CN105400709A - 粘质红酵母菌株、菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种粘质红酵母菌株、菌剂及其制备方法和应用。粘质红酵母菌株为粘质红酵母TDF-2（<i>Rhodotorula</i><i>？mucilaginosa？</i>TDF-2），保藏编号为CCTCC？NO：M？2012353。粘质红酵母菌剂由粘质红酵母菌株经活化、种子培养、生产培养、离心后制备得到。本发明的粘质红酵母菌剂的生产成本低，对噁唑酰草胺的降解效率高且生产工艺简洁、成本低、无二次污染，可应用于噁唑酰草胺的降解。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及粘质红酵母菌株、菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
噁唑酰草胺是一种芳氧苯氧丙酸酯类除草剂，是一种水稻专用型茎叶除草剂，对水稻田主要杂草，如稗草、千金子、马唐和牛筋草等具有良好的控制效果，且对水稻安全。近年来广泛的应用于我国水稻主产区稻田恶性杂草的防除。随着恶唑酰草胺使用量的上升，其残留物对后茬作物和环境的安全性，日益受到关注。然而，基于我国农业生产实际，噁唑酰草胺的投入量还会继续上升，因此，如何消除噁唑酰草胺在生态环境中的残留污染，成为一个非常重要的环境问题。
噁唑酰草胺残留的修复技术中，最具潜力的方法是生物修复，包括植物修复和微生物修复。植物修复技术具有花费较少、对环境安全等优点，但是，由于植物自身特点，需要合适生长条件、生长速率较低，因此，导致其修复效率较低；噁唑酰草胺微生物修复领域的技术难题是，降解菌资源筛选相对较少，且一些降解菌资源本身存在安全性问题，限制了噁唑酰草胺微生物修复技术的实际应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生产成本低，降解效率高且生产工艺简洁、成本低、无二次污染的粘质红酵母菌株，还提供了由该粘质红酵母菌株制备得到的菌剂以及该菌剂在降解噁唑酰草胺中的应用，具有生产成本低、使用方便，降解噁唑酰草胺效果好，使用方便、节约劳动成本等优势。
为解决上述技术问题，提供了一种粘质红酵母菌，所述粘质红酵母菌株为粘质红酵母TDF-2（RhodotorulamucilaginosaTDF-2），保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为CCTCCNO：M2012353，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月16日，该菌株被命名为粘质红酵母TDF-2（RhodotorulamucilaginosaTDF-2）。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种粘质红酵母菌剂，所述粘质红酵母菌剂由上述的粘质红酵母菌株经活化、种子培养、生产培养后制备得到。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的粘质红酵母菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）活化：将粘质红酵母菌株TDF-2的保存种按平板培养法培养至单菌落出现；
（2）种子培养：将所述步骤（1）中的单菌落接种至种子培养基中培养至对数生长期得到菌液；
（3）生产培养：将所述步骤（2）中培养得到的菌液按接种量为5v/v%～10v/v%接种到生产培养基中培养至对数生长期得到粘质红酵母菌剂。
上述的制备方法，优选的，所述平板培养法具体为：将所述粘质红酵母菌株TDF-2的保存种接种到GSY固体培养基中，在pH值为7.0～7.2，培养温度为30℃～35℃，振荡速度为150rpm～200rpm的条件下振荡培养至单菌落出现。进一步优选的，将所述粘质红酵母菌株TDF-2的保存种接种到GSY固体培养基中，在pH值为7.2，培养温度为35℃，振荡速度为180rpm的条件下振荡培养至单菌落出现。
上述的制备方法，优选的，所述种子培养具体为：将单菌落接种到GSY液体培养基中，在pH值为7.0～7.2，培养温度为30℃～35℃，振荡速度为150rpm～200rpm的条件下振荡培养。进一步优选的，将单菌落接种到GSY液体培养基中，在pH值为7.2，培养温度为35℃，振荡速度为180rpm的条件下振荡培养。
上述的制备方法，优选的，所述生产培养具体为：将菌液接种到GSY液体培养基中，在pH值为7.0～7.2，培养温度为30℃～35℃，振荡速度为150rpm～200rpm的条件下振荡培养。进一步优选的看，将菌液接种到GSY液体培养基中，在pH值为7.2，培养温度为35℃，振荡速度为180rpm的条件下振荡培养。
上述的制备方法，优选的，所述粘质红酵母菌剂中粘质红酵母菌TDF-2的浓度为108～109cfu/mL。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的粘质红酵母菌剂或上述制备方法制备得到的粘质红酵母菌剂在降解噁唑酰草胺中的应用。
上述的应用方法，优选的，将粘质红酵母菌剂与化学农药、肥料混合使用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）本发明提供的粘质红酵母菌株TDF-2，生产周期短、成本低，高效、无毒、环保，可通过简单、快捷的操作方法制备得到酵母菌菌剂，能够有效用于工业废水和农业生产中噁唑酰草胺农药残留的微生物修复，对噁唑酰草胺去除效率高。本发明的菌株可用于田间作物的生产。本发明的菌株本身具有多种抑制病原物活性物质，能够有效抑制多种病原物的危害，具有安全、无毒、环保的特点。
（2）本发明提供了一种粘质红酵母菌剂，具有生产成本低、使用方便，降解噁唑酰草胺效果好等优点，能够用于农业生产中粮食、水果、蔬菜等的生产。
（3）本发明提供了一种粘质红酵母菌的应用，该粘质红酵母菌可以与化学农药、肥料等混合使用，在保证作物产量的前提下，不增加额外的劳动量，使用方便、节约劳动成本。此外，由于本发明的菌株可以应用于降解高浓度噁唑酰草胺农药，因此亦可用于含噁唑酰草胺农药废水的处理。
本发明的粘质红酵母TDF-2（RhodotorulamucilaginosaTDF-2），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址位于中国武汉大学；保藏编号为CCTCCNO：M2012353，保藏日期为2012年9月16日。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1的粘质红酵母菌TDF-2菌株的电镜扫描图。
图2为实施例3中噁唑酰草胺标准样品的液相色谱图。
图3为实施例3中不同培养时间下，粘质红酵母菌剂降解噁唑酰草胺效率及生物量图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种本发明的粘质红酵母菌TDF-2（RhodotorulamucilaginosaTDF-2），保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为CCTCCNO：M2012353，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月16日，该菌株被命名为粘质红酵母TDF-2（RhodotorulamucilaginosaTDF-2）。
本实施例1的粘质红酵母菌TDF-2采用以下方法筛选得到：
（1）将采自湖南省农田排水沟的底泥样品2.0g加入100mLGSY液体培养基中得到培养液。GSY液体培养基组分为：4g/L葡萄糖，0.2g/LK2HPO4，0.8g/LKH2PO4，0.1g/LMgSO4，0.2g/L(NH4)2SO4和0.005g/L酵母膏。
（2）调节步骤（1）中培养液的pH7.2，然后在35±2℃、180rpm条件下培养至菌液浑浊，时间为10h。
（3）取步骤（2）中的菌液稀释涂布到GSY固体培养基上。GSY固体培养基成分：4g/L葡萄糖，0.2g/LK2HPO4，0.8g/LKH2PO4，0.1g/LMgSO4，0.2g/L(NH4)2SO4和0.005g/L酵母膏，15g/L琼脂，pH值为7.2。将涂布后的GSY固体培养基在35±2℃下倒置培养至菌落出现。
（4）挑取菌落形态不同的菌，分别接种到含GSY液体培养基（GSY液体培养基的成分与步骤（1）中相同）中，筛选得到粘质红酵母TDF-2（RhodotorulamucilaginosaTDF-2），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2012353，本发明菌株的扫描电镜图如图1所示。
筛选得到的粘质红酵母TDF-2，具有以下主要特征：呈细胞圆形、卵形或长形，2.3～5.0×4.0～10μm，出芽生殖、水解淀粉、V-P反应阴性、脲酶反应阴性。最适生长温度为30～35℃，最适生长pH值为7。
实施例2
一种本实施例的粘质红酵母TDF-2（RhodotorulamucilaginosaTDF-2）菌剂，其制备方法具体包括以下步骤：
（1）活化：将粘质红酵母菌株TDF-2的超低温（超低温具体为-80℃）保存种按平板培养法在GSY固体培养基中进行振荡培养，pH值为7.2，培养温度为35℃，振荡速度为180rpm。培养12h时，单菌落出现。
（2）种子培养：在三角瓶内装入粘质红酵母菌株TDF-2种子培养基（具体为GSY液体培养基，其培养基的成分与实施例1一致，pH值为7.2）。将挑取的单菌落接种至三角瓶中，进行摇瓶培养，培养温度为35℃，振荡速度为180rpm。当培养至对数生长期（时间为18h）停止培养得到菌液。
（3）生产培养：在生产三角瓶内装入粘质红酵母菌株TDF-2生产培养基（具体为GSY液体培养基，其培养基的成分与实施例1一致，pH值为7.2）。将步骤（2）培养后得到的菌液，按照接种量为5v/v%接种至生产培养基中。在培养温度为35℃，振荡速度为180rpm的条件下进行振荡培养至对数生长期（培养时间为8h）。
（4）将步骤（3）生产培氧后的菌液分装制得粘质红酵母TDF-2菌剂。
本实施例的制备方法的全流程时间一般为2～4天，培养结束后，菌体数量可达到2亿个/ml以上。
实施例3
一种粘质红酵母菌剂在降解噁唑酰草胺中的应用，其应用方法具体包括以下步骤：
（1）用丙酮溶解噁唑酰草胺得到噁唑酰草胺溶液，将噁唑酰草胺溶液添加到GSY液体培养基，使GSY液体培养基中噁唑酰草胺的终浓度为50mg/L得到实验培养基。GSY液体培养基组分：4g/L葡萄糖，0.2g/LK2HPO4，0.8g/LKH2PO4，0.1g/LMgSO4,0.2g/L（NH4）2SO4和0.005g/L酵母膏，pH7.2。
（2）在步骤（1）的实验培养基接种5%（v/v）实施例2中的粘质红酵母菌液，在35±2℃、180rpm下培养。
（3）分别于第2、4、6、8、10h取培养后的菌液检测噁唑酰草胺残留。噁唑酰草胺的含量采用高效液相色谱法（Agilent）测定。测定前用已知浓度的噁唑酰草胺标准样品定性定量。以不加菌剂的实验培养基为对照（相当于噁唑酰草胺未处理，浓度不变）。所有处理重复三次。测定结果见下图2、图3所示。
图2为噁唑酰草胺标准品的液相色谱峰图，从图2中可知：噁唑酰草胺在液相色谱峰图中的特异保留时间为4.602min，峰面积为对应标准样品的浓度对应的峰面积；根据样品的色相色谱峰图中出峰的保留时间定性噁唑酰草胺，峰面积与标准样品峰面积的比值，乘以标准样品的浓度，即可换算得到的样品中的噁唑酰草胺的浓度。
图3为不同培养时间噁唑酰草胺的降解率。图3的结果表明，35±2℃、180rpm培养条件下培养10h，菌株TDF-2对50mg/L的噁唑酰草胺降解效率为62.63%。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (8)
1.一种粘质红酵母菌，其特征在于，所述粘质红酵母菌株为粘质红酵母TDF-2（RhodotorulamucilaginosaTDF-2），保藏编号为CCTCCNO：M2012353。
2.一种粘质红酵母菌剂，其特征在于，所述粘质红酵母菌剂由权利要求1所述的粘质红酵母菌株经活化、种子培养、生产培养、离心后制备得到。
3.一种权利要求2所述的粘质红酵母菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）活化：将粘质红酵母菌株TDF-2的保存种按平板培养法培养至单菌落出现；
（2）种子培养：将所述步骤（1）中的单菌落接种至种子培养基中培养至对数生长期得到菌液；
（3）生产培养：将所述步骤（2）中培养得到的菌液按接种量为5v/v%～10v/v%接种到生产培养基中培养至对数生长期得到粘质红酵母菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述平板培养法具体为：将所述粘质红酵母菌株TDF-2的保存种接种到GSY固体培养基中，在pH值为7.0～7.2，培养温度为30℃～35℃，振荡速度为150rpm～200rpm的条件下振荡培养至单菌落出现。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养具体为：将单菌落接种到GSY液体培养基中，在pH值为7.0～7.2，培养温度为30℃～35℃，振荡速度为150rpm～200rpm的条件下振荡培养。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述生产培养具体为：将菌液接种到GSY液体培养基中，在pH值为7.0～7.2，培养温度为30℃～35℃，振荡速度为150rpm～200rpm的条件下振荡培养。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述粘质红酵母菌剂中粘质红酵母菌TDF-2的浓度为108～109cfu/mL。
8.一种权利要求2的粘质红酵母菌剂或权利要求3至7中任一项所述制备方法制备得到的粘质红酵母菌剂在降解噁唑酰草胺中的应用。
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