生协同抗真菌作用，并能够逆转耐药CA对三唑类抗真菌药物的耐药性，为新药的开发及老药新用提供了研究方向。对FLC、ITR、VRC共同耐药的CA，联合用药可使其最低抑菌浓度明显降低，32μg/mL的BUD与1μg/mL的FLC合用、64μg/mL的BUD与0.0313～0.125μg/mL的ITR合用及64μg/mL的BUD与0.0313～0.0625μg/mL的VRC合用均可以杀灭80％以上的真菌，浓度再增大，效果更强。

Description

布地奈德联合三唑类抗真菌药物的应用及其产品

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及布地奈德联合三唑类抗真菌药物的应用及其产品。

背景技术

近年来，随着获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者的增多以及广谱抗菌药物的广泛应用，器官移植技术和导管技术等医疗技术的开展，侵袭性真菌感染的发病率和病死率逐年上升，特别是曲霉属和念珠菌属引起的感染，患者的生存率分别不足30％和70％。念珠菌感染对临床的威胁虽然没有曲霉菌感染所造成的威胁大，但由于这类真菌容易出现药物外排增强与基因靶位改变(如ERG11)等，使得对唑类抗真菌药物敏感的念珠菌不断出现耐药性，这给临床抗真菌感染带来极大的挑战。数据表明，AIDS患者晚期感染真菌后，超过三分之一耐药，对唑类药物耐药率更是高达65％。其中念珠菌尤其是白色念珠菌(Candidaalbicans，CA)，是呼吸系统、血流感染、消化系统、泌尿系统真菌感染的常见分离菌。根据美国院内感染控制组织的资料显示，CA是第4位引起院内血流感染的病原微生物，是死亡率最高的致病菌，死亡率可高达40％。CA血流感染的高死亡率也与其耐药现象的不断出现有关。新药研究与联合用药研究均是解决真菌耐药的途径。由于联合用药前期投入少、效果显著，受到国内外研究者的广泛关注。联合用药研究包括两种抗真菌药联合及非抗真菌药与抗真菌药联合，由于目前临床可用的抗真菌药物品种有限，且大多价格昂贵、毒副作用明显，使得非抗真菌药物与抗真菌药物的联合应用研究备受关注。三唑类抗真菌药的代表药物有氟康唑(fluconazole,FLC)、伊曲康唑(Itraconazole，ITR)、伏立康唑(Voriconazole，VRC)等，因这类药物相比于两性霉素B和氟胞嘧啶等抗真菌药物抗菌活性更强、毒性更低，因此在抗真菌感染治疗中应用非常广泛，然而近年来也因其大量使用而导致真菌耐药率不断上升。因此，与三唑类抗真菌药的联合抗耐药真菌作用成为近年来的研究的热点。

在临床抗感染治疗过程中，一般感染不用糖皮质激素，因为目前认为糖皮质激素本身无抗真菌作用，且具有免疫抑制作用，担心应用后会引起感染扩散或诱发二重感染。但在临床上布地奈德与抗真菌药物有联合应用的机会：在重症感染时，为了减轻感染造成的炎症反应，通常在抗菌药物“保驾护航”下使用糖皮质激素，并且临床上也的确获得了满意的效果。这样的作用效果，通常被认为是糖皮质激素对抗了感染造成的炎症反应所致。

发明内容

本发明的目的是为了克服目前真菌耐药问题，提供一种布地奈德联合三唑类抗真菌药物的应用及其产品。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

布地奈德联合三唑类抗真菌药物在制备抗真菌产品中的应用。

布地奈德联合氟康唑、伊曲康唑或伏立康唑中的一种以上在制备抗真菌产品中的应用，所述产品为药物。

优选：所述真菌为白色念珠菌。

优选：布地奈德与氟康唑联合应用时的有效浓度配比：氟康唑：布地奈德＝1:32(μg/mL)；布地奈德与伊曲康唑联合应用时的有效浓度配比：伊曲康唑：布地奈德＝1:512～2048(μg/mL)；布地奈德与伏立康唑联合应用时的有效浓度配比：伏立康唑：布地奈德＝1:1024～2048(μg/mL)。

优选：联合应用时布地奈德与氟康唑的最低抑菌浓度为：32μg/mL与1μg/mL。

联合应用时布地奈德与伊曲康唑的最低抑菌浓度为：64μg/mL与0.0313～0.125μg/mL。

联合应用时布地奈德与伏立康唑的最低抑菌浓度为：64μg/mL与0.0313～0.0625μg/mL。

结果表明，大于32μg/mL的布地奈德与大于1μg/mL的氟康唑联合应用、大于64μg/mL的布地奈德与0.0313～0.125μg/mL的伊曲康唑或者大于64μg/mL的布地奈德与0.0313～0.0625的伏立康唑联合应用均有协同抗耐药白色念珠菌作用。

一种抗真菌产品，由布地奈德联合氟康唑、伊曲康唑或伏立康唑制备而成，所述布地奈德与氟康唑联合时的有效浓度配比为氟康唑：布地奈德＝1:32，所述布地奈德与伊曲康唑联合时的有效浓度配比为伊曲康唑：布地奈德＝1:512～2048，所述布地奈德与伏立康唑联合时的有效浓度配比为伏立康唑：布地奈德＝1:1024～2048；布地奈德与氟康唑联合时的最低抑菌浓度为：32μg/mL与1μg/mL，布地奈德与伊曲康唑联合时的最低抑菌浓度为：64μg/mL与0.0313～0.125μg/mL，布地奈德与伏立康唑联合时的最低抑菌浓度为：64μg/mL与0.0313～0.0625μg/mL。

本发明采用耐药白色念珠菌细胞进行研究，利用棋盘肉汤微量稀释法，分别评价不同联合用药组合的联合抗真菌作用。具体内容如下：

A：BUD与三唑类抗真菌药物联合抗耐药CA作用：采用棋盘肉汤微量稀释法测定联合用药时最低有效浓度，以FICI法选择最佳药物组合浓度及评价药物联合用药的作用。此外，为更直观地表现联合用药对耐药CA作用的程度，将联合药敏测定数据用生长百分数差值模型(ΔE)进行了进一步分析。

B：吸入性糖皮质激素是目前控制气道炎症最有效的药物，如果能在抗真菌方面发挥作用，特别是对耐药真菌感染的治疗，意义重大。本研究表明，BUD分别联合应用FLC、ITR、VRC可产生协同抗耐药CA作用，可扩大其应用范围，具有良好的应用前景。

总之，本发明包含BUD分别与FLC、ITR、VRC联合应用产生协同抗耐药CA的作用。上述发现为临床联合用药作为治疗耐药真菌感染的方案提供了思路。

发明人在研究中偶然发现，吸入性糖皮质激素布地奈德虽然自身无抗真菌活性，但与三唑类抗真菌药物联用时具有明显的协同抗真菌作用。BUD与三唑类抗真菌药(FLC、ITR、VRC)联合应用在体外均具有协同抗耐药CA作用，且效果明显。低剂量的BUD可使FLC对耐药CA的MIC值从512μg/mL以上降至1μg/mL、使ITR对耐药CA的MIC值从8μg/mL降至0.0313～0.125μg/mL，使VRC对耐药CA的MIC值从16μg/mL以上降至0.0313～0.0625。因此，糖皮质激素除了能对抗感染对机体引起的炎症反应外，还能对增强三唑类抗真菌药对真菌细胞的抗菌作用、使其在抗感染领域有新的用途。

本发明与现有技术相比，具有以下优点与效果：

1.本发明表明，BUD分别与FLC、ITR、VRC联合应用时，可以增强三唑类抗真菌药物对耐药CA的抗菌活性，可以产生协同抗真菌作用，并能够逆转耐药CA对三唑类抗真菌药物的耐药性，为新药的开发及老药新用提供了研究方向。对FLC、ITR、VRC共同耐药的CA，联合用药可使其最低抑菌浓度明显降低，32μg/mL的BUD与1μg/mL的FLC合用、64μg/mL的BUD与0.0313～0.125μg/mL的ITR合用及64μg/mL的BUD与0.0313～0.0625μg/mL的VRC合用均可以杀灭80％以上的真菌，浓度再增大，效果更强。

2.BUD在临床上广泛应用，其对FLC、ITR、VRC抗真菌的增效作用，可扩大其应用范围，并且降低FLC、ITR、VRC的最低有效抑菌浓度，降低抗真菌药物的用药量，从而降低药物的不良反应的发生，克服临床上真菌耐药问题。

3.真菌耐药机制及其复杂，尚有许多机制仍不是很清楚，如能将布地奈德对三唑类抗真菌药的增敏机制研究透彻，必定能为克服真菌耐药问题提供新的思路。

附图说明

图1.布地奈德与氟康唑联用对抗耐药白色念珠菌CA10作用结果的三维图；

图2.布地奈德与伊曲康唑联用对抗耐药白色念珠菌CA10作用结果的三维图；

图3.布地奈德与伏立康唑联用对抗耐药白色念珠菌CA10作用结果的三维图；

其中：X轴代表三唑类抗真菌药物的浓度,Y轴代表布地奈德的浓度,Z轴代表的是各个药物组合下的ΔE值,高于或低于平面(ΔE＝0)的值分别表示协同或拮抗作用,平面周围的值表示无关作用,图右侧的色彩编码条中,越靠近上端说明协同作用越强。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述。

实施例布地奈德与三唑类抗真菌药物联合抗真菌作用测定

1.材料

1.1药品与试剂

氟康唑(Fluconazole,FLC)，大连美仑生物技术有限公司；

伊曲康唑(Itraconazole，ITR)，大连美仑生物技术有限公司；

伏立康唑(Voriconazole，VRC)，大连美仑生物技术有限公司；

布地奈德(Budesonide，BUD)，大连美仑生物技术有限公司；

科玛嘉念珠菌显色培养基，郑州博赛生物工程有限公司；

TTC-沙保罗培养基，青岛高科技园海博生物技术有限公司；

酵母膏，北京奥博星生物技术有限责任公司；

蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；

葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司；

琼脂粉，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；

PBS磷酸盐缓冲剂，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；

氢氧化钠，国营山东单县有机化工厂，批号940420；

磷酸二氢钾，上海新宝精细化工厂，批号200602132。

二甲基亚砜(DMSO)，国药集团化学试剂有限公司；

RPMI 1640原料药粉，美国GIBCO公司；

3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；

甲萘醌(Menadione)，美国Sigma公司；

XTT(二甲氧唑黄)，南京旋光科技有限公司；

乳酸林格氏液(复方氯化钠溶液)，山东鲁抗辰欣药业有限公司；

丙酮，上海振兴化工一厂，批号200209510；

XTT-甲萘醌溶液的配制：取XTT粉末0.0500g，溶解于100mL已高压灭菌的林格氏液配成0.5mg/mL的溶液,用0.22μm滤膜滤过灭；加入10μL的10mmol/L的甲萘醌丙酮溶液(取甲萘醌0.0860g溶解于5mL丙酮)，使其终浓度为1μmol/L，摇匀，4℃避光保存。

药物溶液：氟康唑用无菌蒸馏水溶解，配成2560μg/mL的储备液，过滤分装；布地奈德用二甲基亚砜溶解，配成2560μg/mL的储备液，分装。所有药液于-20℃冰箱保存，备用。

PBS缓冲液：称取12gPBS磷酸盐缓冲剂至1L容量瓶，加入蒸馏水搅拌使其完全溶解，再加蒸溜水至刻度线，分装到试剂瓶后在121℃下高压灭菌30min，冷却后放4℃冰箱保存。

酵母浸膏－蛋白胨－葡萄糖琼脂培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉10g，加水溶解在500mL锥形瓶中，充分搅拌均匀后121℃灭菌30min，冷却后4℃冰箱保存备用。

RPMI 1640液体培养液：取RPMI 1640(含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)粉末2.08g，加入10％葡萄糖溶液40ml(含糖终浓度2％)及MOPS粉6.906g，加蒸馏水至约为200mL，混合均匀后在22℃用1mol/L的NaOH溶液调pH约为7.0±0.1，临用前用0.22μm混合纤维膜过滤灭菌。

1.2仪器

1.3实验菌株

质控菌株：白色念珠菌ATCC10231，山东大学药理教研室惠赠；

实验菌株：千佛山医院临床分离的白色念珠菌；

菌株鉴定：实验用菌株在科玛嘉念珠菌显色培养基35℃下培养48小时，菌落呈绿色或翠绿色的所有菌株再经山东省疾病预防控制中心微生物研究室以标准微生物学方法鉴定为白色念珠菌。

菌液制备：-20℃下保存的白色念珠菌室温下解冻，接种到TTC-沙保罗琼脂培养基上，35℃培养24h，取发育良好的单一菌落再次接种，35℃培养24h，以保证菌株处于生长期。选取若干单个较大菌落，PBS配制成菌悬液，经涡旋器振荡均匀后以中国细菌浊度标准管比浊，调整样品管与标准管浊度一致，此时白色念珠菌的菌浓度约为1×10⁶CFU/mL，系列稀释即得到工作菌液，并以活菌计数进行浓度验证。

2.内容与方法

2.1布地奈德分别与氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑联合抗耐药白色念珠菌作用测定

根据CLSI M27-A3方案的棋盘法，以RPMI-1640液体培养基稀释药液使其成为4倍工作浓度,筛选BUD分别与FLC、ITR、VRC联合应用的浓度范围,即BUD终浓度为128～2μg/mL，FLC、ITR、VRC的终浓度分别为64～0.125μg/mL、16～0.0313μg/mL、16～0.0313μg/mL。按浓度从低到高的顺序分别吸取FLC、ITR、VRC药液50μL，分别加入96孔平板的第2～11列，按浓度从低到高的顺序吸取BUN药液50μL，分别加入各96孔平板的第G～A行，除第12列外各孔再分别加100μL菌液，其余不足200μL的孔用RPMI-1640培养液补足。其中H1为生长对照，只含菌液不含药物，第12列为空白对照，只含RPMI-1640液体培养基。根据CLSI M27-A3方案的要求，将加FLC的96孔平板置35℃恒温培养箱中培养24h、加ITR和VRC的96孔平板置35℃恒温培养箱中培养48h后，分别用XTT负载2h后以酶标仪测定OD并记录结果。所有实验重复三次。

2.2评价方法与结果判定

2.2.1 Loewe additivity理论

Loewe additivity(LA)理论的基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用，因此将药物单用或联用产生相同药效的浓度(等效位点)进行比较。其分析方法分数抑菌浓度指数法(fractional inhibitory concentration index,FICI)，表述如下：

ΣFIC＝FIC_A+FIC_B＝C_A/MIC_A+C_B/MIC_B

MIC_A和MIC_B分别是药物A和B单用时的最小抑菌浓度，C_A与C_B为两药联用时达到相同药效时各自的浓度。FICI>4为拮抗作用，FICI在0.5与4之间为相加或无关作用，FICI≤0.5定义为协同作用。

2.2.2 Bliss independence理论

Bliss independence(BI)理论是以ΔE(药物各浓度下真菌生长百分率的理论值与实验值之差)为数据分析模型。ΔE模型表述如下：

ΔE＝E_A×E_B-E_comb

其中，E_A为A药单用时真菌的生长率，E_B为B药单用时真菌的生长率，E_comb为A药和B药联用时真菌的生长率。结果分析时，通过ΣSYN与ΣANT，即96孔板中所有正值ΔE和负值ΔE的加和为指标来判断两种药物的相互作用。当ΔE的绝对值<100％时，表示为弱协同或弱拮抗作用；当ΔE的绝对值介于100％与200％之间时，表示为中等协同或拮抗作用，当ΔE的绝对值大于200％时，表示为为强协同或拮抗作用。

3.结果

3.1布地奈德分别与氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑联合抗耐药白色念珠菌作用结果

3.1.1布地奈德分别与氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑联合的最低有效抑菌浓度

各孔中真菌生长百分数的计算方法为：

真菌生长百分数＝(各孔OD值-空白对照孔OD值)/生长对照孔OD值

按上述公式计算平板中各孔真菌生长百分数，取能够抑制真菌生长80％的最低联用药物浓度为判读终点。

BUD分别与FLC、ITR、VRC的联合抗真菌作用时，对耐药白色念珠菌呈现强协同作用，但对白色念珠菌的敏感株和非白色念珠菌来说无协同作用。由于药物联用对CA10和CA16的协同作用非常相似，现只把耐药株CA10在96孔板中的生长百分数实验结果列表如下(表1-3)所示。

表.1.用棋盘表示BUD与FLC的联合用药抗耐药白色念珠菌CA10生长百分率(以FICI法换算的药物最佳作用组合用灰色标出)。

表.2.用棋盘表示BUD与ITR的联合用药抗耐药白色念珠菌CA10生长百分率(以FICI法换算的药物最佳作用组合用灰色标出)。

表.3.用棋盘表示BUD与VRC的联合用药抗耐药白色念珠菌CA10生长百分率(以FICI法换算的药物最佳作用组合用灰色标出)。

3.1.2 FICI模型和ΔE模型评价BUD与三唑类抗真菌药物联用的协同作用

FICI模型的评价指标为FICI值，FICI≤0.5则定义为协同作用。由表4可以看出，各组合的FICI值均小于0.5，表现为较强的协同作用。

ΔE模型的评价指标为ΣSYN与ΣANT，由表4可以看出，各组∑SYN和∑ANT的总和均远远大于200％，表现为强烈的协同作用，其中布地奈德和三唑类抗真菌药物联用对抗CA10的三维图如图1、图2、图3。从图中可以直观的看出不同药物组合均具有强烈的协同作用。此图片与上述数值分析具有一致性。

表.4.以FICI模型和ΔE模型评价布地奈德和三唑类抗真菌药物联合用药抗真菌作用

注解：FLC：氟康唑；ITR：伊曲康唑；VRC：伏立康唑；BUD：布地奈德；MIC：最低抑菌浓度；MIC_A：药物单用时三唑类抗真菌药物的最低抑菌浓度；C_A：药物联用时三唑类抗真菌药物的最低抑菌浓度；MIC_B：药物单用时布地奈德的最低抑菌浓度；C_B：药物联用时布地奈德的最低抑菌浓度；FICI：分数抑菌浓度指数；ΣSYN：96孔板中所有正值ΔE之和；ΣANT：96孔板中所有负值ΔE之和。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种抗真菌产品，其特征是：由布地奈德联合氟康唑、伊曲康唑或伏立康唑制备而成，所述布地奈德与氟康唑联合时的有效浓度配比为氟康唑：布地奈德＝1:32，所述布地奈德与伊曲康唑联合时的有效浓度配比为伊曲康唑：布地奈德＝1:512～2048，所述布地奈德与伏立康唑联合时的有效浓度配比为伏立康唑：布地奈德＝1:1024～2048，所述真菌为白色念珠菌。