CN105399614A - 内生枯草芽孢杆菌抗菌挥发性物质及其鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生防内生枯草芽孢杆菌(Bacillius？subtilis)菌株Jaas？ed1产生的具有抗菌活性的挥发性物质及其鉴定方法。该菌株至少可产生15种挥发性物质，其中10种为抑菌有效物质，分别为2-庚酮，2-壬酮，2-壬醇，2-癸酮，2-癸醇，2-苯乙醇，2-十一酮，2-十二酮，2-十一醇，2-十三烷酮。其收集纯化方法是：将内生枯草芽孢杆菌Jaas？ed1发酵液在磁力搅拌器上加热搅拌，利用DVB/CAR/PDMS萃取头对挥发性气体进行固相微萃取，最后利用GC-MS测定萃取的挥发性物质成分。该挥发性气体能抑制西瓜枯萎病菌的菌丝生长及棉花黄萎病菌微菌核的萌发，对于开发广谱抗菌药物具有极高的研究和应用价值，对于保护作物及其果实的天然品质、减少农药残留具有广泛的应用前景。

Description

内生枯草芽孢杆菌抗菌挥发性物质及其鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一组由内生枯草芽孢杆菌(Bacilliussubtilis)Jaased1产生的有抗菌作用的挥发性物质及其鉴定方法。
背景技术：
对植物病害生物防治的研究，目前主要集中在利用植物次生物质，诱发寄主抗性及拮抗微生物等方面，其中，拮抗细菌及其产生的非挥发性代谢产物的开发和应用日益广泛和深入，而关于细菌产挥发性代谢产物的研究较少。许多报道均已表明细菌产生的挥发性气体在生物防治上具有重要性。细菌产生的一系列挥发性物质(VCs)，包括醛类、酯类、醇类、酸类和酮类等，这些挥发性化合物有广谱的抗菌作用，对植物病原菌有一定的抑制作用，对线虫有较强的致死效果，能促进植物生长，诱导植物产生抗病作用。其中，芽孢杆菌由于其种类多，对紫外线、高温高热、电磁辐射及一些化学药品的抗逆性很强，自身菌株及其非挥发性代谢产物在植物病害的生物防治方面有重要应用价值，因而，进一步对其所产挥发性代谢物的研究和开发利用，对提高生物防治效果有重要意义。
芽孢杆菌可通过不同的代谢途径产生各种挥发性物质，然而挥发性物质理化性质差异较大，浓度低、种类多、从极性到非极性跨度大，导致检测难度较大，一般需要对其进行分离、富集后再进行分析测定。枯草芽孢杆菌BacillussubtilisJaased1是一株分离自茄子组织的植物内生细菌，已于2005年12月12日保藏在中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1564。该菌株能有效防治西瓜枯萎病、棉花黄萎病、茄子黄萎病，并且能够在茄子、西瓜等多种作物体内定殖。但是对该菌株产生的挥发性气体还没有深入研究，也未有相关报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一组由生防枯草芽孢杆菌产生的能够抗菌的挥发性物质，及该挥发性物质的鉴定方法。
1、一组具有抗菌活性的挥发性物质，其特征在于：从保藏号为CGMCCNo.1564的内生枯草芽孢杆菌Jaased1胞外产物中收集获得，包括10种具有抑菌活性的成份，分别为2-庚酮、2-壬酮、2-壬醇、2-癸酮、2-癸醇、2-苯乙醇、2-十一酮、2-十二酮、2-十一醇、2-十三烷酮。
2、一组具有抗菌活性挥发性物质的收集鉴定方法，其特征在于：
a、将保藏号为CGMCCNo.1564的内生枯草芽孢杆菌Jaased1菌株接种到加入灭菌磁力搅拌子的LB培养液中，在37℃、120r/min条件下振荡培养24h，培养好后将培养瓶置于磁力搅拌器上50℃搅拌30min，将DVB/CAR/PDMS萃取头在270℃条件下老化30min后对菌株Jaased1所产的挥发性气体进行固相微萃取，萃取30min即可获得一组具有抗菌活性的挥发性物质；
b、用气质联用仪(GC-MS)测定挥发性物质的组份，将萃取头在210℃进样口解析5min，采用无分流模式，载气为He，流速为1.0ml/min，升温程序为33℃，3min，以10℃/min速度升温至180℃，再以40℃/min速度升温至220℃，保持5min；质谱条件为电子电离为70eV，源温度为200℃，四级温度为150℃，40到500m/z连续扫描，用NIST数据库比对，测得菌株Jaased1可产生至少15种挥发性物质，分别为2-十一酮、2-十三烷酮、2-苯乙醇、2-庚酮、2-壬酮、2-壬醇、2-癸醇、2-十一醇、2-十二酮、2-十三醇、2，6-二叔基对甲苯、2-十四酮、2-癸酮、5-甲基-2-庚酮、2-十六醇；
c、将测定出的15种挥发性物质的每一种的化学纯品分别与西瓜枯萎病菌接种在同一个平板的不同隔间中，彼此没有接触，检测到其中10种物质对西瓜枯萎病菌菌丝生长有抑制作用，抑菌率分别为：2-庚酮为100％，2-壬酮为100％，2-壬醇为100％，2-癸酮为71.4％，2-癸醇为69.95％，2-苯乙醇为46.6％，2-十一酮为46.2％，2-十二酮为28.3％，2-十一醇为26.9％，2-十三烷酮为25.1％。
3、挥发性物质对棉花黄萎病菌微菌核萌发的抑制作用
将本发明所述的可产生该挥发性物质的枯草芽孢杆菌Jaased1与棉花黄萎病菌微菌核分别接种在同一个平板的不同隔间中，彼此没有接触，检测到由枯草芽孢杆菌Jaased1产生的挥发性物质对微菌核萌发有较强的抑制作用，抑制率为100％，而不接枯草芽孢杆菌Jaased1的空白对照中，微菌核萌发不受影响。
本发明的优点在于：本发明是一组从植物内生枯草芽孢杆菌(Bacilliussubtilis)Jaased1中分离出的新的一组挥发性气体，包括醇类、酮类、苯类等15种物质，其中有10种物质具有抑菌活性；该挥发性气体具有抑制西瓜枯萎病菌菌丝生长、抑制棉花黄萎病菌微菌核萌发等特点，对于开发广谱抗菌药物具有极高的研究和应用价值，对于保护作物及其果实的天然品质、减少农药残留具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是挥发性物质GC-MS图谱
图2是挥发性物质化学纯品对西瓜枯萎病菌菌丝的抑菌效果图
具体实施方式：
下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1挥发性物质的产生与收集
将产该挥发性物质的枯草芽孢杆菌(Bacilliussubtilis)Jaased1菌株接种到加入灭菌磁力搅拌子的LB培养液中(所述的LB培养液为酵母粉5％，NaCl10％，蛋白胨10％，pH＝7)，在37℃、120r/min条件下振荡培养24h，培养好后将培养瓶置于磁力搅拌器上50℃搅拌30min。将DVB/CAR/PDMS萃取头在270℃条件下老化30min，垂直插入培养瓶后，伸出萃取头，使萃取头在培养液液面上方2cm处，对Jaased1所产的挥发性气体进行固相微萃取，萃取30min后，萃取头上可萃取到挥发性气体。
实施例2挥发性气体的测定
挥发性气体用热电TraceDsq气质联用仪测定。将萃取头在210℃进样口解析5min，采用无分流模式，载气为He，流速为1.0ml/min，升温程序为33℃，3min，以10℃/min速度升温至180℃，再以40℃/min速度升温至220℃，保持5min；质谱条件为电子电离为70eV，源温度为200℃，四级温度为150℃，40到500m/z连续扫描。用NIST数据库比对，测得内生菌Jaased1共产生至少15种挥发性物质(见图1)，分别为2-十一酮(RT＝11.06)、2-十三烷酮(RT＝11.93)、2-苯乙醇(RT＝8.35)、2-庚酮(RT＝4.36)、2-壬酮(RT＝8.01)、2-壬醇(RT＝8.16)、2-癸醇(RT＝9.17)、2-十一醇(RT＝11.16)、2-十二酮(RT＝11.93)、2-十三醇(RT＝13.77)、2，6-二叔基对甲苯(RT＝13.94)、2-十四酮(RT＝14.48)、2-癸酮(RT＝9.05)、5-甲基-2-庚酮(RT＝5.79)、2-十六醇(RT＝14.55)。
实施例3挥发性物质有效成分的分析
在中间有隔板的90mm培养皿中，一侧倒入PDA培养基(所述的PDA培养基为马铃薯20％，葡萄糖2％，琼脂1.5-2.0％，自然pH值)，接种西瓜枯萎病菌菌饼(直径为7mm)，另一侧放置灭菌的滤纸，滴加100μL或者0.2g挥发性化学物质。对照中加入100μL无菌水。每处理3皿，重复3次。用封口膜Parafilm密封培养皿，阻断培养皿内外空气的流通，将培养皿于25℃培养，当对照菌丝长满一隔间后测定挥发性化学物质对菌丝的抑制作用，计算抑菌率。结果表明隔间分别加入挥发性物质后，其中10种挥发性物质对西瓜枯萎病菌菌丝生长有不同程度的抑制作用(见图2)，2-庚酮、2-壬酮、2-壬醇对西瓜枯萎病菌菌丝的抑制效果最好，为100％，其余化学纯品对病菌菌丝抑制率分别为：2-癸酮为71.4％，2-癸醇为69.95％，2-苯乙醇为46.6％，2-十一酮为46.2％，2-十二酮为28.3％，2-十一醇为26.9％，2-十三烷酮为25.1％。
实施例4对棉花黄萎病菌微菌核的影响
在中间有隔板的90mm培养皿的一隔间中倒入LB培养基，在涂布100μL浓度为1×108cfu/mL的产挥发性物质的枯草芽孢杆菌Jaased1，以加入100μL的无菌水作对照，用封口膜将培养皿封好，将培养皿放于37℃的恒温培养箱中培养24h后，在隔板的另一半加入浓度为4.17×103个/mL的棉花黄萎病菌微菌核1mL，用封口膜将培养皿封好，并将培养皿置于25℃的恒温培养箱中黑暗培养。以不加生防菌Jaased1为对照，每处理3个培养皿，重复3次。每隔24h观察微菌核萌发情况，每次随机取100个微菌核统计萌发率。结果表明生防细菌Jaased1产挥发性气体对微菌核处理24h后，微菌核均未萌发，挥发性气体对微菌核的抑制率为100％。说明生防细菌Jaased1气体对微菌核萌发有较强的抑制作用。

Claims (2)

1.一组具有抗菌活性的挥发性物质，其特征在于：从保藏号为CGMCCNo.1564的内生枯草芽孢杆菌Jaased1胞外产物中收集获得，包括10种具有抑菌活性的成份，分别为2-庚酮、2-壬酮、2-壬醇、2-癸酮、2-癸醇、2-苯乙醇、2-十一酮、2-十二酮、2-十一醇、2-十三烷酮。
2.如权利要求1所述的一组具有抗菌活性挥发性物质的收集鉴定方法，其特征在于：
a、将保藏号为CGMCCNo.1564的内生枯草芽孢杆菌Jaased1菌株接种到加入灭菌磁力搅拌子的LB培养液中，在37℃、120r/min条件下振荡培养24h，培养好后将培养瓶置于磁力搅拌器上50℃搅拌30min，将DVB/CAR/PDMS萃取头在270℃条件下老化30min后对Jaased1所产的挥发性气体进行固相微萃取，萃取30min即可获得权利要求1所述的一组具有抗菌活性挥发性物质；
b、用气质联用仪(GC-MS)测定挥发性物质的组份，将萃取头在210℃进样口解析5min，采用无分流模式，载气为He，流速为1.0ml/min，升温程序为33℃，3min，以10℃/min速度升温至180℃，再以40℃/min速度升温至220℃，保持5min；质谱条件为电子电离为70eV，源温度为200℃，四级温度为150℃，40到500m/z连续扫描，用NIST数据库比对，测得菌株Jaased1可产生至少15种挥发性物质，分别为2-十一酮、2-十三烷酮、2-苯乙醇、2-庚酮、2-壬酮、2-壬醇、2-癸醇、2-十一醇、2-十二酮、2-十三醇、2，6-二叔基对甲苯、2-十四酮、2-癸酮、5-甲基-2-庚酮、2-十六醇；
c、将测定出的15种挥发性物质中的每一种的化学纯品分别与西瓜枯萎病菌接种在同一个平板的不同隔间中，彼此没有接触，检测到其中10种物质对西瓜枯萎病菌菌丝生长有抑制作用，分别为2-庚酮，2-壬酮，2-壬醇，2-癸酮，2-癸醇，2-苯乙醇，2-十一酮，2-十二酮，2-十一醇，2-十三烷酮。
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