CN105395539A - 泰瑞米特钠在制备治疗自身免疫病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有低肝脏毒性的来氟米特活性代谢物钠盐—泰瑞米特钠在制备治疗自身免疫病药物中的应用。与来氟米特或泰瑞米特相比，泰瑞米特钠具有最小的肝脏毒性和最大的治疗窗，泰瑞米特钠或以泰瑞米特钠为活性成分的药物组合可作为免疫抑制剂，用于自身免疫病的治疗。

Description

泰瑞米特钠在制备治疗自身免疫病药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种具有低肝脏毒性的来氟米特活性代谢物钠盐—泰瑞米特钠在制备治疗自身免疫病药物中的应用。

背景技术

来氟米特(leflunomide，LEF)是一种小分子免疫抑制剂，该产品于1999年获得国家食品药品监督管理局批准上市，适应症为成人类风湿关节炎。来氟米特的疗效稳定，但是该药的起效时间相对较慢，个体差异性较大；在临床应用过程中，特别是与甲氨蝶呤联合使用时，胃肠道反应、肝功能异常、脱发等药物不良反应较为常见。其中，肝脏毒性是制约来氟米特临床应用最重要的原因。

泰瑞米特(Teriflunomide，TER)是Sanofi-Aventis公司研制的产品。该产品于2012年获FDA批准上市。泰瑞米特钠是来氟米特(Leflunomide)的有效活性成分，其药理作用包括：抑制嘧啶的从头合成途径；抑制酪氨酸激酶的活性，阻断细胞炎症信号传导过程；抑制NF-κB的活化及所调控基因的表达，如IL-1、TNF-α的表达；抑制淋巴细胞增殖及抗体产生；抑制细胞黏附分子的表达及外周血单核细胞的跨内皮游走；抑制树突细胞(DC)的功能；抑制病毒复制等。目前泰瑞米特于2012年获FDA批准上市，临床适应症为多发性硬化症，尚没有泰瑞米特钠用于治疗系统性红斑狼疮等自身免疫病的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种泰瑞米特钠的新用途。

本发明的第一方面，提供一种泰瑞米特钠的应用，用于制备预防和/或治疗自身免疫病的药物。

在另一优选例中，所述自身免疫疾病为系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病关节炎或多发性硬化症。

在另一优选例中，所述自身免疫疾病为系统性红斑狼疮。

在另一优选例中，所述泰瑞米特钠或所述药物通过口服或非经肠道给予对象。

在另一优选例中，所述泰瑞米特钠或所述药物给予对象1-3次/天，10-100mg/天。

在另一优选例中，所述药物的制剂形式为片剂、胶囊、丸剂、锭剂、颗粒剂、微颗粒剂、悬浮液、粉末、糖锭、酏剂、注射剂、液剂、油膏剂、栓剂或贴膏剂。

在另一优选例中，所述药物的制剂形式为片剂、胶囊、丸剂、锭剂、悬浮液、粉末、糖锭或酏剂。

在另一优选例中，所述泰瑞米特钠的给药剂量在不超过200mg/d的情况下，在人体不会产生肝脏毒性或仅产生较低的肝脏毒性，所述产生较低的肝脏毒性是指肝转氨酶(ALT和/或AST)升高不超过正常值上限的1.5倍。

药物的肝脏毒性是指药物作用于肝脏细胞，若引起肝脏细胞损伤，临床可以观察到肝功能异常—转氨酶升高超过正常值上限。较低的肝脏毒性是指ALT和/或AST升高不超过正常值上限的1.5倍；低肝毒性(轻度肝功能异常)：ALT和/或AST升高不超过正常值上限2倍；中度肝毒性(中度肝功能异常)：ALT和/或AST升高不超过正常值上限2-3倍；高度肝毒性(重度肝功能异常)：ALT和/或AST升高不超过正常值上限3倍。

本发明的第二方面，提供一种药物组合物的用途，所述药物组合物包含泰瑞米特钠和药学上可接受的载体，用于预防和/或治疗自身免疫病的药物。

在另一优选例中，所述自身免疫疾病为系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病关节炎或多发性硬化症。

在另一优选例中，所述药物组合物通过口服或非经肠道给予对象；和/或

所述药物组合物给予对象1-3次/天，10-100mg泰瑞米特钠/天。

在另一优选例中，所述药物组合物的制剂形式为片剂、胶囊、丸剂、锭剂、颗粒剂、微颗粒剂、悬浮液、粉末、糖锭、酏剂、注射剂、液剂、油膏剂、栓剂或贴膏剂。

在另一优选例中，所述药物组合物的制剂形式为片剂、胶囊、丸剂、锭剂、悬浮液、粉末、糖锭或酏剂。

泰瑞米特钠对人原代肝细胞活性没有抑制作用，对人原代肝细胞线粒体的损伤作用低于来氟米特；与来氟米特和泰瑞米特相比，泰瑞米特钠在药物浓度>300μM时导致的LDH释放不会随着药物浓度的增加而增加。相同剂量泰瑞米特钠在哺乳动物体内导致肝转氨酶升高的风险亦低于来氟米特。因此，泰瑞米特钠在人体内的应用剂量范围高于来氟米特，与来氟米特相比，泰瑞米特钠的起效剂量低，耐受剂量更高。根据体外研究结果推测，泰瑞米特钠在人体不产生肝脏毒性或低肝脏毒性的最大剂量约为200mg/d，而来氟米特目前临床报道的人体最大耐受剂量为40-60mg/d。

泰瑞米特钠为水溶性物质，比来氟米特吸收更快，与相同剂量的来氟米特相比，生物利用度高，其体内暴露量大，因此服用较少剂量泰瑞米特钠就能达到来氟米特相同的治疗效果；此外，泰瑞米特钠为活性成分，无需肝肠的代谢而直接被吸收利用，个体差异小，避免了首过效应和体内代谢过程。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为人肝细胞毒性(MTT实验)结果图，其中，胺碘酮IC₅₀＝7.837μM，来氟米特IC₅₀＝769.6μM，泰瑞米特IC₅₀＝NA，泰瑞米特钠IC₅₀＝NA，“NA”表示无法计算。

图2为人肝细胞线粒体损伤检测结果图。

图3为人肝细胞LDH释放检测结果图。

图4为泰瑞米特钠口服干预治疗对MRL/lpr小鼠体重的影响作用图，10-11周龄雌性MRL/lpr小鼠，口服治疗8周，观察小鼠体重变化情况，每周称重一次。各组小鼠给药过程体重变化情况比较。

*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.005，与空白对照组比较。

图5为泰瑞米特钠口服给药能显著地降低MRL/lpr小鼠蛋白尿水平结果图，其中(A)为各组小鼠治疗过程蛋白尿水平变化；(B)为治疗过程中泰瑞米特钠三个剂量组与模型对照组蛋白尿水平变化；(C)为泰瑞米特钠30mg/kg剂量组与来氟米特30mg/kg剂量组终点蛋白尿检测；(D)为治疗第4、8周各组严重蛋白尿症小鼠比例。

*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，与空白对照组比较。

图6为泰瑞米特钠口服给药减轻MRL/lpr小鼠皮肤损伤结果图，给药8周，各组小鼠皮肤损伤情况评分。**，P<0.01，与空白对照组比较。

图7为泰瑞米特钠口服给药缓解MRL/lpr小鼠淋巴器官肿大结果图，其中A为各组小鼠淋巴结肿大评分，B为淋巴结称重，C为各组小鼠脾脏重量，D为各组小鼠外周淋巴结拍照。

*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，与空白对照组比较。

图8为泰瑞米特钠口服给药降低MRL/lpr小鼠血清中抗dsDNA抗体和IL-17水平结果图。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，与空白对照组比较。

图9为泰瑞米特钠对ConA诱导的细胞因子生成的影响结果图。泰瑞米特钠对ConA诱导小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ(A)，IL-17(C)，IL-6(E)的抑制作用；来氟米特对ConA诱导小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ(B)，IL-17(D)，IL-6(F)的抑制作用，试验结果以均值±标准差表示。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，与刺激对照相比较。

图10为泰瑞米特钠抑制PBMC混合淋巴细胞反应结果图。MLR反应5天。刺激细胞(Stimulatorcell)：经过γ射线照射异源的人PBMC，本试验将三位正常人PBMC细胞按照1：1：1比例混合，经γ射线照射后，作为刺激细胞；反应细胞(RespondingCell)：正常人PBMC。(A)、(C)、(E)泰瑞米特钠抑制混合淋巴细胞反应；(B)、(D)、(F)来氟米特抑制混合淋巴细胞反应。试验结果以均数±标准差表示。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，与刺激对照组比较。

图11为泰瑞米特钠、来氟米特抑制植物血凝素(PHA)诱导PBMC增殖结果图。(A)、(C)、(E)泰瑞米特钠抑制PHA诱导的PBMC增殖；(B)、(D)、(F)来氟米特抑制PHA诱导的PBMC增殖。试验结果以均数±标准差表示。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，与刺激对照组比较。

图12为泰瑞米特钠、来氟米特抑制PHA(植物血凝素)诱导PBMC分泌IFN-γ结果图。(A)、(C)、(E)泰瑞米特钠抑制PHA诱导PBMC分泌IFN-γ，(B)、(D)、(F)来氟米特抑制PHA诱导PBMC分泌IFN-γ。试验结果以均数±标准差表示。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，与刺激对照组比较。

具体实施方式

本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次意外发现泰瑞米特钠的新应用，用于制备预防和/或治疗自身免疫病的药物，通过口服或非经肠道给予对象，用于自身免疫病治疗的剂量最高为100mg/天。与来氟米特相比，泰瑞米特钠的起效剂量低，耐受剂量更高，泰瑞米特钠在人体不产生肝脏毒性或低肝脏毒性的最大剂量约为200mg/d。在此基础上，完成了本发明。

泰瑞米特钠

泰瑞米特钠是来氟米特体内活性代谢物泰瑞米特的钠盐。本试验所使用的泰瑞米特钠样品通过来氟米特水解开环、酸化，成盐制得泰瑞米特钠粗品，在经精制得到纯度≥99.5％的泰瑞米特钠纯品。

泰瑞米特钠的化学反应路线如下：

实验表明，泰瑞米特钠与来氟米特或泰瑞米特相比具有最小肝脏毒性，具体表现为：泰瑞米特钠对人原代肝细胞活性没有抑制作用，对人原代肝细胞线粒体的损伤作用低于来氟米特；与来氟米特和泰瑞米特相比，泰瑞米特钠在药物浓度>300μM时导致的LDH释放不会随着药物浓度的增加而增加。据此推测，泰瑞米特钠在哺乳动物体内导致肝转氨酶升高的风险低于来氟米特，在人体不产生肝脏毒性或低肝脏毒性的最大剂量约为200mg/d，该剂量是来氟米特常规临床应用剂量的10倍。其优势在于，用于自身免疫病治疗时，在耐受剂量范围内，可通过提高给药剂量以增加药物的疗效。

疾病模型动物实验还表明，泰瑞米特钠能有效改善系统性红斑狼疮小鼠的皮损、淋巴结肿大和脾脏肿大等症状，降低尿蛋白、血清抗双链DNA(dsDNA)抗体和IL-17水平，其总体疗效显著高于糖皮质激素和相同剂量来氟米特。

药物组合物

本发明还提供包含泰瑞米特钠和药学上可接受的载体的药物组合物，可用于预防和/或治疗自身免疫病。

“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。

“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分(即泰瑞米特钠)以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明的泰瑞米特钠或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)等。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。

在这些固体剂型中，活性成分泰瑞米特钠与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

使用药物组合物时，是将安全有效量的泰瑞米特钠或药物组合物施用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

在一优选例中，以泰瑞米特钠制备的药物组合物的配方和制备方法如下:

按处方量称取糊精、乳糖、淀粉、羟丙纤维素，过筛(80目筛)使混合均匀；按处方量称取泰瑞米特钠(过80目筛)，以等量递增法投入到混合好的辅料中，并混合均匀；加5％聚维酮K30水溶液制软材，20目筛制粒；60℃干燥；干颗粒用18目筛整粒；加适量硬脂酸镁，混匀；中间体检查含量；压片、包薄膜衣、铝塑包装；外包装、入库。

以上述制备工艺进行中试放大生产三批(每批不少于10000片)，连续生产工艺稳定，可以满足工业化生产的要求，质量满足如下特征：

1)稳定性和有关物质含量：室温留样观察60个月，样品有关物质检查单个杂质均小于0.5％，总杂质小于1％。加速试验可致样品产生两个杂质，其中含量大于0.1％的为N-(4-三氟甲基苯基)-2-氰基-乙酰胺。

2)含量均匀度：采用UV法和HPLC法，3批样品均为A+1.80S≤15.0。

3)崩解时限：以水为介质，温度为37℃，3批样品崩解时限为7-8分钟。

4)溶出度：优化后的溶出条件为：以水900ml为溶出介质，转速为50转/分，温度为37℃，取样时间为30分钟，取续滤液作为供试品溶液。在该方法下，3批样品的溶出度均符合规定。

5)微生物限度：根据中国药典2010版微生物限度检查法(附录XIJ)进行微生物限度检查，三批样品均符合要求。

含量及限度：采用HPLC方法和UV法测定泰瑞米特钠的含量范围为99％-102％。

以上述组方所制成的胶囊剂饲喂beagle犬，活性组分泰瑞米特钠在beagle犬体内的生物利用度高于等量的来氟米特。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

泰瑞米特钠的制备

1.1泰瑞米特的制备

来氟米特溶于碱溶液中水解反应，酸化得泰瑞米特，过滤后得泰瑞米特湿品。此湿品直接进入下一步反应。

1.2泰瑞米特钠的制备

泰瑞米特湿品投入氢氧化钠水溶液中，升温反应2小时，过滤掉不溶物，滤液降至室温养晶，过滤、干燥的泰瑞米特钠粗品。经乙醇重结晶后得纯品泰瑞米特钠(纯度≥99.5)。

实施例2

泰瑞米特钠在人原代肝细胞的安全性评价

本实验的目的是检测泰瑞米特钠对人肝细胞的毒性，并比较其与来氟米特和泰瑞米特的肝细胞毒性大小，包括细胞活性实验(MTT)、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验以及线粒体膜电位实验。

实验步骤：

本实验选用大鼠原代肝细胞和人原代肝细胞。其中大鼠原代肝细胞来源于SD大鼠，原代肝细胞的分离得到药物所IACUC2013-06-PGY-03批准。原代人肝细胞购自英潍捷基(上海)贸易有限公司，批号HU4239。供试品为：泰瑞米特、泰瑞米特钠和来氟米特。

大鼠原代肝细胞先采用1％青链霉素，1％谷氨酰胺，0.1％胰岛素，0.01％地塞米松，5％胎牛血清的WilliamsEMedium培养液培养3小时贴壁，然后采用含1％青链霉素，1％L-谷氨酰胺，0.001％地塞米松，1％ITS的WilliamsEMedium培养液，人肝细胞采用含1％青链霉素，5％胎牛血清，0.01％地塞米松，0.1％胰岛素，1％GlutaMAX^TM，1.5％羟乙基哌嗪乙硫磺酸的WilliamsEMedium培养液，置于37℃，5％二氧化碳培养箱作单层细胞培养。

1.MTT实验

在96孔培养板中接种细胞，每孔接种5万个细胞。细胞贴壁后除去培养液，加入受试物稀释液100μL，每个剂量设6个复孔(剂量见表1)；同时设定空白、阳性对照组。受试物与细胞作用24h后，每孔加入MTT(5mg/mL)剂的20μL培养液，3h后加入100μL三联液。作用10h后，在570nm测OD值。用Logit法计算受试物对细胞的IC₅₀值。

表1.MTT实验受试物剂量设计

注：双氯芬酸，胺碘酮为阳性对照品；“—”表示未设该剂量。

2.线粒体膜电位实验

在96孔培养板中接种细胞，每孔约5万个细胞。细胞贴壁后除去培养液，加入受试物稀释液100μL，每个剂量设6个复孔(剂量设计见表2)；同时设空白、阳性对照组。受试物与细胞作用3h后(阳性药仅作用细胞20min后)，每孔加入TRME(四甲基若丹明乙酯酸铵，1μM)10μL。20min后，吸去上清液，加入100μL洗液(BSA，2mg/mL)。吸去洗液后，在549/575nm检测吸光度。

表2.线粒体膜电位实验剂量设计

注：CCCP(羰基氰化氯苯腙)，为阳性对照品。

3.乳酸脱氢酶释放实验

在24孔培养板中接种大鼠和人肝原代细胞，每孔约25万个细胞；在96孔培养板中接种人肝细胞，每孔约5万个细胞。细胞贴壁后除去培养液，加入供试品稀释液100μL，每个剂量设6复孔(剂量设计见表3)；同时设定空白、阳性对照组。供试品与细胞作用12h后，将细胞培养板于4℃，1000g离心5min。每孔取20μL上清检测LDH(具体参见产品说明书)。

表3.乳酸脱氢酶释放实验剂量设计

注：CCCP(羰基氰化氯苯腙)，为阳性对照品。

实验结果：

人肝原代肝细胞MTT、线粒体膜电位、LDH释放实验结果分别如图1、图2和图3所示，结果表明，与来氟米特相比，泰瑞米特钠和泰瑞米特对人肝原代细胞活性抑制有显著性差异。其中来氟米特IC50＝769.6μM，而泰瑞米特钠和泰瑞米特对人肝原代细胞活性抑制作用极低，无法计算IC50。泰瑞米特钠和泰瑞米特对人肝细胞线粒体膜电位几乎没有作用，在最高药物浓度(500μM)下对探针化合物TMRE摄取仍然没有影响，而来氟米特在500μM以上即可明显影响探针物TMRE摄取。泰瑞米特钠、泰瑞米特和来氟米特在较低浓度均可以促使人原代肝细胞释放LDH，三者的作用强度相近；在药物浓度>300μM时，泰瑞米特和来氟米特导致的LDH释放随着药物浓度的增加而增加，但泰瑞米特钠导致的LDH释放并未随着药物浓度的增加而增加。

以大鼠肝细胞为实验系统，MTT试验结果表明，泰瑞米特钠、泰瑞米特和来氟米特对大鼠肝原代细胞活性抑制率(IC50)相近，其中来氟米特略高(316.8μM，335.1μM和354.7μM)。线粒体膜电位试验结果表明，泰瑞米特钠对该细胞线粒体影响与泰瑞米特相近，在最高给药剂量(500μM)仅仅使探针化合物TMRE的摄取略有下降；而来氟米特在300μM即可使探针物TMRE摄取降至对照的50％以下，说明泰瑞米特钠对于线粒体的损伤作用明显低于来氟米特。泰瑞米特钠、泰瑞米特和来氟米特在较低浓度均可以促使大鼠原代肝细胞释放LDH，随着药物浓度增加，LDH的释放增加也相近。

上述研究结果提示，泰瑞米特钠、泰瑞米特和来氟米特的肝细胞毒性存在物种差异。三种药物对大鼠肝细胞的毒性相近，与来氟米特相比，泰瑞米特钠和泰瑞米特对大鼠肝细胞线粒体的损伤作用相对较轻。就人肝细胞而言，泰瑞米特钠和泰瑞米特的毒性显著低于来氟米特，与来氟米特和泰瑞米特相比，泰瑞米特钠在药物浓度>300μM时导致的LDH释放不会随着药物浓度的增加而增加。

实施例3

泰瑞米特钠在雌性MRL/lpr小鼠自发性红斑狼疮模型中的疗效作用观察

本研究的目的是观察不同剂量受试化合物泰瑞米特钠对狼疮模型动物的治疗作用，并与糖皮质激素和来氟米特进行比较。本研究所用动物模型为MRL/lpr小鼠，该模型小鼠由于Fas基因缺失，导致自身反应性CD4⁺T细胞不能通过凋亡途径清除，进而产生类似人类SLE的自身免疫疾病症状，在国际药理学研究领域被广泛应用于SLE发病机制的研究，以及药物药效学的研究。考虑到雌性MRL/lpr小鼠通常在8周龄至12周龄之间开始出现SLE的疾病症状，本研究自模型小鼠10-11周龄起给予药物干预，连续给药8周。

试验设计：

分组：

10-11周龄模型小鼠，根据体重及蛋白尿水平随机分为6组：

模型对照组(Vehicle)：12只*

PNS给药组2mg/kg：12只*

来氟米特给药组30mg/kg：13只

泰瑞米特钠给药组40mg/kg：13只

泰瑞米特钠给药组30mg/kg：13只

泰瑞米特钠给药组20mg/kg：13只

正常对照组：相同周龄BALB/c**小鼠11只

*模型对照组与PNS给药组最初随机分组为每组13只MRL/lpr小鼠，但在实验开始给药的第二周由于灌胃给药的操作失误，致使上述每组各有1只小鼠发生意外死亡减员，该死亡与狼疮疾病或药物性死亡无关，故将模型对照组与PNS给药组的实验小鼠数量调整为每组12只MRL/lpr小鼠。

**试验中选用非疾病动物品系BALB/c小鼠，给予溶剂作为对照组，可作为部分指标(脾脏重量、淋巴结重量、皮肤损伤、肾脏免疫复合物沉积等)阴性对照。

给药：灌胃，每天一次，一周给药7次，给药期8周。给药体积为0.1ml/10g体重。每周根据体重调整给药剂量。

试验指标检测：

常规观察和检查：

死亡和濒死：给药期所有动物每天观察1次。

临床观察：给药期所有动物每天观察1次。

体重：所有动物分组前称重1次，给药期每周称重1次。

尿蛋白检测：

采用考马氏亮蓝法检测尿液中蛋白浓度。

皮肤损伤评分、淋巴结肿大评分：

皮肤损伤：0分：无损伤；1分：面部及耳部小面积损伤；2分：直径<2cm的中度损伤(面部、耳部以及背部)；3分：直径>2cm的严重损伤(面部、耳部以及背部)。

淋巴结肿大*：0分：无可见的淋巴结肿大；1分：单一部位，小体积淋巴结肿大；2分：2处不同部位，中等体积淋巴结肿大；3分：3处或以上不同部位，较大体积淋巴结肿大。

*存活动物于给药期末颈脱臼处死，分离体表淋巴结进行称重和拍照对比。

组织病理学检查：试验结束时，处死动物，取左侧肾脏固定于10％福尔马林中，之后进行石蜡包埋，切片(6μm厚度)，H&E染色后显微镜下观察。委托上海药物研究所安全评价中心专业病理分析师评价肾脏组织学改变。

免疫荧光检测肾脏免疫复合物沉积：试验终点(试验终点前死亡个体的肾脏也同时进行评价)，取右侧肾脏冻在OCT包埋剂中，-80℃保存。临测前，制备冰冻切片(6μm厚度)，冰冷的丙酮中固定15分钟后，晾干，加入含2％BSA的PBS室温湿盒中封闭1小时后，加FITC-rabbitanti-mIgG(1：50稀释)。4℃避光1小时后，充分洗涤，封片，荧光显微镜拍照。

血清anti-dsDNA自身抗体检测：PBS稀释dsDNA(10μg/ml)，加入ELISA板，50μl/孔，密封后于4℃孵育18小时；洗液洗ELISA板3次，加入封闭液，100μl/孔，密封后于室温孵育1小时；洗板3次，加入标准品及样品，50μl/孔，密封后于室温孵育1小时；洗板3次，加入HRP酶联兔抗小鼠二抗rabbitanti-mouseIgG(H+L)，50μl/孔，室温1小时；洗板3次，加入TMB底物，50μl/孔，室温反应15-30分钟；加入25-30μlH₂SO₄终止液终止显色反应。酶标仪450/570nm处读取OD值。

ELISA法检测培养上清中细胞因子含量：根据ELISA试剂盒中的相关说明进行试验。过程如下：用包被稀释液将抗体稀释后加入ELISA板，50μl/孔，密封后于4℃冰箱孵育过夜；洗液洗ELISA板3次，加入封闭液，100μl/孔，室温1小时；洗板3次，加入标准品及样品，50μl/孔，密封后室温放置2小时；洗板3次，加入二抗，50μl/孔，室温放置1小时；洗板3次，加入HRP酶，50μl/孔，室温放置1小时；洗板3次，加入TMB底物，50μl/孔，室温反应15-30分钟；加入25μl/孔H₂SO₄终止液终止显色反应。酶标仪450/570nm处读取OD值，根据标准品计算样品中细胞因子的含量。

血清生化指标检测：试验终点血清用双蒸水按比例稀释后，采用HITACHI-7020全自动生化分析仪检测白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)水平。

流式细胞术检测细胞表面标志：脾细胞用FACS洗液洗1次。5×10⁵细胞使用2.4G2anti-Fcreceptor抗体(anti-CD16/CD32)阻断非特异性结合。加入荧光标记抗体于冰上避光作用20分钟；细胞用FACS洗液洗1次，重悬于0.5mlFACS洗液中，流式细胞仪检测，FlowJo软件(TreeStar，Ashland，OR)分析。

流式细胞术检测胞内细胞因子及转录因子：1×10⁶个细胞使用2.4G2anti-Fcreceptor抗体阻断非特异性结合。加入anti-CD4、anti-CD3、anti-CD25荧光抗体，冰上避光作用20分钟后用FACS洗液洗2次，重悬于0.5ml固定液中，固定1小时(或固定过夜)后加入穿膜缓冲液洗2遍后划散细胞，加入FoxP3、IL-17及IFN-γ的荧光标记抗体及各自相应的同型对照(isotypecontrol)，继续染色1小时。随后用FACS洗液洗1次，离心收集细胞，重悬于FACS洗液中，流式细胞仪检测，FlowJo软件(TreeStar，Ashland，OR)分析。对于胞内细胞因子染色，细胞需于收集染色前4小时加入50ng/mlPMA、750ng/mlionomycin及GolgiStop共培养，以产生足量可被检测的细胞因子。

实验结果：

研究结果显示，试验药物泰瑞米特钠20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg均能够有效改善模型小鼠的皮损、淋巴结肿大和脾脏肿大等狼疮症状，降低尿蛋白，降低血清抗双链DNA(dsDNA)抗体及IL-17水平，并有明显的量效关系；血清生化检查显示，治疗终点时泰瑞米特钠给药组的小鼠血清白蛋白含量明显高于空白对照组，血清肌酐和尿素氮存在下降的趋势。进一步研究发现，经泰瑞米特钠干预治疗后，模型小鼠脾脏淋巴细胞中DNT细胞(CD3⁺CD4^-CD8-)比例明显降低，调节性T细胞(CD3⁺CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺)比例明显提高，泰瑞米特钠40mg/kg组小鼠脾脏淋巴细胞中分泌IL-17的DNT细胞(CD3⁺CD4^-CD8^-IL-17⁺)比例较模型对照组也显著下降。在给药8周的试验结束时，空白对照组12只小鼠中有3只发病严重导致死亡，而给药组只有泰瑞米特钠40mg/kg组与20mg/kg组发生小鼠死亡各一只，30mg/kg组小鼠给药8周内全部存活。狼疮肾炎是系统性红斑狼疮主要且突出的内脏损害，通过对各组实验小鼠的肾脏进行HE切片染色、经病理学评估发现泰瑞米特钠给药能够显著减轻MRL/lpr小鼠肾小球肾炎和间质性肾炎的病变程度；而来氟米特(30mg/kg)对MRL/lpr小鼠肾小球肾炎、间质性肾炎的病理进程无明显的改善作用。

具体实验结果如表4和图4-8所示。

表4.MRL/lpr小鼠在给药期间的生存情况，生存只数(生存率，％)

与糖皮质激素相比，试验药物泰瑞米特钠(20mg/kg、30mg/kg和40mg/kg)在改善模型小鼠的皮损、淋巴结肿大和脾脏肿大，降低尿蛋白、血清抗双链DNA(dsDNA)抗体和IL-17等方面存在明显差别，泰瑞米特钠的总体疗效优于糖皮质激素；与来氟米特(30mg/kg)相比，相同剂量的泰瑞米特钠(30mg/kg)在降低MRL/lpr狼疮小鼠蛋白尿方面的疗效存在明显的优势。在给药8周后，泰瑞米特钠组模型小鼠患严重狼疮(尿蛋白≥300mg/dl)的比例明显低于来氟米特组。

上述研究结果提示，试验药物泰瑞米特钠(20mg/kg、30mg/kg和40mg/kg)能够有效控制MRL/lpr模型小鼠的自发性狼疮的病程进展，改善疾病症状和体征，以及相关血清学指标，对肾脏病理损伤等均具有明显的疗效作用。泰瑞米特钠的总体疗效优于糖皮质激素；与来氟米特(30mg/kg)相比，相同剂量的泰瑞米特钠(30mg/kg)在控制狼疮活动方面具有一定的优势。

实施例4

泰瑞米特钠对小鼠脾脏淋巴细胞体外免疫抑制活性研究

本试验运用CellCountingKit-8(CCK-8)法检测了泰瑞米特钠对小鼠脾脏淋巴细胞的非特异细胞毒性；运用[³H]-胸腺嘧啶脱氧核苷(³H-TdR)掺入法检测泰瑞米特钠对脾脏T、B淋巴细胞增殖的影响；运用ELISA法检测该系列样品对ConA诱导的小鼠脾脏淋巴细胞分泌IL-6、IL-17、IFN-γ等细胞因子的影响。所有试验均以来氟米特作为对照。

实验步骤：

1、细胞毒试验

小鼠脾脏淋巴细胞(8×10⁵个/孔)接种于96孔板，同时加入不同浓度泰瑞米特钠或来氟米特，另设相应的溶媒对照及培养液本底对照。37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。培养结束前8h加入20μlCCK8。培养结束时，测定OD值。

2、细胞增殖试验

常规制备4×10⁶个/ml脾脏淋巴细胞悬液，于96孔板中每孔加细胞100μl，加入50μl不同浓度受试样品，同时加入ConA(终浓度5μg/ml)诱导T淋巴细胞活化增殖，或者LPS(终浓度10μg/ml)50μl诱导B淋巴细胞活化增殖，另设相应的阳性对照及无刺激本底对照。37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。培养结束前8h掺入0.25μCi³H-thymidine。培养结束时，将培养板冻存于-20℃冰箱，待测。测定时将细胞用细胞收集仪收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta计数仪上读取掺入细胞DNA的³H-胸腺嘧啶核苷酸量，以cpm值代表细胞增殖的情况。

3、细胞因子生成试验

24孔培养板中小鼠脾细胞4×10⁶/孔，同时加入受试药物及ConA(5μg/ml)或LPS(10μg/ml)，另设相应刺激对照(仅加入细胞和刺激剂)和无刺激对照(只有细胞，无刺激剂)，并加入相应体积含10％FBS的1640培养液，终体积2ml。细胞于37℃培养箱中培养48小时，离心收集上清(5000rpm，4℃，5min)，采用ELISA法检测上清中细胞因子浓度。

实验结果：

结果如表5和表6以及图9所示，表明：泰瑞米特钠对小鼠脾脏细胞致半数毒性浓度(CC₅₀)为88.16±8.26μM，来氟米特为39.05±10.51μM；泰瑞米特钠对ConA引起的T淋巴细胞增殖半数抑制浓度(IC₅₀)为7.69±1.17μM，对LPS引起的B淋巴细胞增殖IC₅₀为27.82±6.64μM，来氟米特对ConA和LPS诱导的T、B淋巴细胞增殖的IC₅₀分别为15.90±3.13μM和34.73±5.96μM；泰瑞米特钠和来氟米特对丝裂原诱导的IL-6、IL-17、IFN-γ等细胞因子产生均具有一定的抑制作用。

本试验结果提示，与来氟米特相比，泰瑞米特钠对小鼠脾脏淋巴细胞的非特异细胞毒性相对较低，对丝裂原诱导的小鼠T、B淋巴细胞增殖抑制效应相对较强。

表5.泰瑞米特钠对BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞的细胞毒作用

表6.泰瑞米特钠对丝裂原诱导小鼠脾脏T和B淋巴细胞增殖反应的影响作用

实施例5

泰瑞米特钠对人外周血单核细胞免疫抑制活性研究

本试验运用CCK-8(CellCountingKit-8)法检测了泰瑞米特钠对人外周血单核细胞(PBMC)的非特异细胞毒性；运用[³H]-胸腺嘧啶脱氧核苷(³H-TdR)掺入法检测泰瑞米特钠对PHA诱导的PBMC增殖影响；运用ELISA法检测该系列样品对PHA诱导的人外周血单核细胞分泌细胞因子的影响。所有试验均以来氟米特作为对照。

实验步骤：

1、细胞毒试验：

PBMC(3×10⁵个/孔)接种于96孔板，加入指定浓度泰瑞米特钠或来氟米特，另设相应的溶媒对照及培养液本底对照。37℃，5％CO₂培养箱中培养48h。培养结束前8h加入20μlCCK8。培养结束时，测定OD值。

2、细胞增殖试验：

PBMC(3×10⁵个/孔)接种于96孔板，加入指定浓度泰瑞米特钠或来氟米特，同时给予PHA-M(1:80)稀释刺激48h，37℃,5％CO₂培养箱中孵育，培养结束前8h掺入0.25μCi3H-thymidine。培养结束时，将培养板冻存于-20℃冰箱。测定掺入细胞DNA的³H-thymidine，以cpm值代替细胞增殖情况。

3、混合淋巴细胞试验：

PBMC(3×10⁵个/孔)接种于96孔板，同时加入基因型不匹配的PBMC(3×10⁵个/孔，γ射线照射，6000rads)以及泰瑞米特钠，37℃，5％CO₂培养箱中培养5days。培养结束前24h掺入0.25μCi³H-thymidine。培养结束时，将培养板冻存于-20℃冰箱。测定掺入细胞DNA的³H-thymidine，以cpm值代替细胞增殖情况。

4、细胞因子生成试验：

PBMC(1.5×10⁶个/孔)接种于48孔板，加入指定浓度泰瑞米特钠或来氟米特，同时给予PHA-M(1：80)或Sac(0.01％)刺激24h。37℃，5％CO₂培养箱中孵育。离心收集上清(5000rpm，4℃，5min)，冻存于-20℃。根据ELISA相关试剂盒中的培养上清中人IFN-γ等的含量。

试验结果如表7和图10-12所示，泰瑞米特钠对PBMC的CC₅₀为283.22±33.00μM，来氟米特的CC₅₀为236.04±52.46μM；泰瑞米特钠抑制异基因抗原诱导的PBMC增殖反应的起效浓度为3.125μM，其抑制效应具有浓度依赖性，来氟米特的起效浓度为6.25μM-25μM；两种药物在浓度为100μM时均能抑制PBMC对T细胞丝裂原PHA的增殖反应；对PHA诱导正常人PBMC产生IFN-γ具有显著抑制作用。

表7.泰瑞米特钠对人外周淋巴细胞的半数细胞毒浓度

本试验结果提示，与来氟米特相比，泰瑞米特钠对人外周血单核细胞(PBMC)的非特异细胞毒性较低，对异基因抗原诱导的PBMC活化增殖的抑制效应较强。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种泰瑞米特钠的应用，其特征在于，用于制备预防和/或治疗自身免疫病的药物。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述自身免疫疾病为系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病关节炎或多发性硬化症。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述泰瑞米特钠或所述药物通过口服或非经肠道给予对象。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述泰瑞米特钠或所述药物给予对象1-3次/天，10-100mg/天。

5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式为片剂、胶囊、丸剂、锭剂、颗粒剂、微颗粒剂、悬浮液、粉末、糖锭、酏剂、注射剂、液剂、油膏剂、栓剂或贴膏剂。

6.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述泰瑞米特钠的给药剂量在不超过200mg/d的情况下，在人体不会产生肝脏毒性或仅产生较低的肝脏毒性，所述产生较低的肝脏毒性是指肝转氨酶升高不超过正常值上限的1.5倍。

7.一种药物组合物的用途，其特征在于，所述药物组合物包含泰瑞米特钠和药学上可接受的载体，用于预防和/或治疗自身免疫病的药物。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述自身免疫疾病为系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、银屑病关节炎或多发性硬化症。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物组合物通过口服或非经肠道给予对象；和/或

所述药物组合物给予对象1-3次/天，10-100mg泰瑞米特钠/天。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物组合物的制剂形式为片剂、胶囊、丸剂、锭剂、颗粒剂、微颗粒剂、悬浮液、粉末、糖锭、酏剂、注射剂、液剂、油膏剂、栓剂或贴膏剂。