CN105407913A - 用于鉴定可用抗egfr药物治疗的食管癌患者的生物标志物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗食管癌患者的方法以及可用抗EGFR作用剂疗法，包括抗EGFR抗体疗法，例如，西妥昔单抗(cetuximab)疗法，治疗的食管癌患者的鉴定和选择。在一些实施方案中，所述药物针对由EGFR和另一ErbB受体家族成员如EfbB2/Her2/neu形成的异二聚体。

Description

用于鉴定可用抗EGFR药物治疗的食管癌患者的生物标志物

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年7月31日提交的国际专利申请号PCT/CN2012/079411的优先权，其在此通过提述以其整体并入。

发明领域

本发明涉及食管癌患者的治疗以及用于使用针对表皮生长因子受体(EGFR)的药物的治疗，如抗EGFR抗体治疗，例如，西妥昔单抗(cetuximab)，的食管癌患者的鉴定和选择。

发明背景

食管癌(ESC)是最致命的癌症之一，其具有低于10％的5年生存率(全国食管-胃癌审查：一项在英格兰和威尔士对患有食管-胃癌的人士获得的护理的审查。第三次年度报告伦敦，NHS信息中心；2010)。现有两种主要的ESC组织学类型：鳞状细胞癌(SCC)和腺癌(ADC)。除手术外,标准的治疗选择为化学放射疗法(CRT)。所有这些都具有有限的效果。食管SCC在中国的部分地区特别流行，且没有有效的靶向疗法。本领域对食管癌的治疗存在需要。

本发明满足了该需要并提供了用于有效治疗食管癌的方法。

发明概要

本发明提供了用于在患者中通过抗表皮生长因子受体(EGFR)作用剂治疗食管癌的方法。

在一些实施方案中，所述方法包括对患者施用有效量的抗EGFR作用剂。在一些实施方案中，所述药物直接靶向EGFR。在一些实施方案中，所述药物靶向EGFR的下游信号传导途径。在一些实施方案中，所述药物是EGFR配体的拮抗剂或抗体，举例来说，表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、HB-EGF、双调蛋白(amphiregulin)、β细胞素、epigen和/或表皮调节素的拮抗剂或抗体。在一些实施方案中，所述药物是小分子。在一些实施方案中，所述药物针对由EGFR和ErbB受体家族的其他成员如EfbB2/Her2/neu形成的异二聚体。在一些实施方案中，所述药物针对由EGFR形成的同二聚体。在一些实施方案中，所述药物是抗EGFR作用剂，其包括抗EGFR抗体疗法，例如，西妥昔单抗。

本发明进一步提供了用抗EGFR作用剂治疗的方法，其中用抗EGFR作用剂进行治疗的患者具有一种或多种EGFR生物标志物。在一些实施方案中，所述抗EGFR作用剂包括抗EGFR抗体。在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体包括西妥昔单抗。

本发明还提拱了用于检测一种或多种EGFR生物标志物存在或不存在以及当一种或多种EGFR生物标志物存在时用抗EGFR作用剂治疗患者。在一些实施方案中，所述抗EGFR作用剂包括抗EGFR抗体。在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体包括西妥昔单抗。

本发明进一步提供用于鉴定抗EGFR作用剂疗法的应答者和/或非应答者患者的方法。在一些实施方案中，所述抗EGFR作用剂包括抗EGFR抗体。在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体包括西妥昔单抗。应答者和非应答者患者通过在从患有食管癌的患者获得的生物样品中检测一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在进行鉴定。根据本方法，一种或多种EGFR生物标志物的存在指示抗EGFR作用剂疗法的应答者，且一种或多种EGFR生物标志物的不存在指示抗EGFR作用剂疗法的非应答者。

本发明还提供了用于确定在患者中用于治疗食管癌的治疗方案的方法。在这方面，所述方法包括在来自患有食管癌的患者的生物样品中检测一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在。一种或多种EGFR生物标志物的存在指示所述患者是抗EGFR作用剂疗法的应答者，且EGFR生物标志物的不存在指示所述患者是抗EGFR作用剂疗法的非应答者。在一些实施方案中,所述抗EGFR作用剂包括抗EGFR抗体。在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体包括西妥昔单抗。当一种或多种EGFR生物标志物存在时，所述患者随后用抗EGFR作用剂疗法进行治疗。

本发明还提供了通过检测在来自接受标准食管癌护理或抗EGFR作用剂疗法的患者的生物样品中一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在用于变更或修改抗EGFR作用剂疗法的治疗方案并基于一种或多种EGFR生物标志物在所述生物样品中的存在或不存在变更和修改治疗方案的方法。在一些实施方案中，所述抗EGFR作用剂包括抗EGFR抗体。在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体包括西妥昔单抗。举例来说，当一种或多种EGFR生物标志物存在时，持续抗EGFR作用剂疗法，而当一种或多种EGFR生物标志物不存在时，终止抗EGFR作用剂疗法。

本发明进一步提供了选择可用抗EGFR作用剂疗法治疗的患有食管癌的患者的方法。这些方法包括检测来自所述患者的生物样品中一种或多种EGFR生物标志物存在或不存在，其中一种或多种EGFR生物标志物的存在指示抗EGFR作用剂疗法的应答者，且EGFR生物标志物的不存在指示抗EGFR作用剂疗法的非应答者。随后选择存在一种或多种EGFR生物标志物的患者用于抗EGFR作用剂疗法的治疗。在一些实施方案中，所述抗EGFR作用剂包括抗EGFR抗体。在一些实施方案中，所述抗EGFR抗体包括西妥昔单抗。

对于本发明的所述方法，所述EGFR生物标志物可以是EGFR基因的活性和/或扩增、EGFR表达、EGFRRNA水平、EGFR活性、EGFR途径激活或EGFR途径信号传导的任何体内或体外指示剂，其与对照组相比时可为增加或减少。在一个实施方案中，EGFR生物标志物包括任何形式的与EGFR活性相关的在DNA、RNA或蛋白质水平的突变，例如，EGFR的激活或基因的扩增。在另一实施方案中，EGFR生物标志物包括直接或间接与EGFR活性相关的任何量度，例如，EGFR的激活或基因的扩增。在另一实施方案中，EGFR生物标志物包括L858R/T790M双突变，插入突变(外显子20:2319-2320AACCCCCAC)以及缺失突变(外显子19:2236-2350)。在另一实施方案中，EGFR生物标志物包括与EGFR活性相关且在有SCC组织学的食管癌背景下的任何生物标志物。在一些实施方案中，所述方法包括检测EGFR的蛋白质表达水平。EGFR的蛋白质表达水平可通过本领域的技术人员已知的任何合适的方法进行确定。在一些实施方案中，所述蛋白质表达水平通过免疫组织化学(IHC)、免疫印迹、蛋白质免疫染色、蛋白质免疫沉淀、免疫电泳、免疫印迹、BCA测定法、分光光度法、质谱法或酶测定法进行确定。

本发明还提供了为确定、评估或监测食管癌的治疗或治疗效力提供有用信息的方法。所述方法包括在来自患者的生物样品中确定一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在，并向实体提供所述一种或多种EGFR生物标志物存在或不存在的确定结果，所述实体基于一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在来提供对治疗或治疗效力的确定或评估。

本发明还提供试剂盒。所述试剂盒包括用于测量生物样品中一种或多种EGFR生物标志物的试剂以及任选的用于使用所述一种或多种EGFR生物标志物的结果来确定食管癌的疗法的说明书。举例来说，一种或多种EGFR生物标志物的存在指示抗EGFR作用剂疗法的应答者，且EGFR生物标志物的不存在指示抗EGFR作用剂疗法的非应答者。

附图简述

图1表明代表性的ESC-SCC对西妥昔单抗的应答。如图所示，小鼠接受1mg的西妥昔单抗或媒介对照(盐水)。

图2表明西妥昔单抗在ESC-SCC模型中的药物动力学效果。用与图1所述相同的作用剂进行单剂量治疗。在所示的时间点收获GA022肿瘤样品用于pERK生物标志物的IHC分析：IHC图像(A)和IHC分数(B)。代表性的照片(400x)展示了在用单剂量治疗的GAM022异种移植中pERK生物标志物的阳性细胞核和细胞质染色。当第一抗体用作为阴性对照的正常兔IgG替代时，无可检测的免疫染色。

图3概括了西妥昔单抗的活性和EGFR的参数。从上至下的小图表明通过ΔT/ΔC值测量的对肿瘤应答的定量、通过基因芯片分析测量的EGFRmRNA表达和EGFR表达。

图4表明代表性的FISH分析。左图：ES110P5，以及右图：患者样品(PA)。

图5的柱状图定量小图，从上至下表明通过ΔT/ΔC值测量的对肿瘤应答的定量、通过基因芯片分析测量的EGFR表达、EGFR基因拷贝数(PICNIC)和EGFR基因拷贝数(PennCNV)。

图6表明对结果的柱状图总结。小图从上至下表明通过ΔT/ΔC值测量的对肿瘤应答的定量、通过基因芯片分析测量的EGFR表达、EGFR基因拷贝数(PICNIC)和EGFR基因拷贝数(PennCNV)。

发明详述

本发明部分是基于抗EGFR作用剂可用于治疗食管癌的发现。此外，其部分上还基于EGFR生物标志物可用作预测性的生物标志物用于确定患者是否会对抗EGFR作用剂疗法应答的发现。相应地，本发明提供了用于治疗食管癌的方法以及用于鉴定适合于用抗EGFR作用剂疗法治疗的食管癌患者的方法。在一些实施方案中，所述药物靶向EGFR。在一些实施方案中，所述药物靶向EGFR下游的信号传导途径。在一些实施方案中，所述药物是EGFR配体的拮抗剂或抗体，举例来说，表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、HB-EGF、双调蛋白、β细胞素、epigen和/或表皮调节素的拮抗剂或抗体。在一些实施方案中，所述药物是小分子。在一些实施方案中，所述药物针对由EGFR和ErbB受体家族的其他成员如EfbB2/Her2/neu形成的异二聚体。在一些实施方案中，所述药物针对由EGFR形成的同二聚体。

本发明提供了在患者中治疗食管癌的方法，其包括对患者施用有效量的抗EGFR作用剂疗法。在一些实施方案中，正在用抗EGFR作用剂治疗的患者具有一种或多种EGFR生物标志物。

在一些实施方案中，本发明提供了在有一种或多种EGFR生物标志物的患者中治疗食管癌的方法，其包括对患者施用有效量的抗EGFR作用剂疗法。在一些其他实施方案中，本发明提供了在有一种或多种EGFR生物标志物的患者中治疗食管癌的方法，其包括对所述患者施用有效量的抗EGFR抗体疗法，例如，西妥昔单抗。

在一些实施方案中，本发明提供了用于在患者中治疗食管癌的方法，其包括检测一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在。当一种或多种EGFR生物标志物存在时，随后用有效量的抗EGFR作用剂疗法对患者进行治疗。

在一些实施方案中，本发明还提供了用于鉴定应答者和非应答者患者的方法，其包括在来自患有食管癌的患者的生物样品中检测一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在。一种或多种EGFR生物标志物的存在指示抗EGFR作用剂疗法的应答者，而一种或多种EGFR生物标志物的不存在指示抗EGFR作用剂疗法的非应答者。

在一些实施方案中，本发明提供了用于确定用于在患者中治疗食管癌的治疗方案的方法。这些方法包括在来自患有食管癌患者的生物样品中检测一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在。一种或多种EGFR生物标志物的存在指示抗EGFR作用剂疗法的应答者，而EGFR生物标志物的不存在指示抗EGFR作用剂疗法的非应答者。当一种或多种EGFR生物标志物存在时，所述方法可进一步包括用抗EGFR作用剂疗法治疗患者。

在一些实施方案中，本发明提供用于变更抗EGFR作用剂疗法的治疗方案的方法。这些方法包括在生物样品中检测一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在，并基于一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在变更所述治疗方案。当一种或多种EGFR生物标志物存在时，持续抗EGFR作用剂疗法且在某些情况下根据医学领域已知的方法进行变更，而当一种或多种EGFR生物标志物不存在时，终止抗EGFR作用剂疗法。

在一些实施方案中，本发明提供了用于选择用抗EGFR作用剂疗法治疗的患有食管癌的患者的方法，其包括在来自患者的生物样品中检测一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在。一种或多种EGFR生物标志物的存在指示抗EGFR作用剂疗法的应答者，且EGFR生物标志物的不存在指示抗EGFR作用剂疗法的非应答者。所述方法进一步提供为用抗EGFR作用剂疗法进行的治疗选择那些存在一种或多种EGFR生物标志物的患者。

一种或多种EGFR生物标志物的存在指示抗EGFR作用剂疗法的应答者。在一些实施方案中，所述一种或多种EGFR生物标志物在抗EGFR作用剂疗法之前进行检测。在一些实施方案中，对所述一种或多种EGFR生物标志物在抗EGFR作用剂疗法的过程中进行检测。在一些实施方案中，对所述一种或多种EGFR生物标志物在抗EGFR作用剂疗法后进行检测。

根据本发明的应答者是展示治疗效力的个体，而非应答者不展现治疗效力。短语“确定治疗效力”或“确定疗法的效力”及其变化可包括任何用于确定疗法为受试体提供益处的方法。术语“治疗效力”及其变化一般通过与疾病相关的一种或多种病征或症状的缓解来指示，且可由本领域的技术人员轻易确定。“治疗效力”还可指通常与标准或非标准的疾病治疗(即，对于癌症治疗的化学疗法或放射疗法)相关的毒性的病征或症状的预防或改善。治疗效力的确定通常是适应症和疾病特异性的，且可包括本领域已知的或已有的用于确定治疗对患者提供有益效果的任何方法。举例来说，治疗效力的证据可包括但不限于疾病或适应症的缓解，对于癌症其可包括但不限于肿瘤大小、肿瘤转移的减少或降低等。此外，治疗效力还可包括受试者整体健康的一般改进，例如但不限于患者生命质量的提高、预测的受试者生存率的增加，抑郁的减少或适应症复发率的减少(缓解时间(remissiontime)的增加)。(参见，例如，Physicians'DeskReference(2010))。

抗EGFR作用剂疗法可包括任何含有一个或多个可增加、减少、消除、增强、延迟、降低或阻断EGFR信号传导途径活性的实体的治疗。在一些实施方案中，所述组合物在DNA水平、转录水平、翻译水平、翻译后水平和/或蛋白质水平直接针对EGFR或EGFR信号传导途径中的一个或多个成员。所述组合物可特异性靶向EGFR或至少靶向EGFR。在一些实施方案中，所述组合物可导致EGFR和/或EGFR信号传导途径中成员的基因阻抑和/或基因沉默，例如，敲低或敲除EGFR和/或EGFR信号传导途径中的成员。在一些实施方案中，所述组合物可修饰EGFR蛋白质活性，如修饰EGFR与其配体结合的活性和/或其诱导下游信号途径的活性。在一些实施方案中，所述药物是EGFR配体的拮抗剂或抗体，举例来说，表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、HB-EGF、双调蛋白、β细胞素、epigen和/或表皮调节素的拮抗剂或抗体。在一些实施方案中，所述药物可靶向EGFR和/或配体并阻断配体-受体结合。在一些实施方案中，所述药物可导致受体和/或配体中的构象变化并降低或失活EGFR介导的细胞信号传导。在一些实施方案中，所述药物针对由EGFR和ErbB受体家族的另一成员如EfbB2/Her2/neu形成的异二聚体，或由两个EGFR分子形成的同二聚体。EGFR信号传导途径被描述于Sechacharyulu等(TargetingtheEGFRsignalingpathwayincancertherapy,ExpertOpinTherTargets,2012January；16(1):15–31.)、Oda等(Acomprehensivepathwaymapofepidermalgrowthfactorreceptorsignaling,MolecularSystemsBiology1:2005.0010),以及DevelopmentEGFRSignalingPathway(PathwayMaps,ThomsonReuters,2012),将其每一篇均在本文以其整体并入用于所有目的。

在一些实施方案中，所述作用剂包括一种或多种例如在DNA、RNA或蛋白质水平抑制或减少EGFR活性的实体。根据本发明，抗EGFR作用剂疗法可包括任何包含一种或多种化学化合物或组合物、生物分子及其组合的抗EGFR疗法。在一个实施方案中，本发明的抗EGFR作用剂疗法是抗EGFR抗体疗法。根据本发明，抗EGFR抗体疗法可包括使用抗EGFR抗体或抗体样治疗剂的任何疗法，所述抗体样治疗剂包括但不限于任何有一个或多个抗EGFRCDR的分子。在一个实施方案中，抗EGFR抗体疗法包括任何获批的抗EGFR抗体，例如，西妥昔单抗(也称为爱必妥(erbitux))或其生物类似物或衍生物，例如，全人抗EGFR抗体等。西妥昔单抗(在北美由ImClone和Bristol-MyersSquibb销售，而在世界其他地区由MerckKGaA销售)是重组的、人/小鼠嵌合单克隆抗体，其阻断表皮生长因子(EGF)受体(EGFR)的激活。西妥昔单抗可通过静脉输注给药用于转移性结肠直肠癌和头颈部癌的治疗。在一些实施方案中，西妥昔单抗配制成pH7.0至7.4的无菌无色液体。在一些实施方案中,西妥昔单抗以2mg/mL的浓度配制成100mg(50mL)或200mg(100mL)。在一些实施方案中，西妥昔单抗配制在单次使用的小瓶中。在一些实施方案中，所述西妥昔单抗配制物包含8.48mg/mL氯化钠、1.88mg/mL磷酸氢二钠七水合物、0.41mg/mL磷酸二氢钠一水合物和注射用无菌水。用于施用西妥昔单抗的方法和配制物为医学领域的技术人员熟知，且任何熟知施用西妥昔单抗的方法、用于西妥昔单抗的剂量给药方案或用于西妥昔单抗的配制物均可考虑与本发明的方法共同使用。使用西妥昔单抗的详细组合物和方法描述于美国专利8075916、7977336、6217866，其每一篇以其整体通过提述并入用于所有目的。

在一些实施方案中，所述抗EGFR作用剂包含小分子。本文所用术语“小分子”指具有小于500MW分子量的分子，其中所述药物是非肽或肽作用剂。在一些实施方案中，所述药物包含蛋白质或多肽。在一些实施方案中，所述药物包含杂交分子。在一些实施方案中，所述药物是抗体。在一些实施方案中，所述药物是抗EGFR抗体。在一些实施方案中,所述药物是抗EGFR配体抗体。在一些实施方案中，所述药物是人源化的抗EGFR配体抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。

在一些实施方案中，所述药物是抗EGFR抗体。在一些实施方案中，所述药物是西妥昔单抗或其功能性变体或衍生物。抗EGFR抗体非限制性的实施例被描述于PCT公开号WO/2011/140151、WO/2007/058823、WO/2011/080209、WO/2010/080463、WO/2012/020059、WO/2011/080209、WO/2011/059762、WO/2011/152525、WO/2011/140254、WO/2010/034441、WO/2011/156617、WO/2005/090407、WO/2013/006547、WO/2008/140493、WO/2011/156617，U.S.专利号5942602、6129915、7723484、7618631、7598350和U.S.专利申请公开号20100166755、20080274114、20130142812、20110158987、20120107234、20110117110、20110287002、20120149879、20120282633、20100009390、20050238640、20060154334、20120231021和20130149299，其每一篇均以其全文并入本文用于所有目的。

对于本发明的方法，EGFR生物标志物可以是EGFR基因扩增、EGFR表达、EGFRRNA水平、组成型活性的EGFR、EGFR活性、EGFR途径激活或EGFR途径信号传导在体内或体外的任何指示剂，与对照组相比时，其全部或者增加或者减少。在一个实施方案中，EGFR生物标志物包括任何形式的与EGFR活性相关的在DNA、RNA或蛋白质水平的突变，例如，EGFR激活或基因扩增。在另一实施方案中，EGFR生物标志物包括与EGFR活性相关的任何直接或间接测量，例如，EGFR激活或基因扩增。在一些实施方案中，EGFR生物标志物包括直接或间接与EGFR活性相关的任何量度，例如，EGFR的激活或基因的扩增。在一些实施方案中，EGFR生物标志物选自EGFR基因扩增、增加的EGFR表达、增加的EGFRRNA水平、组成型活性的EGFR和增强的EGFR途径激活或增强的EGFR途径信号传导。在另一实施方案中，EGFR生物标志物包括L858R/T790M双突变，插入突变(外显子20:2319-2320AACCCCCAC)，缺失突变(外显子19:2236-2350)。在另一实施方案中，EGFR生物标志物包括与EGFR活性相关且在有SCC组织学的食管癌背景下的任何生物标志物。

在一些实施方案中，EGFR基因拷贝数目为至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多的拷贝数。在一些实施方案中，所述增加通过与一个或多个标准水平比较或通过与本领域已知的作为标准水平的水平比较来确定。测量基因扩增、增加的表达、增加的RNA或DNA水平以及确定蛋白质是否为组成型活性的方法为本领域熟知，且任何这样的方法可与本发明共同采用。

本文所用术语“标准水平”或“参照水平”指在特定的受试者群体中代表一个或多个生物标志物的平均的、有代表性的特征或特性的标准化数据或数据集。这些特征或特性包括但不限于转录物丰度、转录物稳定性、转录率、翻译率、翻译后修饰、蛋白丰度、蛋白质稳定性和/或蛋白质的酶活性等。在一些实施方案中，所述特定的受试者群体由约5、约10、约20、约50、约100、约200、约300、约400、约500、约1000、约5000、约10K或更多的个体受试者组成。在一些实施方案中，所有个体受试者都对抗EGFR疗法应答。在一些实施方案中，所有个体受试者都未对抗EGFR疗法应答。

在一些实施方案中，所述方法包括将患者的EGFR生物标志物概况(profile)与源自对抗EGFR作用剂应答的受试者群体的标准水平的EGFR生物标志物概况进行比较，其中如果患者的EGFR生物标志物概况在标准水平的EGFR生物标志物概况之内，确定所述受试者将对抗EGFR作用剂应答。

在一些实施方案中，所述方法包括将患者的EGFR生物标志物概况(profile)与源自对抗EGFR作用剂不应答的受试者群体的标准水平的EGFR生物标志物概况进行比较，其中如果患者的EGFR生物标志物概况在标准水平的EGFR生物标志物概况之内，确定所述受试者将对抗EGFR作用剂不应答。

本文所用语句“患者的EGFR生物标志物概况在标准水平的EGFR生物标志物概况之内”指分析的EGFR生物标志物概况与预先确定的EGFR生物标志物概况相似，举例来说，描述患者EGFR生物标志物的参数与描述预先确定的EGFR生物标志物概况的参数相近，或在预先确定的EGFR生物标志物概况的变化范围内，例如，所述参数在基于构建自描述预先确定的EGFR生物标志物概况的参数的90％的置信区间的变化范围之内。

EGFR生物标志物概况可通过本领域的技术人员已知的任何合适方法确定。在一些实施方案中，生物样品取自受试者并对其进行分析。在一些实施方案中，通常随后对所述生物样品中一种或多种基因表达产物如RNA、mRNA、cDNA、cRNA、蛋白质等的存在进行检测。

在一些实施方案中，直接使用来自生物样品的mRNA通过杂交确定一种或多种基因的表达水平。在一些特定的实施方案中，RNA从生物样品获得。随后使用本领域已知的方法将所述RNA转化成为cDNA(互补DNA)拷贝。在一些特定的实施方案中，所述cDNA用荧光标记或其他可检测的标记进行标记。随后将所述cDNA与包含多个感兴趣的探针的底物进行杂交。感兴趣的探针通常在严格杂交条件下与基因签名的至少一种DNA序列杂交。在某些方案中，所述多个探针能够在杂交条件下与源自基因生物标志物的序列进行杂交。在一些实施方案中，所述条件包括在65℃使用6×SSC(0.9MNaCl、0.09M柠檬酸钠，pH7.4)。所述探针可包含核酸。术语“核酸”涵盖已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接，其可以是合成的、自然存在的和非自然存在的与参照核酸具有相似结合特性，且其以与参照核苷酸相似的方式代谢。这些类似物的实例包括但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、肽-核酸(PNAs)。

在某些情况中，所述探针在长度上为约15至约50碱基对或更多。cDNA杂交的量可通过测试可检测的标记如荧光的存在进行测量。可使用杂交信号的定量为特定患者或多个患者生成用于基因签名中的特定序列或序列集的分数。

包括于本发明保护范围内的是包含在严格杂交条件下与一种或多种生物标志物基因序列杂交的多个序列的DNA阵列或微阵列。包含一个或多个感兴趣的探针的底物的实例是与底物粘附的多个DNA探针。在某些实施方案中，所述底物可包含一种或多种材料如凝胶、硝酸纤维素、尼龙、石英、玻璃、金属、硅石基材料、二氧化硅、树脂、聚合物，等，及上述组合。通常，所述DNA探针包含约10-50bp的接邻DNA。在某些实施方案中，所述探针为约20至约50bp的接邻DNA。在某些实施方案中，本发明涉及包含关于其使用的微阵列指导说明。所述试剂盒可包括含有一种或多种微阵列的容器及关于其使用的指导说明。

可使用能够检测核酸的方法针对一种或多种基因生物标志物的基因表达分析所述生物样品，所述方法包括但不限于PCR(聚合酶链式反应)；RT-PCR(逆转录酶-聚合酶链反应)；定量或半定量PCR，等。在某些实施方案中，基因表达的水平可通过检测所述基因或DNA序列的蛋白质表达产物进行测量。蛋白质产物的水平可使用本领域已知的方法进行测量，其包括使用与特定蛋白质特异性结合的抗体。这些抗体，包括多克隆或单克隆抗体，可使用本领域已知的方法产生。这些抗体还可与固态基质偶联形成抗体芯片或抗体微阵列。抗体或蛋白质微阵列可使用本领域已知的方法生成。

可使用任何合适的蛋白质检测、量化和比较的方法，如那些描述于Tschesche(MethodsinProteinBiochemistry,ISBNWalterdeGruyter,2011,ISBN3110252368,9783110252361)、Goluch等(Chip-baseddetectionofproteincancermarkers,ProQuest,2007,ISBN0549463453,9780549463450)、Speicher(ProteomeAnalysis:InterpretingtheGenome,Elsevier,2004,ISBN0080515304,9780080515304)、Albala等(ProteinArrays,BiochipsandProteomics,CRCPress,2003,ISBN0203911121,9780203911129)、Walker(TheProteinProtocolsHandbook,Springer,2002,ISBN0896039404,9780896039407)、Fung(ProteinArrays:MethodsandProtocols,Springer,2004,ISBN1592597599,9781592597598)和Bienvenut(AccelerationandImprovementofProteinIdentificationbyMassSpectrometry,Springer,2005,ISBN1402033184,9781402033186)，其每一篇通过提述以其整体并入用于所有目的。在一些实施方案中，所述生物标志物的蛋白质表达水平通过免疫组织化学(IHC)、免疫印迹、蛋白质免疫染色、蛋白质免疫沉淀、免疫电泳、免疫印迹、BCA测定法、分光光度法、质谱法或酶测定法进行检测和测量。

对于其他的与生物标志物水平的检测、量化和比较相关的方法，参见，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ed.Ausubel,FrederickM.(2010)；CurrentProtocolsinProteinScienceLast,Ed.Coligan,JohnE.,等(2010)；CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry,Ed.Egli,Martin(2010)；CurrentProtocolsinBioinformatics,Ed.Baxevanis,AndreasD.(2010)以及MolecularCloning:ALaboratoryManual,ThirdEdition,Sambrook,Joseph(2001),其全部通过提述以其全文并入本文。

用于获得生物样品的方法为本领域熟知且可采用标准的用于获得生物样品的任何方法。可使用本发明的方法的生物样品包括但不限于血清、血液、血浆、全血和其衍生物、皮肤、毛发、毛囊、唾液、口腔粘液、阴道粘液、汗液、泪液、上皮组织、尿液、精子(semen)、精液(seminalfluid)、精浆、前列腺液、前射精液(考珀液(Cowper'sfluid))、排泄物、活检组织、腹水、脑脊液、淋巴以及组织提取物的样品或活检样品。(参见，例如，ClinicalProteomics:MethodsandProtocols,Vol.428inMethodsinMolecularBiology,Ed.AntoniaVlahou(2008).)在一个实施方案中，本发明的生物样品包括食管的任何细胞或组织样品，例如，食管癌的原位或循环的或迁移的细胞。在另一实施方案中，本发明的生物样品包括食管的细胞或组织样品的任何提取物或部分或整体组分，例如，食管癌的原位或循环的或迁移的细胞。

在一些实施方案中，适合于通过本发明的方法治疗的患者是亚裔或非洲裔。在一些实施方案中，所述患者为亚裔且展示了一种或多种EGFR生物标志物的存在。在一些实施方案中，所述患者为东亚裔。

在一些实施方案中，治疗的食管癌是食管鳞状细胞癌(SCC)。食管癌通常为产生于食管表皮或表面里层(surfacelining)的癌。多数食管癌落入一种或两种类型：鳞状细胞癌，其在其表现以及与烟草和酒精消耗的相关性上与头颈癌相似，以及腺癌，其经常与胃食管返流疾病和巴雷特食管(Barrett'sesophagus)病史相关。

可使用任何合适的检测来确定癌症的组织学。这些测试和检测包括但不限于，食管癌的通常病征或症状，其包括但不限于食物通过食管和有可能口腔的反向运动(返流)、与进食无关的胸痛、固体或液体吞咽困难、烧心、吐血、声音嘶哑、慢性咳嗽、呃逆、肺炎、骨骼疼痛、进入食管内的出血和体重减轻、病史和身体检查、成像测试、胸部X射线、计算机断层扫描(CT)扫描、磁共振成像(MRI)扫描、正电子发射断层扫描(PET)扫描、骨扫描、痰细胞学、针吸活检、支气管镜检查、支气管内超声、内窥镜食管超声、纵隔镜检查及纵隔切开术、胸腔穿刺、胸腔镜检查、免疫组织化学、分子学测试、验血、吞钡、超声内镜、食道胃十二指肠镜检查(esophaogastroduodenoscopy)(EGD)和活检，或从其衍生的任何合适的方法。

在一些实施方案中，抗EGFR作用剂疗法可与一种或多种化学疗法、放射疗法、化学放射疗法或靶向疗法共同施用。

在一些实施方案中，所述化学疗法包括但不限于长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)、光神霉素(mithramycin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、亚叶酸(folinicacid)和依立替康(irinotecan)。

在一些实施方案中，所述靶向疗法包括但不限于贝伐单抗(bevacizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、厄洛替尼(erlotinib)、帕尼单抗(panitumumab)、索拉非尼(sorafenib)、英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、达利珠单抗(daclizumab)和奥马珠单抗(omalizumab)。

在一些实施方案中，所述放射疗法以约40Gy至约80Gy的剂量施用。在一些实施方案中，剂量为约50Gy至约70Gy，在一些实施方案中，所述剂量为约50Gy至约65Gy。在一些实施方案中，所述放射疗法以约50Gy、约55Gy、约60Gy或约65Gy的剂量施用。

在一些实施方案中，本发明提供为预测、确定、评估或监测用抗EGFR作用剂疗法治疗食管癌的治疗或效力提供有用信息的方法。这些方法包括在来自患者的生物样品中确定一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在，并向实体提供关于一种或多种EGFR生物标志物存在或不存在的信息，所述实体基于一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在来提供对治疗或效力的确定或评估。如果一种或多种EGFR生物标志物存在，所述实体可提供应该使用或应该持续抗EGFR作用剂疗法治疗的确定结果。如果一种或多种EGFR生物标志物不存在，所述实体可提供不应该使用或应该终止抗EGFR作用剂疗法治疗的确定结果。

本发明还提供试剂盒。本发明的试剂盒包括至少一种用于在生物样品中测量一种或多种EGFR生物标志物的试剂以及任选的用于使用一种或多种EGFR生物标志物结果来确定食管癌治疗的说明书。举例来说，一种或多种EGFR生物标志物的存在指示抗EGFR作用剂疗法的应答者，且EGFR生物标志物的不存在指示抗EGFR作用剂疗法的非应答者。

实施例

实施例1：EGFR基因扩增确定ESC对西妥昔单抗的应答

概要

背景：食管鳞状细胞癌(SCC)是致命的恶性肿瘤(malignance)且在中国的部分地区特别流行，其不具有有效靶向疗法的选择。西妥昔单抗已被批准用于治疗表达EGFR的转移性结肠直肠癌(mCRC)和头颈鳞状细胞癌，但未用于食管SCC的检测。

方法：我们评估了西妥昔单抗在一系列源自未接受治疗的食管SCC患者的异体移植(PDX)模型中的抗肿瘤活性，并通过分析(profile)这些模型的基因表达和致癌基因突变鉴定了可确定应答者和非应答者的预测性生物标志物。

发现：在测试的15例食管SCCPDX模型中，其全部在一定程度上对西妥昔单抗应答，其应答率显著高于在其他癌症类型中所见。表达信息分析和拷贝数目的变化分析揭示了应答与EGFR基因扩增和高表达直接相关。该观察结果提示EGFR对该疾病是关键的致癌驱动者。西妥昔单抗可以是食管SCC患者的有效治疗选择且EGFR基因扩增/表达可以是该ESC亚组的预测性生物标志物。有必要进行进一步临床研究来帮助在AC-SCC中扩大西妥昔单抗的适应症。

食管癌(ESC)是最致命的癌症这一，其具有低于10％的5年生存率(全国食管-胃癌审查：一项在英格兰和威尔士对患有食管-胃癌的人士获得的护理的审查。第三次年度报告伦敦，NHS信息中心；2010)。现有两种主要的ESC组织学类型：鳞状细胞癌(SCC)和腺癌(ADC)。除手术外,标准的治疗选择为化学放射疗法(CRT)。所有这些都具有有限的效果。食管SCC在中国的部分地区特别流行，且没有有效的靶向疗法。

西妥昔单抗是一种单克隆抗体，其与EGFR结合并阻断EGFR配体诱导的下游信号传导。食品药品监督管理局(FDA)已批准西妥昔单抗用于治疗在结肠12/13处无激活的KRAS突变的表达EGFR的转移性CRC(mCRC)(CiardielloFandTortoraG.NEnglJMed.2008Mar13；358(11):1160-74)，以及头颈的鳞状细胞癌(SCCHN)(BonnerJA,等LancetOncol.Jan；11(1):21-8)，一种与ESC-SCC相似的癌症类型。已有多项关于西妥昔单抗/化疗剂的组合疗法用于晚期ESC的II期临床试验。已实施了少数一些试验用于在ESC患者中测试西妥昔单抗的活性(OkinesA,等NatRevClinOncol.2011Aug；8(8):492-503)。在一项试验中，与CRT联合治疗了57例ESC癌症患者，其中48例ADC和12例SCC。49/57(70％)在CRT后具有完全的临床应答(SafranH,等IntJRadiatOncolBiolPhys.2008Feb1；70(2):391-5)。在中国的一项包括5例胃癌(GC)和5例ESC-SCC的小型研究中，对于ESC-SCC发现了更好的临床效益，但该样品数目由于太小而无法做出结论(QiuH-j,等JournalofOncology.2012；16(4):294)。SCOPE1，一组用确诊的ESC进行且确定使用或不使用西妥昔单抗的化学放射疗法的2组II/III期试验，目前正在UK进行(HurtCN,等BMCCancer.2011；11:466)。还需对西妥昔单抗对食管SCC进行测试。

源自患者的异种移植模型(PDX)在无任何体外处理的情况下，可反映患者的组织病理学和遗传学谱(DingL,等Nature.2010Apr15；464(7291):999-1005；MarangoniE,等ClinCancerRes.2007Jul1；13(13):3989-98；NematiF,等ClinCancerRes.2010Apr15；16(8):2352-62；NematiF,等Anticancerdrugs.2010Jan；21(1):25-32；FichtnerI,等ClinCancerRes.2008Oct15；14(20):6456-68；andHennesseyPT,等PLoSOne.2011；6(5):e20584)。其具有改进的临床前癌症模型预测能力且使得用于靶向疗法的预测性生物标志物得以发现。由于癌症患者群体的广泛多样性，临床试验的成功很大程度上依赖于纳入表达预期的靶且具有正确基因谱的很可能的应答者，以及排除非应答者。较大的PDX模型集合可能潜在反映患者中肿瘤的多样性，且因此可通过模拟临床试验模式用于检测调查研究的靶向药物。

建立了被称为ESC模型的较大ESCPDX集合。在15例源自未接受过治疗的食管SCC患者的异种移植(PDX)模型群体中评估西妥昔单抗的抗肿瘤活性，并通过分析这些模型的基因表达和致癌基因突变鉴定了确定应答者和非应答者的预测性生物标志物。因此这些数据提示西妥昔单抗可以是用于ESC-SCC患者(包括来自东亚的特定患者)的新型有效治疗选择。

材料和方法

患者肿瘤样品和免疫损伤小鼠中的植入。手术取出的新鲜ESC-SCC肿瘤组织在术后立刻用于植入免疫损伤的小鼠。其他人已广泛描述了皮下植入(MarangoniE,等Clin癌Res.2007Jul1；13(13):3989-98)。简言之，肿瘤被切成3x3x3mm³片段并在小鼠的胁上皮下接种(Balb/c裸鼠，6-8周龄，雌性，BeijingHFKBioscienceCo.Ltd.,Beijing,China)。每周两次对肿瘤的生长进行监测。建立的来自这些患者样品的肿瘤模型被称为0代或P0，当肿瘤大小达到500-700mm³时(1/2长x宽²)对其进行系列的重新植入，称为P1、2、3…(<10)代，并实施研究(药理学、组织病理学、免疫组织化学、细胞学和分子学的分析)。患者样品的获取和使用通过北京肿瘤医院伦理委员会许可和患者的知情同意。所有的过程都在无菌条件下实施。所有参与本研究的实验动物都严格按照美国国立卫生研究院的实验动物的护理和使用指南的建议进行操作。

在PDX模型中肿瘤对西妥昔单抗应答的评估。当肿瘤体积达到100-150mm³时，小鼠被随机分组至具有相似平均肿瘤体积的两组，每组5只。第一组在分组后立刻用媒介对照进行治疗(PBS,每周IP注射，持续两周)，而第二组用西妥昔单抗(每周IP注射，持续两周，1mg/小鼠，由BMS馈赠)。每周两次对肿瘤生长进行监测，并对％ΔT/ΔC值进行计算用于评价肿瘤对西妥昔单抗的应答(ΔT＝治疗组中肿瘤体积的变化且ΔC＝对照组中肿瘤体积的变化)。

模型肿瘤的突变分析。实施了致癌基因热点分析以在肿瘤中鉴定突变。简言之，从组织中使用DNeasy迷你试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)按照产品说明书提取基因组DNA。将所有DNA样品在50μL的反应中进行PCR扩增。所有详细的引物信息都描述于增补信息中。在50μL反应混合物中实施了40个循环的聚合酶链式反应，该混合物包含：100ng基因组DNA，5μL10XPCR缓冲液，0.2μM每种引物，0.2mM4XdNTPs和1μLTaqE。将扩增的PCR产物进行凝胶纯化并通过Sanger自动测序仪(ABI)测序。用BioEdit软件分析数据。对于EGFR基因热点分析，所述引物为：EGFR-外显子19-F:5-GTGCATCGCTGGTAACATCCA-3(SEQIDNO:1)；EGFR-外显子19-R:5-GGAGATGAGCAGGGTCTAGAGCA-3(SEQIDNO:2)；EGFR-外显子20-F:5-CGCATTCATGCGTCTTCACC-3(SEQIDNO:3)；EGFR-外显子20-R:5-CTATCCCAGGAGCGCAGACC-3(SEQIDNO:4)；EGFR-外显子21-F:5-TGGCATGAACATGACCCTGAA-3(SEQIDNO:5)；EGFR-外显子21-R:5-CAGCCTGGTCCCTGGTGTC-3(SEQIDNO:6)。对于KRAS热点分析，所述引物为：KRAS-外显子2-F:5-TTATGTGTGACATGTTCTAAT-3(SEQIDNO:7)；KRAS-外显子2-R:5-AGAATGGTCCTGCACCAGTAA-3(SEQIDNO:8)；KRAS-外显子3-F:5-TCAAGTCCTTTGCCCATTTT-3(SEQIDNO:9)；KRAS-外显子3-R:5-TGCATGGCATTAGCAAAGAC-3(SEQIDNO:10)；KRAS-外显子4-F:5-TTGTGGACAGGTTTTGAAAGA-3(SEQIDNO:11)；KRAS-外显子4-R:5-AGAAGCAATGCCCTCTCAAG-3(SEQIDNO:12)。PI3K-外显子1，F:5’-CTCCACGACCATCATCAGG-3’(SEQIDNO:13)R:5’-GATTACGAAGGTATTGGTTTAGACAG-3’(SEQIDNO:14)。PI3K-外显子9，F:5’-GATTGGTTCTTTCCTGTCTCTG-3’(SEQIDNO:15)，R:5’-CCACAAATATCAATTTACAACCATTG-3’(SEQIDNO:16)，PI3K-外显子20:F:5’-TGGGGTAAAGGGAATCAAAAG-3’(SEQIDNO:17)，R:5’-CCTATGCAATCGGTCTTTGC-3’(SEQIDNO:18)。c-MET-外显子14，F:5’-TGGGCACTGGGTCAAAGTCTC-3’(SEQIDNO:19)，R:5’AACAATGTCACAACCCACTGAGGTA-3’(SEQIDNO:20)。c-MET-外显子16，F:5’-ATTAAATGTTACGCAGTGCTAAC-3’(SEQIDNO:21)，R:5’-GGTTGCAAACCACAAAAGTAT-3’(SEQIDNO:22)。c-MET-外显子17，F:5’-GTATTCACTGTTCCATAATGAAGT-3’(SEQIDNO:23)，R:5’GATGGCTGGCTTACAGCTAGTT-3’(SEQIDNO:24).c-MET-外显子18，F:5’-AACAGTAGATGCTTAGTTTATGCT-3’(SEQIDNO:25)R:5’-AACAGATTCCTCCTTGTCACTT-3’(SEQIDNO:26).c-MET-外显子19，F:5’-TTCTATTTCAGCCACGGGTAAT-3’(SEQIDNO:27)，R:5’-ATGAAAGTAAAAGAGGAGAAACTC-3’(SEQIDNO:28).c-MET-外显子21，F:5’-CACCCTAAAGCCGAAATGCG-3’(SEQIDNO:29)，R:5’-CAAGGAGCAAAGAATATCGATGGC-3’(SEQIDNO:30).AKT-外显子3，F:5’-ACATCTGTCCTGGCACAC-3’(SEQIDNO:31)，R:5’-GCCAGTGCTTGTTGCTTG-3’(SEQIDNO:32).BRAF-外显子15，F:5’-CTCTTCATAATGCTTGCTC-3’(SEQIDNO:33)，R:5’-GTGAATACTGGGAACTATG-3’(SEQIDNO:34).ERK-外显子2，F:5’-ACTTTACCAACTTGCCTTCT-3’(SEQIDNO:35)，R:5’-TCACAACAAACCATCCCT-3’(SEQIDNO:36).ERK-外显子8，F:5’-TGCCTTACCCATAAC-3’(SEQIDNO:37)，R:5’-GGACCTTGAGGAACATAAT-3’(SEQIDNO:38)。

肿瘤载片的pERK-IHC和pEGFR-IHC染色。在本研究中使用了标准免疫组织化学步骤。简言之，按照标准组织学流程，将肿瘤组织在10％中性缓冲的福尔马林中固定并包埋于石蜡中。脱石蜡和再水合后，在95℃于pH6.0的0.01M柠檬酸钠溶液中将3μm厚的组织切片预处理30分钟，随后用兔抗人pERK(CellSignaling,Boston,USA)或pEGFR(Epitomics,Burlingame,USA)抗体染色。使用UltraVisionLPlargeVolumeDetectionSystemHRPPolymer(即用型)试剂盒(LabVision,Fremont,CA)检测阳性染色。将DAB用作发色底物，且将切片用吉尔苏木精(Gill’sHematoxylin)(FisherScientific,FairLawn,USA)进行反向染色。随后由三个研究者独立地以盲的方式对测试的样本根据下列标准计分。强度计分：0，无染色；1+，最小染色；2+，中等染色；3+，强染色。强度最大的区域在低倍镜(×100)下通过扫描肿瘤切片鉴定，且随后使用带DP71数码照相机(Olympus,Melville,NY)的OlympusBX51显微镜系统在高倍放大(×400)下对图像进行拍照。

CFISH分析。按照产品说明使用AbbottPathVysionEGFRDNA探针试剂盒实施FISH(双色)步骤(Abbott,DownersGrove,IL)。光谱橙色荧光团标记的EGFR(303kb)特异性针对染色体7p12上的EGFR基因座，且光谱绿色荧光团标记的染色体计数探针(5.4kb)靶向位于染色体7的着丝粒区域的α-卫星DNA序列(CEP7；7p11.1–q11.1)。简言之，将FFPE切片脱石蜡，随后用胃蛋白酶消化并杂交。将处理的载片变性并用探针杂交，随后用15μLDAPI/抗褪色溶液反向染色并用装备有单带通滤波器的OLYMPUSBX51荧光显微镜(OLYMPUSBX51,Japan)在1000x扫描来检测DAPI、罗丹明(7p12)和FITC(染色体7)。

表达信息分析和基因拷贝数的确定。从带有肿瘤的小鼠收集新鲜的肿瘤组织，快速冷冻并在用于遗传和基因组分析前保存于-80℃。对于基因信息分析，从冷冻组织中按照产品说明书用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA)分离总RNA，并用RNeasy迷你柱(Qiagen)进行纯化。在Bioanalyzer(Agilent)上评估RNA质量。仅将具有高质量(RIN>8)的RNA样品按照标准步骤(3’IVTExpressKitUserManual,Affymetrix,P/N702646Rev.8)用于在AffymetrixHG-U219阵列板上的表达信息分析实验。所有样品的原始CEL数据集通过RMA算法标准化。探针集强度以Log(2)转化值表示。对于使用AffymetrixSNP6.0芯片的SNP/CNV实验，分离基因组DNA并按照产品说明使用基因组DNA组织和血液分离试剂盒(Qiagen)纯化。按标准Affymetrix步骤(Genome-WideHumanSNPNsp/Sty6.0UserGuide,Affymetrix,P/N702504,Rev4)实施DNA加工和芯片杂交。对原始CEL数据进行质量检查并过滤去除低判读率(lowcall-rate)样品，并通过PICNIC(PredictingIntegralCopyNumbersInCancer,seeGreenman等,PICNIC:analgorithmtopredictabsolutealleliccopynumbervariationwithmicroarraycancerdata,Biostatistics,11(1):164-175,2010)和/或PennCNV方法(Wang等,PennCNV:anintegratedhiddenMarkovmodeldesignedforhigh-resolutioncopynumbervariationdetectioninwhole-genomeSNPgenotypingdataGenomeResearch17:1665-1674,2007)进行基因拷贝数分析，每个参考文献以其整体通过提述并入。对于某些样品，通过qPCR确定相对基因拷贝数。简言之，相同的基因组DNA被用于通过基于SYBRGreen的定量PCR进行的扩增，其使用EGFR特异性引物(EGFR-F:5-CATGGTGAGGGCTGAGGTGA-3(SEQIDNO:39)；EGFR-R:5-CCCCACCAGACCATGAGAGG-3(SEQIDNO:40))。使用哺乳动物LINE-1反转录转座子基因作为参照。在chromo4系统上使用OpticonMonitor3软件对q-PCR数据进行分析来生成原始数据。原始数据随后用ΔCT相对量化方法加工。△CT＝(靶基因的CT值)-(参照基因的CT值)。ΔCT值随后被转化成强度值(POWER(△CT,-2))。将所有数据标准化至具有已知MET拷贝数的样品来获得相对MET拷贝数。

结果

ESC-SCC模型的大亚组对西妥昔单抗应答。通过实施临床试验样研究对食管癌(ESC)模型的大组进行测试用于评估西妥昔单抗针对ESC的潜在活性。首先，通过将从ESC患者中手术取出的肿瘤组织由皮下接种移植入免疫受损的小鼠(Balb/c裸鼠)来建立这些模型。原始的患者诊断以及模型病理确认示于表1，且更多细节被示于表2。建立的模型中的大多数为ESC-鳞状细胞癌(ESC-SCC)。

表1.模型组的概貌

表2.ESC-SCC患者诊断和病理以及模型病理的确认

第二，随后每周一次以1mg/小鼠对这些模型施以西妥昔单抗治疗，持续两周，以评估他们对西妥昔单抗的敏感性。有趣的是，该治疗结果证明了大多数ESC-SCC以高应答率(RR)对西妥昔单抗应答:4/10或40％“完全应答”(CR,定义为ΔT/ΔC<0％)；6/10的部分应答(PR,0％<％ΔT/ΔC<50％)；且无非应答者(NR,50％<0％ΔT/ΔC)。通过ΔT/ΔC值测量的肿瘤应答的量化被总结于表1。模型的代表性抗肿瘤活性也示于图1中。

该观察结果由于多个原因令人感到惊喜。首先，几乎没有可获得的关于ESC-SCC对西妥昔单抗的应答的临床信息；而第二，对西妥昔单抗意外地高的RR与其他在相同治疗条件下评估了PDX模型的癌症类型所观察到的显著较低的对西妥昔单抗的RR的形成鲜明对比，这些癌症类型包括结肠直肠癌(CRC)(ChenD,等CetuximabresponseinAsianCRCpatienet-derivedxenograftsispredictedbyRASpathwayactivationnotKRASmutationstatus.提交中)、胃癌(GC)(Li等，未发表的观察结果)和NSCLC(YangM,等Squamousnon-smallcelllungcancer(NSCLC-SCC)patient-derivedxenografts(PDX)fromAsianpatienthavehighresponserate(RR)tocetuximabthanthosefromnon-SCCpatient.提交中))。多例ESC-SCC对西妥昔单抗的强应答提示EGFR在驱动它们的癌症形成中可能扮演至关重要的角色。因此西妥昔单抗可以是用于ESC-SCC的有效疗法,特别是针对亚洲患者，如东亚患者。

随后通过实施单剂量药物动力学研究对EGFR信号传导是否确实在这些通过西妥昔单抗治疗的肿瘤中失活进行了研究。带有肿瘤的动物用1mg/kg的单剂量西妥昔单抗进行治疗，且在不同时间点收获肿瘤(给药后2、6和24小时)。通过IHC染色检测组织的pEGFR，以及pERK和pAKT，两个关键下游信号传导生物标志物。ES110IHC分析的代表性实例示于图2A(图像)和2B(分数量化)。该结果清楚表明所有这些信号传导生物标志物的降低。

EGFR基因扩增和/或过表达在展示最强应答的ESC-SCC亚组中似乎是强致癌驱动者。虽然几乎所有测试的ESC-SCC模型目前都证实了应答，但所述应答的程度有很大变化，且因此表明在模型中的遗传变异可能控制了所述应答。因此对在这些模型中可能控制了观察到的应答的遗传和基因组生物标志物进行了研究。由于EGFR是对于应答者的治疗靶和明显的致癌驱动者，因此首先致力于对这些模型的EGFR进行研究。

使用IHC，一种临床上通常使用的方法，对EGFR的表达进行了确认。结果表明所有ESC-SCC都在蛋白质水平表达EGFR。接下来，使用AffymetixHG-U219基因芯片分析在mRNA水平对EGFR的表达进行了研究。有趣的是，在所有这些模型中，应答程度全部与EGFR的水平相关(表1和图3)。由于经由更高表达的EGFR的更高活性可能在这些肿瘤中驱动致癌的转化，通过西妥昔单抗的失活可抑制肿瘤生长，因此该观察似乎合理。

此外，还使用AffymetrixSNP6和/或qPCR通过首先检测基因拷贝的变化对在更高的EGFR表达背后的基因缺陷进行了研究。有趣的是，所有应答者/EGFR高表达者都具有相应的EGFR基因扩增(表1和图3)。该观察结果提示EGFR基因扩增在应答者中可能是关键的致癌驱动者且在ESC-SCC中是用于预测对西妥昔单抗的应答的潜在实用生物标志物。为进一步确认基因扩增，实施了EGFR-荧光原位杂交或FISH，一种实用的临床测定，来评估所有这些模型的EGFR基因扩增状态。FISH数据确实证实了由SNP6所见的观察结果。举例来说，图3，底部图，描述了GA110FISH分析，清楚表明了EGFR的扩增(图4，左图)。临床上接受的FISH使得在临床上对西妥昔单抗疗法的伴随诊断的开发成为可能。

一个重要的问题是PDX来源的原始肿瘤是否也具有在模型中发现的相同基因扩增，或更高表达。为此，进一步将该患者肿瘤样品与测试的样品共同分析。在所测试的患者样品中，证实了扩增。图4，右图，证明了原始的患者样品也具有EGFR的基因扩增。

此外，对激活突变的多个常见致癌基因包括KRAS、EGFR、AKT、c-met和BRAF等也进行了分析。有意思的是，忽略对西妥昔单抗的应答水平，所测试的模型在测试的致癌基因中，包括KRAS、BRAF、AKT、PI3KC、c-met、c-kit等，没有展示任何激活突变(表1)。

讨论

这些研究清楚证明了从中国患者建立的ESC-SCC模型大多在某种程度上对西妥昔单抗应答。应答的程度与EGFR的基因表达和拷贝数相关。具有基因扩增和升高表达的那些对西妥昔单抗应答显著更佳。该数据因此表明西妥昔单抗可以是对于ESC-SCC患者的有效治疗选择，特别是来自东亚的患者。此外，该数据还支持了EGFR基因扩增可作为预测性生物标志物用于ESC-SCC患者中推定的西妥昔单抗应答者。针对EGFR基因扩增的EGFRFISH测定常规用于临床以及ESC-SCC治疗的伴随诊断。因此，这样的预期试验可轻松实施。临床上的确认可促进西妥昔单抗用于治疗ESC-SCC患者的用途的监管许可，其为ESC-SCC患者提供了第一种靶向疗法。

ESC-SCC模型对西妥昔单抗的应答依赖于EGFR的高表达和高拷贝数，与表达和拷贝数显著作用较低的NSCLC和CRC(ChenD,等，CetuximabresponseinAsianCRCpatient-derivedxenograftsispredictedbyRASpathwayactivationnotKRASmutationstatus,insubmissionandYangM,等Squamousnon-smallcelllungcancer(NSCLC-SCC)patient-derivedxenografts(PDX)fromAsianpatientshavehighresponserate(RR)tocetuximabthanthosefromnon-SCCpatients,insubmission)形成鲜明对比。在ESC-SCC中EGFR过表达(升高的基因拷贝数)-西妥昔单抗应答关系与GC中Her2过表达(升高的基因拷贝数)-曲妥单抗(trastuzumab)应答关系相似。该相似性提供了用于针对ESC-SCC的西妥昔单抗疗法的伴随诊断的清楚可行的开发和监管途径(developmentandregulatorypath)，正如用于曲妥单抗的伴随诊断。

总之，在15例测试的食管SCCPDX模型中，其在某种程度上全部对西妥昔单抗应答，与那些在其他癌症类型中的发现相比伴随显著更高的应答率(RR)。表达概况分析和拷贝数变化分析揭示了所述应答与EGFR基因扩增和高表达直接相关。该数据表明EGFR是针对该疾病的关键癌症驱动者。西妥昔单抗是针对食管SCC患者的治疗选择，且EGFR基因扩增/表达是针对该ESC亚组的预测性生物标志物。

前述内容仅仅说明了本发明的原理。本领域的技术人员将能够设计不同的方案，这些方案虽然未被本文明确阐述或展示，但体现本发明的原理，并且包括在本发明的精神和范围之内。此外，本文记载的所有实施例和条件性语言主要意在使读者理解本发明的原理和由发明者提出的推进技术的概念，且不应该被理解为对这些特定的记载的实施例和条件的限制。

此外，本文记载的原理、方面和本发明的实施方案及其特定实施例的全部声明都意在涵盖其结果上和功能上的等同物。此外，这些等同物意在包括目前已知的等同物和未来发展出的等同物两者，即开发的实施相同功能的任何元素，而无论结构如何。因此本发明的保护范围意在不限于本文所示和描述的示例性实施方案。本发明的保护范围和精神进一步由附加的权利要求体现。

Claims (21)

1.一种用于在患者中治疗食管癌的方法，其包括对所述患者施用有效量的抗EGFR作用剂疗法。

2.权利要求1的方法，其中所述患者具有一种或多种EGFR生物标志物。

3.一种用于在患者中治疗食管癌的方法，其包括检测一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在以及当一种或多种EGFR生物标志物存在时用抗EGFR作用剂疗法治疗患者。

4.一种用于鉴定应答者和/或非应答者患者的方法，其包括在来自患有食管癌的患者的生物样品中检测一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在，其中一种或多种EGFR生物标志物的存在指示抗EGFR作用剂疗法的应答者且EGFR生物标志物的不存在指示抗EGFR作用剂疗法的非应答者。

5.一种用于确定在有需要的患者中用于治疗食管癌的治疗方案的方法，其中包括在来自患有食管癌的患者的生物样品中检测一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在，其中一种或多种EGFR生物标志物的存在指示抗EGFR作用剂疗法的应答者且EGFR生物标志物的不存在指示抗EGFR作用剂疗法的非应答者，且当一种或多种EGFR生物标志物存在时用抗EGFR作用剂疗法治疗所述患者。

6.一种用于变更抗EGFR作用剂疗法的治疗方案的方法，其包括在来自接受抗EGFR作用剂疗法的患者的生物样品中检测一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在并基于一种或多种EGFR生物标志物在所述生物样品中的存在变更治疗方案，其中当一种或多种EGFR生物标志物存在时持续所述疗法。

7.一种选择患有食管癌的患者用于用抗EGFR作用剂疗法治疗的方法，其包括在来自所述患者的生物样品中检测一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在，其中一种或多种EGFR生物标志物的存在指示抗EGFR作用剂疗法的应答者且EGFR生物标志物的不存在指示抗EGFR作用剂疗法的非应答者，并选择存在一种或多种EGFR生物标志物的那些患者用于用抗EGFR作用剂疗法的治疗。

8.权利要求2-7任一项的方法，其中所述EGFR生物标志物选自EGFR基因的扩增、EGFR的表达、EGFRRNA水平、组成型活性的EGFR、EGFR活性、EGFR途径激活或EGFR途径信号传导。

9.权利要求8的方法，其中所述EGFR基因的扩增是与预先确定的参照EGFR基因拷贝数目相比的EGFR基因拷贝数目的增加。

10.权利要求9的方法，其中所述EGFR基因拷贝数目选自至少3、4、5和6个或更多拷贝。

11.权利要求1-11任一项的方法，其中所述患者是亚裔(Asiandescent)。

12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述食管癌是食管鳞状细胞癌。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述抗EGFR作用剂疗法是抗EGFR抗体疗法。

14.权利要求1-12任一项的方法，其中所述抗EGFR作用剂疗法是西妥昔单抗、其生物类似物或衍生物的疗法。

15.权利要求1-12任一项的方法，其中所述抗EGFR作用剂疗法与一种或多种化学疗法、放射疗法、化学放射疗法或靶向疗法共同施用。

16.权利要求15的方法，其中所述化学疗法选自：长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)、光神霉素(mithramycin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、亚叶酸(folinicacid)和依立替康(irinotecan)。

17.权利要求15的方法，其中所述靶向疗法选自：贝伐单抗(bevacizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、厄洛替尼(erlotinib)、帕尼单抗(panitumumab)、索拉非尼(sorafenib)、英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、达利珠单抗(daclizumab)和奥马珠单抗(omalizumab)。

18.一种为确定、评估或监测用抗EGFR抗体疗法对食管癌的治疗或治疗效力提供有用信息的方法，其包括在来自患者的生物样品中确定一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在，并向实体提供所述一种或多种EGFR生物标志物存在或不存在的确定结果，所述实体基于一种或多种EGFR生物标志物的存在或不存在来提供对治疗或效力的确定或评估。

19.一种试剂盒，其包含用于在生物样品中测量一种或多种EGFR生物标志物的试剂以及任选的用于使用所述测量的说明书，其中所述一种或多种EGFR生物标志物的存在指示抗EGFR作用剂疗法的应答者且一种或多种EGFR生物标志物的不存在指示抗EGFR作用剂疗法的非应答者。

20.权利要求7的方法，其中所述方法包括检测EGFR的蛋白质表达水平。

21.权利要求20的方法，其中所述蛋白质表达水平通过免疫组织化学(IHC)、免疫印迹、蛋白质免疫染色、蛋白质免疫沉淀、免疫电泳、免疫印迹、BCA测定法、分光光度法、质谱法或酶测定法进行确定。