CN105400834A - 制备柠檬酸的方法 - Google Patents

Abstract

根据本发明实施例的制备柠檬酸的方法，包括以下步骤：步骤S1：种子培养，将柠檬酸发酵菌种接种到种子培养基中进行培养以得到种子液；步骤S2：发酵产酸，将步骤S1中得到的种子液加入到发酵培养基中进行发酵以生成柠檬酸；其中，所述种子培养基和所述发酵培养基中均包括通式(1)化合物中的至少一种；所述通式(1)化合物中的R为C₁～C₂₀烷基。根据本发明实施例的制备柠檬酸的方法，种子培养基和所述发酵培养基中均包括通式(1)化合物中的至少一种，从而提高柠檬酸生产速率，缩短发酵时间，最终提高柠檬酸产量并降低能耗。

Description

制备柠檬酸的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及发酵工程，尤其涉及一种制备柠檬酸的方法。

背景技术

柠檬酸是目前为止采用生物化学方法生产的产量最大的有机酸，也是世界上应用最广泛的有机酸。因其无毒、具有温和爽快的酸味，水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品工业中，占食品酸味剂用量的60％以上。除了作为重要的食品酸味剂用来改善食品风味外，柠檬酸还兼有抑制微生物生长、护色、改善黏度和流变性等作用，而且在医药、饲料、化工、电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域也都有十分广阔的应用。

目前，全球柠檬酸的年产量约100～120万吨，柠檬酸的年总需求量为105～110万吨，总体的供求状况是供大于求的状态。因此提高产酸率，降低柠檬酸生产成本来增强竞争力已刻不容缓。

利用黑曲霉发酵是生产柠檬酸的主要方式，发酵过程代谢特性表明，氧的消耗速率与产物的合成有着正比例相关性关系，而在发酵过程中，氧由发酵液向菌体内的传递阻力是氧限制的关键。

相关技术中，柠檬酸生产存在的主要问题是在种子培养阶段存在着严重的孢子聚集，这使得孢子形成的有效菌团数明显减少。孢子在静电表面张力的作用下发生聚集，并发芽交织在一起形成菌团，降低了菌体与发酵液的接触面积，阻碍了发酵过程中氧气的传递，大大降低了产物的合成速率。尽管通过增加孢子接种量的方法，但效果并没有显著改善。

另外，在发酵培养阶段，由于菌株好氧发酵过程中需氧量大，特别是发酵中后期，短时间内需氧量很高，而此时由于菌丝体及代谢产物不断增多导致发酵液粘稠，细胞膜通透性降低，不利于氧气的传递，常规的依靠增大通风量或不断提高搅拌转速等方式来提高溶氧有时也不能满足需要。无论是通风量亦或是搅拌转速都有上限，不能无限提高，况且开启程度越大，发酵设备的损坏度以及能耗也越大，使得维修费用和成本增加。另外，通气量过高或转速过快，也容易对菌丝体造成机械损伤。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，本发明的一个目的在于提出一种可以提高柠檬酸的产量并且可以缩短发酵时间的制备柠檬酸的方法。

根据本发明实施例的制备柠檬酸的方法，包括以下步骤：

步骤S1：种子培养阶段

1)种子培养基

自来水与玉米粉按质量比5：2的比例混合，110℃保温并不断搅拌，并加入α-高温淀粉酶，恒温30min，用碘指示剂检验不变蓝，即糖化完全，冷却，回复原来体积，得到玉米粉糖化液；

将玉米粉糖化液经两层纱布过滤得糖化清液；

用盐酸调节pH值到4.5～5.0，在摇瓶中加入玉米粉糖化液，纱布封口，121℃灭菌25min，得种子培养基；

2)种子培养条件

将黑曲霉(2330～2335)菌种按照接种量为5.0×10⁵个孢子接种到种子培养基中，置于旋转式摇床上，在转速160r/min、温度34±1℃的条件下，进行培养22h以得到种子液；

步骤S2：发酵产酸阶段

1)发酵培养基

将玉米粉糖化液与糖化清液按体积比1：5的比例混合；在全自动发酵罐中加入混合后的培养基，添加0.3％(重量百分比)的(NH₄)₂SO₄，调pH值到4.5～5.0，115℃灭菌25min，得到发酵培养基；

2)发酵条件

将步骤S1中得到的种子液加入到发酵培养基中进行发酵以生成柠檬酸，发酵时，在温度为34±1℃下通气培养，采用液氨调节培养基的pH，使pH值维持在4.4～4.8，发酵培养72小时后，发酵完毕；

其中，所述种子培养基和所述发酵培养基中均包括通式(1)化合物中的至少一种；

所述通式(1)化合物中的R为C₁～C₂₀烷基，所述通式(1)化合物在所述种子培养基和所述发酵培养基中的浓度均为0.15～7g/L。

根据本发明实施例的制备柠檬酸的方法，种子培养基和所述发酵培养基中均包括通式(1)化合物中的至少一种，通式(1)化合物在培养基中所起的作用，可以具有以下机理：

1、作为高效甲基供体，参与甲基化反应以及能提高代谢途径中关键酶的酶活，来加快菌体生长速率及代谢物产量。

2、能提高细胞膜通透性，促进营养物质及氧气在胞内外的交换，以及提高微生物的呼吸链系统，显著提高菌体的呼吸特性。

3、作为渗透压保护剂，能够调节细胞内外渗透压，更有利于胞内产物向胞外的释放，解决由胞内发酵产物浓度过高导致的反馈性抑制问题。降低高渗透压导致的呼吸抑制，加快氧气在细胞内外的传递速率，降低能耗。

4、作为表面活性剂，能够很好地改善界面张力，降低孢子的聚集力，提高种子液中菌球的分散度和菌体量。

5、作为表面活性剂具有乳化剂的作用，更加快了氧气在粘稠的发酵液中的传递速度。

根据本发明实施例的制备柠檬酸的方法，通过在发酵培养基中添加通式(1)化合物来提高柠檬酸产量，可以解决如下问题：

1、种子培养阶段，在保证足够菌体量的基础上可以最大限度地增加菌团与种子培养基的接触面积，也就意味着在发酵营养物质固定的情况下，最大限度地增加菌球的数量，降低菌球的体积。

2、发酵产酸阶段，发酵过程中菌球的数量基本上是由种子培养过程中的菌球数量决定的。通过在发酵培养基中添加通式(1)化合物，能够很好地改善界面张力，降低孢子的聚集力，促进了有效菌团数量的快速增加，进而在发酵罐中降低了菌团的直径，在保证同样菌体量的条件下促进了比表面的大幅度增加，促进了氧的传递速率和氧的消耗速率，柠檬酸的合成速率显著增加。

可以有效解决由于发酵过程供氧不足及氧传递减弱导致的菌丝体呼吸抑制；可以有效解决胞内产物(酶制剂)向胞外的分泌出现不畅或不及时，而引起的胞内发酵产物浓度过高导致的反馈性抑制问题。

从而提高柠檬酸生产速率，缩短发酵时间，最终提高柠檬酸产量并降低能耗。

另外，根据本发明上述实施例的制备柠檬酸的方法还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的一个示例，所述通式(1)化合物中的R为C₁～C₁₂烷基。

根据本发明的一个示例，所述通式(1)化合物为甜菜碱、月桂基甜菜碱、辛基甜菜碱或异丙基甜菜碱。

根据本发明的一个示例，所述通式(1)化合物为无水甜菜碱、一水甜菜碱、盐酸盐甜菜碱或磷酸甜菜碱。

根据本发明的一个示例，所述通式(1)化合物在所述种子培养基和所述发酵培养基中的浓度均为0.5～5g/L。

根据本发明的一个示例，所述通式(1)化合物在所述种子培养基中的浓度为0.6～1g/L，所述通式(1)化合物在所述发酵培养基的浓度为2g/L。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1是根据本发明一个实施例的制备柠檬酸的方法发酵产酸过程的示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

首先需要说明的，根据本发明实施例的制备柠檬酸的方法，其所采用的种子培养基、种子培养条件、发酵培养基和发酵条件均可以为现有的，可参考中国专利CN104561140A。

下面通过具体实施例来阐述根据本发明实施例的制备柠檬酸的方法。

试验菌种

黑曲霉，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(编号：2330～2335)。

种子培养基

自来水与玉米粉按质量比5：2的比例混合，110℃保温并不断搅拌，并加入α-高温淀粉酶，恒温30min，用碘指示剂检验不变蓝，即糖化完全，冷却，回复原来体积，得到玉米粉糖化液。

将玉米粉糖化液经两层纱布过滤得糖化清液。

用盐酸调节pH值到4.5～5.0，在摇瓶中加入玉米粉糖化液，纱布封口，121℃灭菌25min，得种子培养基。

种子培养基设计4个梯度试验，分别为在上述种子培养基基础上不添加甜菜碱得到1*种子培养基、添加0.6g/L的甜菜碱得到2*种子培养基、添加0.8g/L的甜菜碱得到3*种子培养基、添加1g/L的甜菜碱得到4*种子培养基。

培养条件

将在土豆斜面培养基上生长成熟的黑曲霉，在无菌条件下，采用孢子悬浮液接种法接种，对孢子进行计数，调整种子培养基中孢子接种量为5.0×10⁵个，将同等数量的孢子分别接种到上述4个种子培养基中，置于旋转式摇床上，160r/min，34±1℃，培养22h。

实验结果

甜菜碱添加量对种子培养基菌团形成率的影响

	甜菜碱添加量	总菌球数	接入孢子个数
				1*种子液	0	4.6×104	5.0×105
2*种子液	0.6g/L	5.5×104	5.0×105
				3*种子液	0.8g/L	8.3×104	5.0×105
4*种子液	1.0g/L	1.2×105	5.0×105

由上表可以看出，在种子培养阶段，随着甜菜碱添加量的增加，总菌球数也增加。

发酵培养基

将玉米粉糖化液与过滤后的玉米糖化清液按体积比1：5的比例混合。

在全自动发酵罐中加入混合后的培养基，添加0.3％(重量百分比)的(NH₄)₂SO₄，调pH值到4.5～5.0。

采用4个发酵罐，其中1#和3#发酵罐不添加甜菜碱，2#和4#发酵罐分别添加2.0g/L的甜菜碱。115℃灭菌25min灭菌，得到4罐发酵培养基。

发酵条件

将两份等量的1*种子液分别转接到1#和2#全自动发酵罐中，将两份等量的4*种子液分别转接到3#和4#全自动发酵罐中。

发酵开始时，分别在温度为34±1℃下通气培养。在培养过程中，采用液氨调节培养基的pH，使pH值维持在4.4～4.8。发酵培养72小时后，发酵完毕。

发酵过程中，分别在36h，48h，60h，66h，72h检测柠檬酸产量。采用0.1429mol/L的氢氧化钠溶液滴定法测定柠檬酸。

实验结果如图1所示。

从图1可以看出，只在发酵培养基中添加甜菜碱的2#罐的产酸率比对照1#罐提高约7.0％。

只在种子培养基中添加甜菜碱的3#罐的产酸率比对照1号罐提高约3.8％，同时发酵周期72小时缩短到66小时。

在种子培养基和发酵培养基中同时添加甜菜碱的4#发酵罐比对照1#发酵罐，产酸率提高约10.8％，同时产物合成速率明显提升，发酵周期从72小时缩短到60小时。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.一种制备柠檬酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：种子培养阶段

1)种子培养基

自来水与玉米粉按质量比5：2的比例混合，110℃保温并不断搅拌，并加入α-高温淀粉酶，恒温30min，用碘指示剂检验不变蓝，即糖化完全，冷却，回复原来体积，得到玉米粉糖化液；

将玉米粉糖化液经两层纱布过滤得糖化清液；

用盐酸调节pH值到4.5～5.0，在摇瓶中加入玉米粉糖化液，纱布封口，121℃灭菌25min，得种子培养基；

2)种子培养条件

将黑曲霉(2330～2335)菌种按照接种量为5.0×10⁵个孢子接种到种子培养基中，置于旋转式摇床上，在转速160r/min、温度34±1℃的条件下，进行培养22h以得到种子液；

步骤S2：发酵产酸阶段

1)发酵培养基

将玉米粉糖化液与糖化清液按体积比1：5的比例混合；在全自动发酵罐中加入混合后的培养基，添加0.3％(重量百分比)的(NH₄)₂SO₄，调pH值到4.5～5.0，115℃灭菌25min，得到发酵培养基；

2)发酵条件

将步骤S1中得到的种子液加入到发酵培养基中进行发酵以生成柠檬酸，发酵时，在温度为34±1℃下通气培养，采用液氨调节培养基的pH，使pH值维持在4.4～4.8，发酵培养72小时后，发酵完毕；

其中，所述种子培养基和所述发酵培养基中均包括通式(1)化合物中的至少一种；

所述通式(1)化合物中的R为C₁～C₂₀烷基，所述通式(1)化合物在所述种子培养基和所述发酵培养基中的浓度均为0.15～7g/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通式(1)化合物中的R为C₁～C₁₂烷基。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述通式(1)化合物为甜菜碱、月桂基甜菜碱、辛基甜菜碱或异丙基甜菜碱。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述通式(1)化合物为无水甜菜碱、一水甜菜碱、盐酸盐甜菜碱或磷酸甜菜碱。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通式(1)化合物在所述种子培养基和所述发酵培养基中的浓度均为0.5～5g/L。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述通式(1)化合物在所述种子培养基中的浓度为0.6～1g/L，所述通式(1)化合物在所述发酵培养基的浓度为2g/L。