CN105392803A - C5aR拮抗剂的用途 - Google Patents

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Abstract

C5a和C5aR刺激炎性反应，而C5aR拮抗剂可抵消该功能，其作为抗炎剂起作用。认为该功能性可用于治疗炎性疾病，包括自身免疫疾病。此外，已发现C5a和C5aR具有与骨体内稳态和重塑相关的功能，和C5aR拮抗剂可用于治疗骨损伤，例如骨质侵蚀和骨密度损失，和用于治疗骨损伤和软骨损伤。

Description

C5aR拮抗剂的用途
技术领域
本发明涉及C5aR拮抗剂的另外的治疗用途，具体而言与骨损伤和与其相关的疾病和病症有关的用途。
背景
C5aR是补体因子5的A片段(C5a)的受体。该受体在许多不同细胞类型(包括白细胞)上表达。C5aR属于七次跨膜G-蛋白-偶联受体的家族，并且是C5a的高亲和力受体，其Kd为约1nM。受体的结构符合七次跨膜受体家族，其中胞外N-末端后接着通过交替作为胞内和胞外环的螺旋间结构域连接的7个跨膜螺旋，和以胞内C-末端结构域终止。
C5a与C5aR拮抗剂反应的抑制减少通过C5a介导的急性炎性反应，而不影响其它补体成分。为此，先前已描述了C5aR肽拮抗剂和抗-C5a受体抗体(Watanabe等,1995JournalofImmunologicalMethods185:19-29;Pellas等,1998;Konteatis等,1994;Kaneko等,1995;Morgan等,1993)。例如，WO95/00164描述针对C5aR的N-末端肽(残基9-29)的抗体。WO03/062278描述与第2个胞外环反应的抗体(包括称为7F3、6C12和12D4的克隆)。其它C5aR抗体描述于WO/022390和近来的WO2012/168199。所有数据证实，有效阻断C5a与其受体C5aR结合可体外抑制C5a刺激的嗜中性粒细胞迁移和预防动物模型的炎症。
C5a是参与炎性疾病例如类风湿性关节炎的发病的促炎蛋白，C5a和C5aR在类风湿性关节炎中的关联已在C5aR遗传缺陷小鼠中得到证实，所述小鼠较不易于诱发关节炎(Ji等(2002)Immunity16:157-168;Grant等(2002)JExpMed196:1161-1171；Lee等,2006(NatBiotechnol.2006Oct;24(10):1279-84)和Hishimoto等2010,JExpMed.2010Jun7;207(6):1135-43)。此外，用小分子C5aR拮抗剂(一种环肽)治疗，可在大鼠中诱发关节炎后减少炎症和肿胀(Woodruff等(2002)ArthritisRheum46:2476–2485)。
类风湿性关节炎(RA)是一种关节的炎性疾病。受累的关节通常肿胀和发热，并随时间逐渐变得更加疼痛和僵硬。随后的症状包括严重影响患者的运动性的关节破坏(包括骨损伤)，并可包括骨变形。
尽管用于治疗这样的炎性疾病的大多数药物主要是抗炎性的，但极为重要和引人关注的是，RA和相关疾病的治疗还积极影响关节和骨破坏。除了RA之外，骨损伤的发生还可与其它关节炎疾病有关，甚至与炎症疾病无关。
成骨细胞和破骨细胞共同负责维持骨，因为破骨细胞可不断损坏骨组织而成骨细胞刺激骨形成并因而增加骨质量和/或骨密度。因此，可影响骨体内稳态和重塑的调节的任何化合物可能是相关的，并在影响骨的疾病或病症和特别是骨损伤包括骨质侵蚀的治疗中具有广泛应用。
简述
本申请的发明人已经发现，除了C5aR拮抗剂具有可用性的适应症/症状之外，C5aR拮抗剂还具有治疗关节破坏、骨损伤和特别是抑制骨质侵蚀的延伸的功能性。
本发明的一个方面涉及C5aR拮抗剂用于治疗或预防骨损伤的用途，例如用于治疗或预防骨损伤的方法的C5aR拮抗剂。骨损伤在此处被认为包括骨质侵蚀和骨密度损失。此外，C5aR拮抗剂可进一步用于联合治疗或预防骨损伤和软骨降解。这样的治疗或预防可用于降低骨损伤的速率和/或用于改善或增加骨矿物质密度。骨损伤至少部分地是影响关节的炎性疾病(特别是关节炎)的症状，因此，根据本发明，C5aR拮抗剂可用于治疗或预防患有各种形式的关节炎之一的受试者的骨损伤。
本发明人令人惊讶地发现，使用C5aR拮抗剂的治疗作用提供快速反应，因为治疗效果可在少数剂量后就已被观察到。在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗或预防骨损伤的方法的C5aR拮抗剂，其中在4、3、2或1个剂量后可获得效果。
根据本发明，拮抗剂的功能性可被认为与拮抗剂通过抑制或降低C5a与C5aR的结合和/或通过抑制或降低C5aR介导的C5a生物学作用来拮抗C5aR的能力关联，C5aR介导的C5a生物学作用例如：a)C5a诱导的嗜中性粒细胞活化，b)C5a诱导的细胞迁移和/或c)C5a诱导的嗜中性粒细胞成熟。
本发明的C5aR拮抗剂可以是适于治疗性给予的任何类型的化合物，包括抗体和肽分子。本发明的C5aR拮抗剂可作为任选包括一种或多种药用赋形剂的药物组合物的一部分给予。在一个方面，本发明涉及用于治疗或预防骨损伤的方法，所述方法包括给予有需要的个体治疗有效量的本文所述的C5aR拮抗剂。
序列表
SEQIDNO.1:人C5aR
MDSFNYTTPDYGHYDDKDTLDLNTPVDKTSNTLRVPDILALVIFAVVFLVGVLGNALVVW
VTAFEAKRTINAIWFLNLAVADFLSCLALPILFTSIVQHHHWPFGGAACSILPSLILLNM
YASILLLATISADRFLLVFKPIWCQNFRGAGLAWIACAVAWGLALLLTIPSFLYRVVREE
YFPPKVLCGVDYSHDKRRERAVAIVRLVLGFLWPLLTLTICYTFILLRTWSRRATRSTKT
LKVVVAVVASFFIFWLPYQVTGIMMSFLEPSSPTFLLLKKLDSLCVSFAYINCCINPIIY
VVAGQGFQGRLRKSLPSLLRNVLTEESVVRESKSFTRSTVDTMAQKTQAV
第2个环通过下划线AA171-206表示。
SEQIDNO.2:小鼠C5aR
MNSSFEINYDHYGTMDPNIPADGIHLPKRQPGDVAALIIYSVVFLVGVPGNALVVWVTAF
EPDGPSNAIWFLNLAVADLLSCLAMPVLFTTVLNHNYWYFDATACIVLPSLILLNMYASI
LLLATISADRFLLVFKPIWCQKVRGTGLAWMACGVAWVLALLLTIPSFVYREAYKDFYSE
HTVCGINYGGGSFPKEKAVAILRLMVGFVLPLLTLNICYTFLLLRTWSRKATRSTKTLKV
VMAVVICFFIFWLPYQVTGVMIAWLPPSSPTLKRVEKLNSLCVSLAYINCCVNPIIYVMA
GQGFHGRLLRSLPSIIRNALSEDSVGRDSKTFTPSTDDTSPRKSQAV
第2个环通过下划线AA167-203表示。
附图简述
图1示出抗-C5aRmAb与嵌合人/小鼠C5aR的结合。图指出源自人和小鼠的C5a受体蛋白的区，小鼠序列用粗线表示和人序列用细线表示。
图2示出作为Δ平均荧光强度(FI)定量的C5a-诱导的CD11b表达：从获自未加入C5a的血液的平均FI值中减去给定抗-C5aRmAb浓度的平均FI值。mAb20/70的结果表示为mAb浓度的函数。虚线表示IC50值，其计算为0,6μg/ml。
图3示出抗-C5aR减少CIA小鼠模型的组织学评分。图示出分别用抗-C5aR、Enbrel?(Etanercept)和同种型对照治疗来治疗的小鼠的组织学评分指数。对各小鼠的两个后爪进行关节炎变化的组织病理学终点评价。与同种型对照治疗相比，用抗-C5aR治疗显著减少组织学评分指数。
图4示出在CIA小鼠模型中抗-C5aR抑制骨质侵蚀和软骨降解。对各小鼠的最坏受累的后爪的HE染色切片评价骨质侵蚀和软骨降解。与用抗-TNP对照抗体治疗的小鼠相比，用抗-C5aR治疗显著减少骨质侵蚀和软骨降解两者。
图5示出用抗-C5aR治疗降低在单爪关节炎模型中的各种关节炎参数。从用阻断性抗-C5aR抗体或同种型对照抗体治疗的具有DTH-关节炎的小鼠中获得数据。抗-C5aR治疗显著减少关节炎变化，包括滑膜炎、软骨降解和骨质侵蚀。此外，治疗显著减少炎性细胞的关节外浸润。
图6示出在CIA小鼠模型中治疗后48小时用抗-C5aR的单剂量改善关节炎。图6A和6B分别示出随时间的平均临床评分(±SEM)/组和AUC(个体临床评分的曲线下面积)。黑线表示平均值。图6C示出组织学评分指数。临床和组织病理学评价均表明显著减少疾病。
图7示出单剂量的抗-C5aRmAb后60小时DTHA模型中疾病活动减少。7A示出两个治疗组中关节炎诱导后经60小时测量的爪和踝肿胀的曲线下面积(AUC)。显示平均值±SEM，n=10。*:p≤0.05;**:p≤0.01，Studentt检验。7B示出0-3刻度上的在两个治疗组中关节炎和炎性参数的半定量组织病理学评分。用抗-C5aR治疗的小鼠显示较低程度的滑膜炎、软骨破坏和骨质侵蚀。n=10。*:p≤0.05;**:p≤0.01;***:p≤0.001，Studentt检验，具有Welch校正。7C示出B中的个体评分的总和(关节炎总评分)和减去额外的关节浸润的B中的个体评分的总和(关节炎评分)。最大可能评分分别是15和9。n=10。*:p≤0.05;**:p≤0.01，Studentt检验，具有Welch校正。
描述
C5aR拮抗剂的用途
抑制或减少通常由配体-受体相互作用引起的生物学反应的化合物或药物被称为受体拮抗剂。这样的受体拮抗剂会结合受体，但相互作用将没有效力。因此，拮抗剂的存在会抑制或减少受体的配体的生物学作用。拮抗剂的作用可通过结合受体的活性位点而阻断或干扰配体相互作用来介导。或者，拮抗剂可在也有效防止配体结合或受体信号转导的不同位点上结合受体。
已发现，基于来自数个特定关节炎疾病模型的结果，C5aR拮抗剂具有在治疗炎性疾病和病症中的关联性。因此，在结合C5a时由C5a受体介导的信号转导可受到抑制或减少，导致抑制或减少发展中的炎症过程，因此关节肿胀减轻。此外，已发现，C5a和C5aR具有与骨体内稳态和重塑有关的功能。本申请的发明人进一步确立，C5aR拮抗剂具有对骨损伤的有利作用。
本发明的一个方面涉及用于治疗或预防骨损伤或用于治疗或预防骨损伤的方法的C5aR拮抗剂。在一个类似的方面中，本发明涉及C5aR拮抗剂在制备用于治疗骨损伤的药物中的用途。
C5aR拮抗剂影响骨损伤的发展的能力可能涉及骨质侵蚀和骨密度损失中的一项或多项。一般而言，治疗是非常广义的术语并涵盖多个方面，包括作为对患者的益处见到的任何作用，所述患者患有骨损伤或有发展骨损伤的风险，例如骨质侵蚀和骨密度损失中的一项或多项。在本说明书中，当涉及观察到骨损伤的情况时使用治疗，而当涉及尚未观察到骨损伤的情况时使用预防。注意，在本文件的实施例中，“治疗”仅是指给予化合物，而不论该给予的任何治疗效果。
在一个实施方案中，C5aR拮抗剂用于治疗骨损伤(骨质侵蚀和骨密度损失中的一项或多项)和软骨破坏的方法。
骨损伤通过可导致对关节移动性有严重影响的连续过程发生。给定患者的骨损伤可在患者(或医师)知道他或她具有发生骨损伤风险之前已经开始。在其它情况中，C5aR拮抗剂可用于预防有发生骨损伤的风险的患者的骨损伤。在一个实施方案中，C5aR拮抗剂可用于预防性治疗骨损伤的方法。
在一些实施方案中，C5aR拮抗剂用于治疗以逆转或减少骨损伤，例如使关节的骨质再生。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂用于治疗以改进骨矿物质密度。
骨损伤可完全预防或完全治疗可能是罕见的，和C5aR拮抗剂治疗的目的可能更经常是延缓或停止骨损伤的进展或预防骨损伤的进一步发展。
在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂用于预防骨损伤、用于减少骨损伤和/或用于抑制骨损伤。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂用于延缓或停止骨损伤进展。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂用于抑制骨损伤的进展。
在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂用于在哺乳动物受试者和特别是人受试者中治疗骨损伤的方法。从上文显而易见的是，本发明涉及在人受试者中治疗骨损伤的任何方面，例如预防、抑制、停止和逆转骨损伤。同样，本发明涉及治疗骨损伤，包括在人受试者中骨质侵蚀和骨密度损失中的一项或多项。
因此，本发明涉及用于治疗受试者的骨损伤的方法的C5aR拮抗剂，其中所述受试者是有需要的个体。因此，有需要的个体是可能获益于治疗骨损伤的个体，例如患有骨损伤或具有发展骨损伤的风险的患者，所述骨损伤同样包括骨质侵蚀和骨密度损失中的一项或多项。
在进一步的实施方案中，治疗的受试者可以是患有关节炎的患者。在一个实施方案中，受试者具有骨关节炎(变性关节疾病)。在进一步的这样的实施方案中，骨关节炎可以是由于对关节的创伤、关节感染或与年龄相关。在一个实施方案中，受试者具有类风湿性关节炎，其还可包括具有青少年特发性关节炎(JIA)(亦称为青少年类风湿性关节炎(JRA))的受试者。在一个实施方案中，受试者具有脓毒性关节炎。在一个实施方案中，受试者具有银屑病性关节炎。
在进一步的实施方案中，受试者可具有痛风(gout或podagra)(如果发作的区域包括大脚趾)。在进一步的实施方案中，受试者可具有脊柱关节病(SpA)，亦称为别赫捷列夫氏病(Bechterew'sdisease)或玛丽-斯特伦佩尔病(Marie-Strümpelldisease)，包括强直性脊柱炎(AS)和银屑病性关节炎(PsA)。
诊断关节炎的标准可随时间而不同，并取决于地方惯例和给定患者受能够诊断关节炎和其不同形式的专家检查的时间。在一个实施方案中，受试者具有关节炎的一个或多个症状，例如类风湿性关节炎的一个或多个症状。
在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂用于治疗骨损伤的方法，例如抑制、停止和/或逆转骨损伤以获得快速反应。在一个实施方案中，C5aR拮抗剂用于治疗骨损伤的方法，以获得快速反应。在这样的实施方案中，如果在有限数量的剂量后，例如最多5个剂量后，例如最多3个剂量后或优选在少至2个或甚至1个剂量的C5aR拮抗剂后可检测，则认为存在快速反应。取决于使用的C5aR拮抗剂，预期给药的不同时机并就个案来确定。如果C5aR可用于获得快速反应，则考虑的时间可由此在药物间改变。在一个实施方案中，在施用第5个剂量之前，例如在给予第4、3或2个剂量之前快速反应可以检出或是可检出的。在一个实施方案中，在给予第2个剂量之前快速反应可以是可检出的。如果预知一周一次给药，则反应可由此在从第1个剂量的一个月内或在第1个剂量的4个周内或在第1个剂量的3个周内或在第1个剂量的2个周内或在第1个剂量的1个周内预期。
快速反应可通过技术人员已知的多种方法检出，如被认为是对疾病和所寻求的效果而言恰当的。
因为在患者中治疗骨损伤不是可容易测量的，因此可使用替代的间接方法。
因此，反应可通过相关疾病生物标志物的测量检测，例如描述疾病活动的标志物，例如细胞因子和化学引诱物。如果获得早期反应，则反映特定细胞类型存在的标志物，例如检测嗜中性粒细胞的MPO以及组织重塑和/或胞外基质体内稳态的标志物可用于评价。为清楚的目的，注意可认为还在其中未实际测量效果的情况下获得快速反应，例如其中如果相关测量已经进行则反应可已被检出的情况。
在一个实施方案中，快速反应通过局部或在外周内测量相关标志物检出(或是可检出的)，其中在血清样品中外周信号优选是可检出的。
在一个实施方案中，C5aR拮抗剂用于治疗骨损伤或骨质侵蚀的方法，以寻求上述的快速反应，其中嗜中性粒细胞标志物(如细胞因子标志物、化学引诱物标志物或组织重塑标志物)的相关变化可被观察到。合适标志物的实例可见表1，并且显然其它标志物对技术人员而言为可获得的。
在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂用于口服给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂用于静脉内给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂用于皮下给予。
在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂用于每日给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂用于每周两次给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂用于每周一次给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂用于每隔一周给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂以每第20-25天或例如每月一次的频率给予。
治疗方法
在一个方面，本发明涉及用于治疗或预防骨损伤的方法，包括给予有需要的个体治疗有效量的C5aR拮抗剂。在本发明的范围内，方法可涵盖变化和等于该方面的实施方案和上文描述的涉及使用C5aR拮抗剂的实施方案。其实例是用于治疗疾病或病症的实施方案，其中延迟、停止和/或抑制骨损伤进展对个体是有益的，包括给予所述个体治疗有效量的C5aR拮抗剂。在一个实施方案中，用于治疗骨损伤的方法包括给予有需要的个体治疗有效量的C5aR拮抗剂，其中所述C5aR拮抗剂口服给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂静脉内给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂皮下给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂一天一次给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂一周两次给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂一周一次给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂每隔一周给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂以每第20-25天或例如每月一次的频率给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂包含在下文所述的药物组合物中。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗骨损伤或骨质侵蚀的方法，包括给予有需要的个体治疗有效量的C5aR拮抗剂，其中快速反应是可检出的。如上文所述，快速反应可以指这样的情况，其中嗜中性粒细胞标志物(例如细胞因子标志物、化学引诱物标志物或组织重塑标志物)的相关变化可以在有限数量的剂量或从第1次给予起的有限时间后被观察到。
在这样的实施方案中，如果在有限数量的剂量之后，例如在至多5个剂量、例如至多3个剂量后或优选在少至2个或甚至1个剂量的C5aR拮抗剂后是可检出的，则认为存在快速反应。
取决于使用的C5aR拮抗剂，预期给药的不同时机并就个案来确定。如果C5aR可用于获得快速反应，则考虑的时间可因此在药物间改变。在一个实施方案中，在施用第5个剂量之前，例如在给予第4、3或2个剂量之前，快速反应可检出或是可检出的。在一个实施方案中，在给予第2个剂量之前快速反应可以是可检出的。如果预知每周一次给药，则反应可因此在从第1个剂量起的1个月内或在第1个剂量的4个周内或在第1个剂量的3个周内或在第1个剂量的2个周内或在第1个剂量的1个周内预期。
C5aR拮抗剂
C5a，补体因子5的A片段，结合其受体C5aR并刺激炎性反应。C5aR拮抗剂对C5a反应的抑制减少C5a介导的急性炎性反应，而不影响其它补体成分。不同类型的C5aR拮抗剂之前已有描述(参见背景部分)，包括肽分子，例如环肽和抗-C5a受体抗体。
C5aR拮抗剂的关键特征是分子与C5aR而不与其它类似受体例如C5L2(其亦是C5a的受体)特异性相互作用(在给定物种中)的能力。根据本发明，C5aR拮抗剂与C5aR特异性相互作用。该相互作用导致抑制或减少C5a与C5aR的结合。
术语“结合”、“特异性结合”和“结合特异性”在本文用于描述C5aR拮抗剂的选择性。
抗-C5aR拮抗剂的功能性取决于所述拮抗剂显著抑制或减少C5a与C5aR结合的能力。在一个实施方案中，本发明涉及能够显著抑制或减少C5a与C5aR结合的C5aR拮抗剂。这可通过描述于本文实施例2的置换测定法(SPA)来测定，可由其测定IC50值。在一个实施方案中，IC50低于50nM。在本发明的进一步的实施方案中，在SPA测定法中C5aR拮抗剂置换C5a，其IC50低于50nM，例如低于40nM，例如低于30nM，例如低于20nM，例如低于10nM，例如低于5nM或甚至低于4nM，或其IC50低于3nM或甚至低于2.5nM或2.0nM。
术语结合“亲和力”用于描述单价相互作用(内在活性)。两个分子(例如拮抗剂和受体)之间通过单价相互作用的结合亲和力可通过测量复合物形成和解离的动力学(例如通过表面等离子体共振(SPR)方法)而测定解离常数(KD)来定量。对应于单价复合物的缔合和解离的速率常数分别称为缔合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。KD通过等式KD=kd/ka与ka和kd相关。此外，"亲和力"涉及在分子(例如拮抗剂)的单个结合位点和配体(此处为受体)之间的结合强度。分子X对配体Y的亲和力表示为解离常数(Kd)，其为占据溶液中存在的一半X分子的结合位点所需要的Y的浓度。较小的Kd表示较强或较高的亲和相互作用，和需要较低浓度的配体来占据所述位点。同样地，相互作用的特异性可通过测定和比较目的相互作用(例如拮抗剂和受体之间的特异性相互作用)的KD值与非目的相互作用的KD值来评价。
术语“显著地”用于描述作用具有生物学相关性，例如至少10或20%抑制或例如至少10或20%诱导。
或者，C5aR拮抗剂的亲和力可在使用嗜中性粒细胞进行的竞争配体结合测定法中测定。该功能性称为拮抗剂的亲和力，如在竞争测定法中所测量，但也可认为是相互作用的亲和力的测量。离体测定法测量C5aR拮抗剂在体外环境中中和C5a介导的作用的能力。在一个实施方案中，C5aR拮抗剂具有低于1.0nM或0.80nM、例如低于0.50nM或0.35nM的亲和力，如通过竞争配体结合测定法对嗜中性粒细胞所测量。
C5aR拮抗剂的其它功能性质是抑制嗜中性粒细胞的C5a-依赖性迁移的能力。该功能性可按本文实施例2所述评价。显示该功能性的抗体的实例描述于WO2012/168199。在一个实施方案中，本发明因此涉及C5aR拮抗剂，其中所述C5aR拮抗剂抑制C5a诱导的细胞迁移(体外或体内)。
在一个实施方案中，本发明涉及能够显著抑制人嗜中性粒细胞的迁移的C5aR拮抗剂。
在一个实施方案中，C5aR拮抗剂显著抑制嗜中性粒细胞体外迁移。
在一个实施方案中，与在10nMC5a存在下和无C5aR拮抗剂时观察到的迁移水平相比，抗体抑制迁移至少于50%、少于40%、少于30%、少于20%或少于10%。在一个这样的实施方案中，在10nMC5a和C5aR拮抗剂的存在下在30分钟后测量迁移，并与在10nMC5a的存在下和无C5aR拮抗剂时在30分钟后观察到的迁移水平相比。或者，C5aR拮抗剂抑制嗜中性粒细胞迁移的能力可基于相同的设定使用IC50值表示。在一个这样的实施方案中，IC50低于2.5μg/ml，例如低于2.5μg/ml，例如低于1.5μg/ml，例如低于1.2μg/ml或甚至低于1.0μg/ml。
体外测定C5aR拮抗剂的功能性的其它方法是钙流测定法，其测量C5aR拮抗剂离体抑制C5a诱导的嗜中性粒细胞活化的能力，同样描述于实施例2。在进一步的实施方案中，本发明涉及C5aR拮抗剂，其中钙流测定法中所测定的IC50低于7.0μg/ml，例如低于5.0μg/ml，例如低于2.5μg/ml。
其它离体测定法可用于基于第二作用(例如CD11b和CD62L表达)测定C5aR拮抗剂抑制或中和C5a诱导的嗜中性粒细胞成熟的能力。CD11b和CD62L是嗜中性粒细胞的成熟标志物，因为在通过C5a/C5aR相互作用活化时它们分别被上调和下调。
在一个实施方案中，本发明涉及C5aR拮抗剂，其在CD11b上调测定法中测定的IC50为低于3.5μg/ml，例如3.0μg/ml，例如低于2.5μg/ml，例如低于2.0μg/ml或例如1.5μg/ml或甚至低于1.0μg/ml。
同样，可测定C5aR拮抗剂在CD62L下调测定法中的作用。在一个实施方案中，本发明涉及C5aR拮抗剂，其在CD62L下调测定法中测定的IC50为低于1.8μg/ml，例如低于1.5μg/ml，例如低于1.2μg/ml或甚至低于1.0μg/ml。
技术人员将知道测定给定化合物是否是合适C5aR拮抗剂的其它标准，并因此可在本发明的范围内选择偏好的测定法。
尽管C5a和C5aR分子在物种之间具有相似性，但C5aR拮抗剂可以是物种特异性的，例如对人复合物或小鼠复合物具有特异性。在一个实施方案中，拮抗剂是人C5aR拮抗剂。在一个实施方案中，拮抗剂是小鼠C5aR拮抗剂。
不同类型的分子可具有C5aR拮抗剂功能。在一个实施方案中，C5aR拮抗剂是抗体。
如本文所用，术语“抗体”用于描述完整抗体和其特异性结合其相应抗原(此处为C5aR)的任何抗原结合片段(即“抗原-结合部分”)或单链分子。抗原-结合片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、F(ab)S、Fv(通常为抗体单臂的VL和VH结构域)、单链Fv(scFv)、dsFv、Fd(通常为VH和CHI结构域)和dAb(通常为VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；包含单个VH和单个VL链的价分子；微型抗体(minibody)、双链抗体、三链抗体、四链抗体和kappa抗体(kappabody)(参见例如Ill等.ProteinEng1997;10:949-57)；骆驼IgG；IgNAR；以及一个或多个分离的CDR或功能互补位，其中所述分离的CDR或抗原-结合残基或多肽可缔合或连接在一起，以形成功能抗体片段。各种类型的抗体片段已描述或综述于例如Holliger和Hudson,NatBiotechnol2005;2S:1126-1136;WO2005040219和公布的美国专利申请20050238646和20020161201。用于产生抗体、完整抗体或抗原结合片段的方法是本领域已知的。小鼠单克隆抗体通常通过融合骨髓瘤细胞与来自已用所需抗原免疫的小鼠的脾细胞制备。人单克隆抗体可获自编码人抗体的转基因动物(例如小鼠或其它合适的物种)。或者，制备重组单克隆抗体可涉及称为库克隆或噬菌体展示/酵母展示的技术。重组抗体工程改造涉及使用病毒或酵母以产生抗体，而不是小鼠。重组技术也可用于产生“人源化”抗体，其在本文称为包含源自非人种系免疫球蛋白序列的序列(通常至少最小互补决定区(CDR序列))的人/非人嵌合抗体。人源化抗体因此是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被具有所需的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)(例如来自小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区的残基替换。
在一个实施方案中，C5aR拮抗剂是结合C5aR的第2个环的抗体。在一个实施方案中，C5aR拮抗剂是结合人C5aR的第2个环(AA175-206)的抗体。在一个实施方案中，C5aR拮抗剂是结合AA179-186(EEYFPPKV)的抗体。在一个实施方案中，C5aR拮抗剂是结合小鼠C5aR的相应的第2个环的抗体。
在这样的实施方案中，抗体可以是单克隆抗体，例如具有描述于WO03/062278、WO/022390和WO2012/168199的任一个中的抗体之一的CDR序列或可变区的抗体。C5aR拮抗剂抗体可描述为分离的，以表示已自其天然环境的另一/其它成分分离和/或回收的抗体，和/或自其自然环境中的成分的混合物纯化的抗体。
在一个实施方案中，C5aR拮抗剂抗体具有IgG同种型，例如IgG1、IgG2或IgG4。
抗体通过Fc结构域与各种Fc受体相互作用，因此相应地考虑这样的相互作用是否有利，如WO2012/168199中所述，例如具有一个或多个Fc突变的抗体，所述突变选自E233P、L234A或V234A或F234L或F234V、L235E或L235A、G236R或G236A、G237A、S239D、S254W、N297Q、L328R、A330S、P331S和I332E。在一个实施方案中，抗体Fc是包括234A、L235E、G237A、A330S和P331S突变的IgG1。抗体可另外包括D327Q突变。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体不显著体外诱导嗜中性粒细胞的吞噬作用，这意味着吞噬作用的水平不显著高于在抗-C5aR抗体不存在的情况下所测量的背景。在一个实施方案中，抗体不产生任何可检测的吞噬作用诱导。用于评价吞噬作用水平的测定法可使用人嗜中性粒细胞进行，如描述于WO2012/168199的实施例4。
在备选的测定法中，可评价抗-hC5aR抗体介导细胞耗尽例如诱导ADCC(抗体依赖性细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)的能力。测定法应用C5aR表达细胞作为靶细胞和效应细胞(单核细胞耗尽的PMBC)或含补体血清，以引发反应。测定法进一步描述于WO2012/168199的实施例4。
为本申请的目的，抗体和其片段被认为是非肽化合物，因为此处使用的该术语涉及更小分子。在一个实施方案中，C5aR拮抗剂是非肽化合物。
在一个实施方案中，C5aR拮抗剂是肽分子，例如源自C5a或C5aR的肽。在一个实施方案中，C5aR拮抗剂是环肽，例如通过Orn的侧链和末端羧酸酯环化的3D53(AcPHe-Orn-Pro-DCha-Trp-Arg)(Wong等,IDrugs.1999Jul;2(7):686-93)，其已显示抑制C5a与完整PMN的结合和也抑制PMN脱粒(Finch等,JMedChem.1999Jun3;42(11):1965-74)。化合物3D53亦称为PMX53。此外，另一类似的化合物为PMX205(WoodruffTM:FASEBJ,Vol.20(9),1407-1417,2006)。
除了上述的PMX53和PMX205之外，根据本发明可使用的其它C5aR拮抗剂还可包括以下的一个或多个：MP-435(MitsubishiTanabe/J&J)、CCX-168(ChemoCentryx/GSK)、MEDI7814(MedImmune)、ARC1905(Ophtotech)、NOX-D19(NoxxonPharma)、ADC-1004(AlligatorBiosciences)和NGD2000-1(Neurogen)。
治疗有效量的C5aR拮抗剂应当对各化合物测定，并将取决于多个原因，例如效力、生物利用度和体内半寿期。给予的剂量因此视化合物而不同。在C5aR拮抗剂是抗体的一个实施方案中，抗体可以从0.010mg/kg直至6mg/kg的剂量给予。
药物制剂
本发明还包括药物组合物和/或制剂，其包含药学上可接受的载体和本发明的C5aR拮抗剂。
在本发明的一个方面，本发明的C5aR拮抗剂可用于制备药物组合物。这样的药物组合物可根据本领域例如药典(Pharmacopeia)或Remington中的一般知识制备。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含本文所述的抗体以及与药学上可接受的载体。制剂可以呈液体制剂或干燥制剂的形式，干燥制剂在给予之前在水或含水缓冲液组合物中复溶。制剂可以呈含水制剂的形式。在一个实施方案中，制剂可以是呈片剂或胶囊形式的干燥制剂。在一个实施方案中，制剂是无菌的。
本发明的抗体的药物组合物可包含盐和/或缓冲液，例如描述于WO2011/104381中的组合物。
在进一步的实施方案中，本发明的抗体的药物组合物可适合于多种用途，例如描述于WO2011/147921中的组合物。
在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂的药物组合物可用于静脉内给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂的药物组合物用于皮下给予。
在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂的药物组合物用于口服给予。
在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂的药物组合物用于每日给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂的药物组合物用于每周两次给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂的药物组合物用于每周一次给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂的药物组合物用于每隔一周给予。在进一步的实施方案中，C5aR拮抗剂的药物组合物以每第20-25天或例如每月一次的频率给予。
本发明可通过但不限于下文描述的实施方案进一步描述。发现结果还通过本文提供的实施例来说明。
实施方案
1.C5aR拮抗剂，其用于治疗或预防骨损伤。
2.C5aR拮抗剂，其用于治疗或预防骨损伤，其中骨损伤包括骨质侵蚀和骨密度损失中的一项或多项。
3.C5aR拮抗剂，其用于治疗或预防骨损伤和软骨降解。
4.实施方案1-3中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述治疗用于减少骨损伤和/或软骨降解的速率。
5.实施方案1-3中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述治疗用于抑制或停止骨质侵蚀的进展。
6.实施方案1-3中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述治疗用于增加骨密度。
7.实施方案1-3中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述治疗用于预防骨质侵蚀。
8.实施方案1-7中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂用于治疗哺乳动物，例如人受试者。
9.实施方案8的C5aR拮抗剂，其中所述受试者患有骨质侵蚀或骨密度降低。
10.实施方案8的C5aR拮抗剂，其中所述受试者具有关节炎的一个或多个症状。
11.实施方案8的C5aR拮抗剂，其中所述受试者具有关节炎。
12.实施方案11的C5aR拮抗剂，其中所述受试者具有骨关节炎。
13.实施方案11的C5aR拮抗剂，其中所述受试者具有类风湿性关节炎。
14.实施方案11的C5aR拮抗剂，其中所述受试者具有银屑病性关节炎。
15.实施方案11的C5aR拮抗剂，其中所述受试者具有脓毒性关节炎。
16.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂抑制或减少C5a与C5aR的结合。
17.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中在SPA测定法中C5aR拮抗剂替换C5a，其IC50低于50nM。
18.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂抑制C5aR介导的C5a信号转导。
19.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中在竞争配体结合测定法中对嗜中性粒细胞测量的C5aR拮抗剂的亲和力为低于0.80nM。
20.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂离体中和C5a诱导的嗜中性粒细胞活化，其中在钙流测定法中测定的IC50为低于7.0μg/m。
21.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂抑制C5a诱导的细胞迁移。
22.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂显著体外抑制嗜中性粒细胞迁移。
23.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂减少迁移至少于50%。
24.前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂减少迁移，其IC50为低于2.5μg/ml。
25.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂离体抑制C5a诱导的嗜中性粒细胞成熟。
26.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂离体抑制C5a诱导的嗜中性粒细胞成熟，其中
a.在CD11b上调测定法中测定的IC50为低于3.5μg/ml，例如低于2.5μg/ml，例如低于1.5μg/ml或甚至低于1.0μg/m，或
b.在CD62L下调测定法中测定的IC50为低于1.8μg/ml，例如低于1.5μg/ml，例如低于1.2μg/ml或甚至低于1.0μg/ml。
27.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂是小鼠C5aR(mC5aR)或人C5aR(hC5aR)拮抗剂。
28.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂是抗体。
29.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂是结合C5aR的第2个环的抗体。
30.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂是不显著体外诱导嗜中性粒细胞的吞噬作用的抗体。
31.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂是不显著体外诱导ADCC的抗体。
32.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂是不显著体外诱导CDC的抗体。
33.实施方案1-27中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂是肽，例如源自C5a或C5aR的肽。
34.实施方案1-27中任一项的C5aR拮抗剂，其中C5aR拮抗剂是肽分子，例如PMX53或PMX205。
35.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其获得快速反应。
36.前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂，其用于治疗骨损伤或骨质侵蚀，以获得反应。
37.前述实施方案35和36中任一项的C5aR拮抗剂，其用于治疗骨损伤或骨质侵蚀，其中在至多3个剂量后可检出快速反应。
38.前述实施方案35和36中任一项的C5aR拮抗剂，其用于治疗骨损伤或骨质侵蚀，其中在至多3个剂量后在血清样品中可检出快速反应。
39.前述实施方案35和36中任一项的C5aR拮抗剂，其中在至多3个剂量后可检出一个或多个生物标志物的相关变化。
40.前述实施方案35-39中任一项的C5aR拮抗剂，其用于治疗骨损伤或骨质侵蚀，其中在至多3个剂量后可检出一个或多个生物标志物的相关变化。
41.前述实施方案35-40中任一项的C5aR拮抗剂，其用于治疗骨损伤或骨质侵蚀，其中可检出选自组织重塑或化学引诱物标志物的一个或多个生物标志物的相关变化。
42.药物组合物，其包含前述实施方案中任一项的C5aR拮抗剂。
43.实施方案42的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。
44.实施方案42的药物组合物，其中所述制剂是液体制剂。
45.实施方案42的药物组合物，其中所述制剂是干燥制剂。
46.实施方案42-45的药物组合物，其中所述制剂用于静脉内给予。
47.实施方案42-45的药物组合物，其中所述制剂用于皮下给予。
48.实施方案42-45的药物组合物，其中所述制剂用于口服给予。
49.实施方案42-48中任一项的药物组合物，其中所述制剂用于每日给予。
50.实施方案42-48中任一项的药物组合物，其中所述制剂用于每周两次给予。
51.实施方案42-48中任一项的药物组合物，其中所述制剂用于每周一次给予。
52.实施方案42-48中任一项的药物组合物，其中所述制剂用于每隔一周给予。
53.实施方案42-48中任一项的药物组合物，其中所述制剂用于以每第20-25天或例如每月一次的频率给予。
54.用于治疗或预防骨损伤的方法，包括给予有需要的个体治疗有效量的C5aR拮抗剂。
55.用于延缓、停止或抑制骨损伤进展的方法，包括给予有需要的个体治疗有效量的C5aR拮抗剂。
56.用于增加骨密度的方法，包括给予有需要的个体治疗有效量的C5aR拮抗剂。
57.实施方案54、55或56的方法，其中所述C5aR拮抗剂如实施方案16-42中任一项所定义。
58.实施方案57的方法，其中所述C5aR拮抗剂口服给予。
59.实施方案57的方法，其中所述C5aR拮抗剂静脉内给予。
60.实施方案57的方法，其中所述C5aR拮抗剂皮下给予。
61.实施方案57-60中任一项的方法，其中所述C5aR拮抗剂一天一次给予。
62.实施方案57-60中任一项的方法，其中所述C5aR拮抗剂一周两次给予。
63.实施方案57-60中任一项的方法，其中所述C5aR拮抗剂一周一次给予。
64.实施方案57-60中任一项的方法，其中所述C5aR拮抗剂以每第20-25天或例如每月一次的频率给予。
65.实施方案57-60中任一项的方法，其中所述有需要的个体是可受益于骨损伤的治疗的个体，例如患有骨损伤或有发展骨损伤的风险的个体，其中骨损伤包括骨质侵蚀和骨密度损失的一项或多项。
66.实施方案57-65中任一项的方法，其中所述有需要的个体患有关节炎，例如骨关节炎、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎或银屑病性关节炎。
67.实施方案57-66中任一项的方法，其中所述有需要的个体具有关节炎的一个或多个症状，例如类风湿性关节炎的一个或多个症状。
68.实施方案57-67中任一项的方法，其中给予实施方案42-54中任一项的药物组合物。
69.实施方案57-68中任一项的方法，其中所述方法用于获得快速反应。
70.实施方案57-68中任一项的方法，其中所述方法用于治疗骨损伤或骨质侵蚀，以在至多3个剂量后获得反应。
71.实施方案57-68中任一项的方法，其中所述方法用于治疗骨损伤或骨质侵蚀，其中在至多3个剂量后可检出快速反应。
72.实施方案57-68中任一项的方法，其中所述方法用于治疗骨损伤或骨质侵蚀，其中在至多3个剂量后在血清样品中可检出快速反应。
73.实施方案57-68中任一项的方法，其中所述方法用于治疗骨损伤或骨质侵蚀，其中在至多3个剂量后可检出一个或多个生物标志物的相关变化。
74.实施方案57-68中任一项的方法，其中在至多3个剂量后可检出一个或多个生物标志物的相关变化。
75.实施方案57-68中任一项的方法，其中所述方法用于治疗骨损伤或骨质侵蚀，其中可检出选自组织重塑或化学引诱物标志物的一个或多个生物标志物的相关变化。
实施例
实施例1
20/70(小鼠抗-mC5aR)和7F3(小鼠抗-hC5aR)的结合区
测定和描述了7F3和mAb20/70分别与人和小鼠C5aR的结合区(Lee等(2006)NatBiotech24(10)1279-1284)。简言之，嵌合人/小鼠C5a受体使用重叠延伸PCR构建。合成的寡核苷酸引物用于扩增人或小鼠C5aR基因的区。连接需要的人和小鼠基因区段以形成C5aR的完整编码序列加上来自牛视紫质的10个氨基酸的C-端标签。在组成型CMV启动子的下游，将各DNA序列插入至哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中。按照制造商的说明书，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)将表达载体转染至小鼠L1.2细胞中。将大约1.6μg超螺旋质粒DNA加入至8x105个细胞中。经转染的L1.2细胞在补充有10%胎牛血清(Hyclone)的RPMI1640(Gibco)中培养。
转染后1天，将约6x104个细胞以1,500rpm离心5分钟，用PBS洗涤一次和重悬于包含2%(wt/vol)BSA和0.1%(wt/vol)叠氮化钠(染色缓冲液)和纯化的20/70抗体(5ug/ml)的100ulPBS。在4℃30分钟后，用染色缓冲液洗涤细胞两次和重悬于50μl以1:200稀释于染色缓冲液的FITC-缀合的驴抗-大鼠IgG(JacksonLaboratories)。在4℃孵育20分钟后，用染色缓冲液洗涤细胞两次和在FACSCalibur(Becton-Dickinson)上分析以测定表面表达水平。
构建一系列包含小鼠和人C5aR的区段的嵌合受体以鉴定抗体20/70结合的C5a受体的区。各受体构建体包含0、1、2、3或全部4个小鼠C5aR胞外结构域，其中缺失的结构域为人C5aR序列。在各构建体中的4个胞外结构域(N-端，第1、2和3个胞外环)的起点示意性地示于图1中，以及FACS数据的概述中。
图1表明抗-C5aRmAb20/70结合小鼠C5aR的第2个胞外环和7F3结合人C5aR的相应的第2个环。20/70结合构建体4、5、7、9和10，其全部都含有小鼠C5aR第2个胞外环。事实上，构建体#7包含全部人C5aR，除了第2个环为小鼠C5aR。此外，20/70不与人C5aR交叉反应，如通过缺少与构建体#1的结合所证实。在仅FITC-缀合的二次抗体的存在下(即无一次抗体)孵育的转染子显示无染色(数据未显示)。
实施例2
C5aR拮抗剂的体外试验
CD11b受体上调
抗-C5aRmAb(m20/70)抑制响应C5a的CD11b表达上调的能力
测定法设置
设计以下设置，通过测量CD11b表达的变化以测定C5aR拮抗剂中和C5a-诱导的嗜中性粒细胞成熟的能力。
材料和方法：
通过穿刺颌下丛，从首次用于实验的C57BL/6小鼠(Taconic,Denmark)采集血液至EDTA-涂覆的管中。采集后，合并血液，将10μl的不同浓度的抗-C5aRmAb(m20/70,Shushakova等2002,Hycultbiotech)(见表)加入至11个等份的90μl合并血液中，并在室温(RT)下孵育20分钟。孵育后，加入9μl含10μg/ml重组小鼠C5a(HycultBiotech,HC1101)的PBS/0.1%BSA(MiltenyiBiotech,130-091-376)至除了管1的各管，在RT下孵育20分钟。然后使用50μl在包含Cellwash(BDBiosciences,349524)和0.2%BSA(MiltenyiBiotech,130-091-376)的染色缓冲液中的包含饱和浓度的抗-Ly6G-PE(BDBiosciences,55161)和抗-CD11b-AF700(eBiosciences,56-0112-82)的混合母液，将各样品染色用于流式细胞术。对于死细胞的染色，根据制造商的说明书将FixableNearIR死细胞染色试剂盒(Invitrogen,L10119)加入至染色混合物。在4℃孵育20分钟后，通过加入FACS裂解溶液(BDBiosciences,349202)和在暗室中在RT下孵育15分钟，将红细胞裂解。使用染色缓冲液洗涤细胞两次，随后在LSRII流式细胞仪(BDBiosciences)上使用FACSDiva软件分析。
结果：
将在嗜中性粒细胞(定义为活Ly6G+细胞)上C5a-诱导的CD11b表达定量为从来自未加入C5a的血液得到的值中减去给定抗-C5aRmAb浓度的AF700的平均荧光强度(FI)(图2)。在GraphPadPrism软件(v.5.03)中使用非线性曲线拟合，将抗-C5aRmAb的IC50值计算为0.6μg/ml。
接着可修改测定法以测试其他化合物，以评价它们作为C5aR拮抗剂的相关性。
CD62L受体下调
测定法设置
设计以下设置，通过测量CD62L表达的变化，来测定C5aR拮抗剂中和C5a-诱导的嗜中性粒细胞活化的能力。
上述CD11b测定法经修改，通过使用识别CD62L的缀合抗体(BDBiosciences,目录号559772)用于CD62L检测。特别用于CD62L的实验详情见下文。
FACS和数据分析
用对通道FL-4建立的补偿参数设置FACSCalibur流式细胞仪(BDBiosciences)。门控样品以排除死细胞和碎片。嗜中性粒细胞鉴定为具有高FSC和SSC，并门控。计算在FL-4(CD62L-APC)通道中的经门控的嗜中性粒细胞的平均荧光强度(MFI)。
结果表示为减去背景的最大CD62L表达的百分比。最大CD62L表达(MaxCD62L)是没有C5a和没有C5aR拮抗剂下孵育的嗜中性粒细胞的平均MFI。最小(背景)CD62L表达(MinCD62L)是具有C5a但没有C5aR拮抗剂下孵育的嗜中性粒细胞的平均MFI。对各样品，用于计算最大CD62L表达的%的公式是：
%Max样品=(MFI样品-MFIMin)/(MFIMax–MFIMin)x100
可将数据输入GraphPadPrism(v4.0)和拟合至S形剂量-反应曲线(可变斜率)，即使用非线性回归的4-参数对数方程以计算EC50。
置换测定法
可应用闪烁迫近分析法(SPA)以测定C5aR拮抗剂置换与C5aR结合的C5a的效力。SPA的详细描述提供在美国专利4568649和由制造商(AmershamBiosciences)提供的方案中。简言之，自RBL-hC5aR细胞纯化的携带受体的膜片段结合至包被有麦胚凝集素(WGA)的闪烁微粒。在加入放射性标记的hC5a(125I)示踪剂之后，与受体的结合将导致光从颗粒发射。SPA-原理的特别之处在于，仅彼此直接靠近的放射性同位素和颗粒将发射光。即，仅与受体结合的放射性标记的hC5a与WGA-颗粒足够靠近才产生光。因此，发射的光的量表示受体-结合的125I-hC5a的量。测定法是竞争测定法，其中抗-hC5aR/未标记的hC5a与示踪剂竞争与受体的结合。在该测定法中，将固定量的125I-标记的C5a加入至WGA-颗粒和C5aR受体，导致一定量的光的发射，测量为计数/分钟(cpm)。如果加入未标记的C5a或抗-C5aR，则其与受体的结合将引起较低的cpm，这是由于置换125IC5a所致。%置换如下计算：
S：样品
S max ：非特异性结合，通过加入足以代替特异性结合125I-hC5a的量的未标记的hC5a测量
S 0 ：最大结合。未加入未标记的hC5a。
IC50值定义为置换50%的C5a的浓度。在实验之间cpm保持恒定，因此IC50值是相对的，因为示踪剂随时间衰减(decade)。化合物置换125I-hC5a的效力(IC50)可用于鉴定C5aR拮抗剂。
嗜中性粒细胞迁移(趋化性)测定法
C5aR拮抗剂抑制hC5a(或mC5a)依赖性嗜中性粒细胞迁移的效力可在Boyden室中分析。将自人或动物血液分离的嗜中性粒细胞用钙黄绿素染色，加入至Boyden室的上层小室，并与抗体混合。将hC5a或mC5a施加于Boyden室的下层小室，其起嗜中性粒细胞的化学引诱物的作用。嗜中性粒细胞迁移至下室的能力通过计算穿过3或5μmfluoroblok膜的钙黄绿素染色的嗜中性粒细胞的数量来确定。
人PMN(多形核白细胞；粒细胞)获自抽取到含有EDTA的小管中的人血液样品。血细胞通过在室温下通过Ficoll-PaquePLUS(GEHealthCare)梯度(3份)离心血液(4份)30分钟(400xg)分离。将含PMN层悬浮于含葡聚糖-500(Sigma)的PBS(磷酸缓冲盐水)1h，以除去污染的红细胞。将上清液在室温下离心5分钟(250xg)，使用0.2%NaCl渗透溶解剩余的红细胞55s。利用1.2%NaCl+PBS使溶液等渗，以250xg离心5分钟，然后重复渗透溶解。离心后，将PMN重悬于反应混合物(RM):HBSS(目录号14175Gibco)包含NaCl137mM、KCl5.3mM、Na2HPO40.33mM、NaHCO34mM、KH2PO40.44mM、葡萄糖5mM；补充有MgSO4·7H2O0.4mM、MgCl20.5mM、CaCl20.5mM、HEPES20mM。通过NucleoCounter(Chemometec)测定细胞密度。PMN悬液应包含>95%嗜中性粒细胞，如通过吉姆萨染色的样品的显微镜检查所估计。
负载PMN：将钙黄绿素,AM,(Fluka)溶于DMSO(二甲基亚砜)，并在具有细胞(2x106个细胞/ml)的RM中稀释1000X，得到浓度10μM。在孵育器中在37℃将悬浮液孵育30分钟，然后用RM洗涤3次以除去过量的钙黄绿素。最后，将细胞重悬于RM中(4x106个细胞/ml)。
通过Boyden室技术，使用FluoroBlok?3μm孔径96-孔(目录号351161.BDFalcon(VWR))评价迁移。上室，即包含Fluoroblok膜的插入物，用人纤维蛋白原(目录号F3879-1G,Sigma)在1mg/mlPBS中在37℃包被2小时。洗涤后，将膜用包含2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液封闭。在使用RM另一次洗涤后，将具有或没有C5aR拮抗剂的105个钙黄绿素负载的PMN加入至各孔，并置于接收板(下室)中，其包含对照溶液或化学引诱物hC5a(Sigma,C5788)。各组包含至少6个孔。其后在读板器(SpectraMax,Molecular装置或Fluoroscan,ThermoLabsystems.)上，在37℃每5分钟在485/538nm测量板，持续60分钟。在30分钟以相对荧光单位的值用作迁移的度量。
曲线拟合。C5aR拮抗剂抑制迁移的能力可表示为IC50，如使用GraphPadPrism5(GraphPadSoftware,Inc.)所测定。
亲和力的离体测量
在体外设置中，该测定法测量C5aR拮抗剂中和C5a介导的作用的能力。
从新鲜人血液中分离嗜中性粒细胞
将血液以1:1用PBS+2%FBS稀释，在Ficoll-PaquePLUS(GEHealthcare#17-1440-03)上分层，比率为3份Ficoll和4份血液(15mlFicoll和20ml血液在50ml管中)，随后在RT下通过以400xg离心30分钟分层。通过抽吸，轻轻取出中间体PBMC条带。将在压紧的红细胞上分层的粒细胞用塑料Pasteur移液管吸出。将粒细胞和红细胞转移和沉淀在新的50ml管中。沉淀用1xPBS稀释至40ml，加入10ml的4%DEXTRAN500(sigma,31392)的PBS溶液(比率1:5)，并通过倒置轻轻混合。20-30分钟后，将获得的粒细胞富集的上清液转移至新管中，在室温下在250xg回旋5分钟。通过重悬细胞沉淀于7.5ml的0.2%NaCl和轻轻混合55-60秒，用渗透溶解除去污染的红细胞。随后，加入17.5ml的1.2%NaCl，然后用PBS稀释至50ml，并在250xg回旋5分钟。将该步骤重复一次。随后，将细胞沉淀重悬于1ml反应混合物(dPBS/RPMI)中。成活力和细胞计数使用NucleoCounter?监测。
对嗜中性粒细胞的竞争配体结合测定法
将人嗜中性粒细胞纯化、洗涤并以约5x106个细胞/ml重悬于结合缓冲液(50mMHEPES,pH7.5,1mMCaCl2,5mMMgCl2和0.5%牛血清白蛋白(级分V无IgG))。对于各样品，将40μl细胞悬液(1x105个细胞/孔)接种在96-孔V-形板中(Greiner,Cat.#651101)。使用12个浓度的竞争未标记配体以半-log稀释进行竞争研究，自1μM作为最高浓度开始。考虑到最终测定体积为120μl，加入40μl的C5aR拮抗剂。将40μl放射性配体[125I]-hC5a(PerkinElmer,目录号NEX250)添加至所有样品，除了背景对照。测定法中的放射性配体的终浓度为1nM和终体积为120μL。所有样品一式三份运行，和在4℃孵育4h。然后通过以1200rpm在4℃离心2分钟收集细胞，和用100μl的洗涤缓冲液(50mMHEPES,pH7.5,1mMCaCl2,5mMMgCl2,150mMNaCl和0.5%牛血清白蛋白(级分V无IgG))洗涤三次。最后，将细胞重悬于30μl洗涤缓冲液，转移至OptiPlate(PerkinElmer,目录号6005290)，并加入150μl的MicroScint20(PerkinElmer,目录号6013621)至各孔。将板覆盖，充分混合，在校正的TopCounter上以1h延迟计数。加入至测定中的放射性配体的总数在单独板上测定。各样品的计数数量表示为以百分比计的标准化值，其中100%是当加入1nM[125I]-hC5a和无冷的C5aR拮抗剂时的最大计数水平，和0%是在1μM冷的C5a存在时测定的非特异性结合。通过非线性回归，使用PRISM(GraphPad)分析数据。
钙流测定法
用Fluo-4AM细胞染料对人嗜中性粒细胞染色
将嗜中性粒细胞离心和用PBS洗涤，然后以1x107个细胞/ml重悬于细胞染料和在室温下在暗室中孵育40分钟。将细胞离心和洗涤(以除去过量染料)，再次离心和以2x106个细胞/ml重悬于细胞缓冲液。将细胞(0.5ml)等分至非无菌的玻璃FACS管中，各样品一管，在室温下储存并在2小时内使用。各样品使用1x106个嗜中性粒细胞。
测定法
钙流测定法如下进行。简言之，在FACSCalibur流式细胞仪(BDBiosciences)上，利用用x-轴FSCvs.y-轴SSC门控的嗜中性粒细胞分析在0.5ml细胞缓冲液中负载有Fluo-4AM的1x106个嗜中性粒细胞。向管中加入各种试剂后(例如C5aR拮抗剂、C5a、伊屋诺霉素–以10x终浓度溶于细胞缓冲液而不是I-MGB或C-MGB)，FL-1(FITC)通道用于测量嗜中性粒细胞荧光。用每1秒获得的平均荧光强度(MFI)值连续测量样品荧光。该数据保存在CellQuest(BDBiosciences)文件中，并转移至Excel(Microsoft)和Prism(v4.0c,GraphPadSoftwareInc.)用于进一步处理和分析。加入试剂至嗜中性粒细胞的顺序和孵育时间可根据进行的测定法的类型改变。
C5a中和测定法
制备10x3倍连续稀释的C5aR拮抗剂，浓度范围为1000μg/ml至1.37μg/ml。在室温下将Fluo-4AM负载的嗜中性粒细胞(1x106个，在0.5ml细胞缓冲液中)与50μl10xC5aR拮抗剂溶液(在管中的最终C5aR拮抗剂浓度：100–0.137μg/ml)一起孵育10分钟。细胞加上C5aR拮抗剂通过FACS分析约60秒，以建立基线荧光。然后加入50μl10nMC5a以得到终浓度约1nM，并继续测量荧光另外的约60秒。如果C5aR拮抗剂阻断C5a-诱导的Ca2+-释放，那么不存在荧光峰。如果C5aR拮抗剂不中和C5a，那么存在荧光峰。最后，加入50μl1μg/ml伊屋诺霉素至终浓度为0.1μg/ml，并继续测量荧光另外的约60秒，以确保细胞仍有反应。
实施例3
抗-C5aR在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中的作用
小鼠
雄性DBA/1小鼠(10-11周龄)获自Taconic(Denmark)，使其休息一周，然后开始实验。在标准条件下饲养小鼠(10只小鼠/笼)，并使其接受标准饲料和水。
用于诱导CIA的免疫
在第0天，用在完全弗氏佐剂(2mg/ml,Arthrogen-CIA?Adjuvant,Chondrex,USA)中1:1乳化的100μl牛II型胶原(bCII,2mg/ml,Chondrex,USA)，在尾基部皮内(i.d.)免疫小鼠。在第21天，用与不完全弗氏佐剂(Chondrex,USA)1:1乳化的100μlbCII(1mg/ml,Chondrex,USA)，在尾基部给予(i.d.)小鼠加强免疫。在使用异氟烷/O2/N2O麻醉下免疫小鼠。
关节炎的临床评分
从第21天至实验结束，每周5次对小鼠评分(除了周末的所有天数)，根据以下评分要点：0点，如果无可见临床症状
1点/肿胀足趾(无论这是否包括一个或两个关节(-前爪的趾I)，对于包括肘节、跖骨/掌骨为1点，对于包括腕关节、跗骨/腕骨为1点。在前爪可获得6的最大评分，和在后爪可获得7的最大评分。根据Danish地区当局的人类终点的定义，在实验终止前处死获得临床评分超过10的小鼠。
抗-小鼠C5aRmAb(m20/70)
HC和LC的可变区源自大鼠抗-小鼠抗-C5aRmAb20/70(Shushakova等2002,Hycultbiotech)。LC的恒定区是小鼠kappa和HC的恒定区是设计在FC区中具有6个突变的小鼠IgG2a，产生mIgG2a.1。进行工程改造的突变L234A、L235E、G237A(ADCC失活)、D327Q、A330S和P331S(CDC失活)以减少ADCC或CDC效应器机制。缺少与小鼠Fc-γ受体I-IV的结合通过表面等离子体共振分析来测定(数据未显示)。
试验化合物和小鼠的治疗
当小鼠获得2-7的评分(在治疗开始时大多数小鼠具有2-4的评分)时，开始小鼠的个体治疗性治疗。根据治疗，将小鼠随机化，使得对有资格开始治疗的第一小鼠给予化合物1和对有资格开始治疗的第二小鼠给予化合物2，等等。使用该程序，在所有笼中提供所有化合物，和在所有给药组中都提供早期和晚期关节炎发作小鼠。所有小鼠接受6个剂量，共2周(治疗间隔为1-2天，因为在周末期间未给予治疗)。用以下化合物之一腹膜内(i.p.)治疗小鼠：
20/70抗-C5aR(小鼠IgG2a.1)，内毒素水平<0.10EU/mg，0.5mg/小鼠
抗-TNP(小鼠IgG2a.1)抗体，内毒素水平0.001EU/mg，0.5mg/小鼠
Etanercept?10mg/kg
抗-TNP(hzIgG1)抗体，内毒素水平<0.10EU/mg，10mg/kg
血清样品
当治疗开始和结束时，通过异氟烷/O2/N2O麻醉小鼠和眼睛放血(约150μl，最大为估计总血体积的7.5%)。采集血液至0.5ml具有血块活化剂(BDMicrotainer)的血清管中，在室温下保持直至在4℃以15000G离心2分钟(在20分钟内)。将血清转移至1.4ml微管中和在-80℃下储存直至使用标准ELISA测定法(R&DSystems)进一步分析基质金属蛋白酶-3(MMP3)水平。使用基质金属蛋白酶-3(MMP-3)ELISA制造R&D系统描述的测定程序分析血清样品。血清样品需要用校准器稀释液以1:20稀释。其它炎症标志物使用58-生物标志物多分析物概况(RodentMAP?,Myriad,RBM,Austin,USA)评价。
用于组织学的爪制备物
在处死时，切下爪，在第三和第四趾之间至跟骨矢状分开以使固定和脱钙作用最优化。在室温下将爪在4%多聚甲醛中固定48小时，并置于70%乙醇中。将爪在Immunocal中脱钙7天，处理用于在ASP300组织处理器上石蜡包埋，并以切口表面向下包埋。将石蜡切片以3μm切下并用标准HE染色进行染色，用于组织病理学评价。
组织病理学评分系统
在后爪的远端指节间(DIP)、近端指节间(PIP)、跖骨和跗骨关节中的关节炎变化使用评分系统评价(Sumariwalla等2004的改进)，其中0=正常关节结构；1=轻度变化、滑膜炎和血管翳前端几乎没有分离的软骨病灶侵蚀；2=中等变化，伴有软骨细胞失核，丢失大面积的软骨，侵蚀血管翳前端具有一定的骨质侵蚀，和滑膜增生，具有侵润单核细胞和多形核细胞；和3=重度骨质侵蚀和关节结构破坏。组织学评分指数计算为总累加评分/小鼠除以评分的关节区域总数/小鼠(范围为6-8个关节区域/小鼠)。
对于爪中更具体的破坏变化评分，在最坏影响的后爪的HE染色切片上对骨质侵蚀和软骨降解分开评分。最坏影响的定义为具有最高组织学评分指数的爪(总累加评分/爪除以评分的关节区域总数)。如果两个爪具有相同的组织学评分，则选择右爪。骨质侵蚀和软骨降解的严重性评分为0-3，和取平均值(累加评分除以评分的关节区域数)。
统计学
试验化合物对临床评分的统计学显著影响通过使用双尾Mann-Whitney检验比较试验化合物组与对照组来计算。对单个小鼠进行计算，在对临床评分的总实验时间期间使用GraphPadPrism软件评价曲线下面积(AUC)。在实验结束前(6个治疗剂量后)处死的小鼠以最后观察的评分包括在计算中。
使用GraphPadPrism5分析组织学数据，并使用不配对的带Welch校正的Studentt检验，评价治疗组的组织学评分指数的差异的统计学显著性。
结果
在CIA模型中治疗性抗-C5aR治疗能够停止疾病发展。当比较抗-C5aR治疗与同种型对照治疗时，观察到临床评分中的显著(p<0.0001)差异。此外，系统骨破坏标志物MMP-3水平的显著(p=0.0002)减少证实临床治疗效果。在依那西普治疗后存在可比较的临床抑制评分和MMP3水平。
对各小鼠的两个后爪进行关节炎变化的组织病理学终点评价。对各小鼠计算组织学评分指数。与同种型对照治疗相比(n=15)，用抗-C5aR治疗(n=18)显著减少组织学评分指数(图3)。在处死时，在组织学评分指数(合并治疗组)和临床评分之间存在显著的相关性(p<0.0001)。
骨质侵蚀和软骨降解在各小鼠的最坏影响的后爪的HE染色切片上进行评价(抗-C5aRn=18，抗-TNPn=15)。如图4所示，与用抗-TNP对照抗体(IgG2a.1)治疗的小鼠相比，用抗-C5aR治疗显著减少骨质侵蚀和软骨降解两者。
实施例4
抗-C5aR治疗在小鼠单爪关节炎模型中的作用
在C57BL/6小鼠中诱导DTH-关节炎
DTH-关节炎通过在一个爪中用甲基化牛血清白蛋白(mBSA)引发经典DTH反应来诱导，改变之处在于在免疫和攻击步骤之间给予II型胶原单克隆抗体混合物(AtkinsonSA等(2012)ArthritisResTher14(3):R134)。简言之，雌性C57BL/6小鼠(8-10周龄)在第-7天用在完全弗氏佐剂(CFA)(Difco,Detroit,MI)中乳化的mBSA(Sigma,St.Louis,MO)在尾基部皮内免疫。四天后，它们静脉内接受在200μl磷酸缓冲盐水(PBS)中的1000μg(约50mg/kg)包含克隆A2-10(IgG2a)、F10-21(IgG2a)、D8-6(IgG2a)、D1-2G(IgG2b)和D2-112(IgG2b)的II型胶原(CII)小鼠抗体5-克隆混合物(Chondrex,Redmond,WA)。在第0天，用在20μlPBS中的200μgmBSA在右足垫中皮下攻击小鼠。左足垫仅给予20μlPBS和作为对照。在足垫攻击后，小鼠在mBSA攻击的右足垫中发展单爪关节炎。
用抗-C5aR抗体治疗
为研究抗-C5aR治疗对关节炎评分的影响，对小鼠(n=10/组)用阻断抗-C5aR抗体(m20/70mIgG2a.1，包括如上所述的6Fc突变)或同种型对照抗体(抗-TNP-IgG2a.1)500μgi.p.治疗，每周两次，从关节炎诱导日(即第0天)起总共4个剂量。
定量测量关节炎
作为主要功效读出，Δ爪肿胀的曲线下面积(AUC)从关节炎诱导后第0-11天计算，其中爪肿胀的变化(Δ)计算为：关节炎诱导后的右爪厚度减去关节炎诱导前的右爪厚度。
用于组织学的爪制备物
在关节炎诱导后第11天处死时，切下后爪，在第三和第四趾之间至跟骨矢状分开以使固定和脱钙作用最优化。在室温下将爪在4%多聚甲醛中固定48小时和置于70%乙醇中。将爪在Immunocal中脱钙7天，处理用于在ASP300组织处理器上石蜡包埋，并以切口表面向下包埋。石蜡切片以3μm切下。
组织病理学变化评价
爪中的组织病理学变化在用常规苏木精和伊红(HE)概观染色进行染色的来自各爪的三个切片上进行评价，分别地，破骨细胞酶酒石酸盐-抗性酸性磷酸酶(TRAP)染色用于骨质侵蚀评价和SafraninO用于证实软骨蛋白多糖损失。单独评价炎性细胞的关节外浸润(以0-3刻度评价)和关节炎变化。关节炎变化在跖骨和跗骨关节上评价，其中滑膜炎(炎性细胞的浸润和滑膜增生)、软骨降解和骨质侵蚀分别以0-3刻度评分。对于关节炎变化的三个参数的每个，计算两个关节区域之间的平均值。在n=10抗-C5aR治疗小鼠和n=10对照抗体治疗小鼠中进行组织学评价。
统计学
对于组织学评分的统计学分析，使用非配对的带Welch校正的Studentt检验。当p≤0.05时，组间差异认为是显著的，和显著性水平指定为*:p≤0.05，**:p≤0.01和***:p≤0.001。
结果
与同种型对照抗体相比，自关节炎诱导日开始的抗-C5aR抗体治疗显示显著减少爪肿胀(P<0.01，非配对的双侧studentt-检验，数据未显示)。组织病理学评价显示抗-C5aR治疗对关节炎变化(滑膜炎、软骨降解和骨质侵蚀)和对关节外浸润的高度显著影响(图5)。这些发现一起显示，抗-C5aR治疗可预防关节中的关节炎变化，这证实抗-C5aR作为用于治疗类风湿性关节炎(RA)和此外用于治疗骨损伤(包括骨质侵蚀和骨密度损失)的疗法的合适性。
尽管本发明的某些特征已在本文进行了说明和描述，但现在本领域普通技术人员可想到许多改变、替换、变化和等同物。因此，应理解，随附权利要求意图涵盖所有这样的改变和变化，其落入本发明的真实精神之内。
实施例5
在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中抗-C5aR的单剂量治疗
为研究抗-C5aR治疗的可能的快速起效影响，评价了单剂量治疗性治疗。如上进行处理和分析小鼠(实施例3)。简言之，小鼠(n=22-26/组A-C)或(n=15-16/组D)在第0天经免疫以诱导关节炎和在第21天加强免疫。当小鼠达到2-7的临床评分(对应于第1天的评分)，分别开始用抗-C5aR或抗-TNP(IgG2a.1)的单剂量治疗(0.5mg/小鼠)。治疗后48小时处死小鼠。使用58-生物标志物多分析物概况(RodentMAP?,Myriad,RBM,Austin,USA)在爪匀浆物中评价炎症标志物。通过在腿的毛皮线的右下方切下所有小鼠的后爪，制备爪匀浆物。然后将爪在所有时间保持冷和在缓冲液中匀浆，缓冲液包含：1片Complete(Roche)、5μlTritonX-100(Sigma)和500μlFUT-175(Calbiochem)，在0.9%盐水中(直至50ml)。以10,000G在4℃将匀浆物离心两次15分钟，并将上清液在-80℃储存直至分析。
结果
用抗-C5aR的单剂量治疗证实在24小时后疾病发展已经停止，这甚至在48小时后更显著(图6A)。临床评分的AUC在给予单剂量抗-C5aR治疗的小鼠中显著更低(p=0.0003)(图6B)。
在进一步的研究中，还在单剂量治疗后48小时评价组织病理学和嗜中性粒细胞和巨噬细胞的浸润。如上述，观察到组织学评分指数的显著降低(p=0.0006)(图6C)。此外，发现嗜中性粒细胞和巨噬细胞的浸润在48小时显著减少(未显示)。这些数据一起证实，单剂量治疗的显著影响，以及对组织病理学评分的快速起效影响。
用抗-C5aR的单剂量治疗产生炎性生物标志物的快速变化
在给予抗-C5aR后48小时，获自单剂量处理小鼠的爪匀浆物和血清样品中，研究一组关于炎症的可溶分析物。发现与同种型(抗-TNP-IgG2a.1)治疗的小鼠相比，在接受抗-C5aR治疗的小鼠中许多炎症标志物显著减少(表1)。
除了爪中的局部反应之外，数个炎性分析物显示抗-C5aR治疗后在外周中显著减少(表1)。
基质金属蛋白酶MMP-3和MMP-9都在外周中显著(分别为p=0.0028和p=0.0006)减少，对应于35-45%降低。此外，发现TIMP-1的显著(p=0.0015)减少，对应于47%降低(表1)。这表明，单剂量抗-C5aR治疗对组织重塑和骨破坏的快速起效作用可在外周中检出。如在爪匀浆物中所发现，在单剂量抗-C5aR治疗后，化学引诱物KC(CXCL1)、MCP-1(CCL2)和MCP-5(CCL12)也显著(分别为p=0.0078，p=0.0028，p=0.021)减少(20-50%抑制)(表1)。
表1
实施例6
在延迟型超敏性关节炎(DTHA)模型中抗-C5aR的单剂量治疗
为进一步研究C5aR拮抗剂的可能快速起效，在上述(实施例4)DTHA模型中在单剂量研究中进一步评价了作用。
i.p给予用抗-mC5aR或抗-TNP(mIgG2a.1)的单剂量治疗(0.5mg/小鼠)。治疗开始后60小时终止实验。
结果
在关节炎诱导时，单剂量的抗-C5aR当60小时后测量时导致爪和踝肿胀减少(图7A)。组织病理学评价揭示，滑膜炎、软骨破坏和骨质侵蚀减弱，但炎性细胞的关节外浸润不受影响(图7B)。总体的组织病理学评分也减少，如关节炎评分，其定义为属于关节炎表型的所有个体评价参数的总和(图7C)。
这些数据一起证实，单剂量的抗-C5aR具有显著减少DTHA中疾病发展和关节炎变化的能力。
为进一步研究受C5aR的阻断影响的途径和研究抗-C5aR是否导致炎性细胞活化的减少，分析关节炎诱导后60小时获得的整爪匀浆物的大量细胞因子和趋化因子的蛋白水平。
简言之，爪匀浆物通过将爪在1.25ml的包含49.995ml0.9%盐水、1片完全无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(Roche,Switzerland)和5μlTritonX-100(Sigma,St.Louis,MO)的冰冷匀浆缓冲液中匀浆产生。将爪使用T25Ultraturrax?匀浆器(IKA,Staufen,Germany)匀浆，接着以10,000g离心15分钟。倾出上清液，再次以10,000g离心15分钟。分析得到的上清液。使用基于珠的Luminex?xMAP?技术与来自Millipore(Billerica,MA,USA)的Milliplex试剂盒，按照制造商的说明书，不经稀释地分析匀浆上清液的炎性标志物水平。对于统计学分析，对于目标分析物，低于检测限的任何值设定为检测限，和对于目标分析物，高于检测限的任何值设定为检测上限。在VCAM-1、FGF(碱性)和淋巴细胞趋化因子的情况下，使用58-生物标志物多分析物概况(RodentMAP?,MyriadRBM,Austin,USA)进行分析。
在抗-C5aR-治疗的小鼠的爪中，炎性细胞因子IL-6显著降低，而未观察到IL-1β或IL-10变化。此外，在抗-C5aR-治疗动物的爪中，化学引诱物CXCL1/KC、CXCL2/MIP-2、CXCL5/LIX和淋巴细胞趋化因子显著减少，与G-CSF一样。最后，在抗-C5aR-治疗小鼠的爪中，血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管细胞粘附分子1(VCAM-1)也显著减少(表2)。结论是，单剂量的抗-C5aR能够介导局部炎性介导物的快速变化，所述介导物为活化和浸润各种炎性细胞子集和内皮活化的标志物，并且是重要的。
表2
分析物 抗-C5aR-治疗的, pg/g组织(95% CI) IgG2a.1-治疗的, pg/g组织(95% CI) p-值 概述
IL-1β 950.2 (765.6-1135) 935 (774.6-1035) 0.89 ns
IL-6 1097 (582.3-1612) 3873 (2235-5511) 0.0028 **
IL-10 4403 (3418-5388) 4280 (3320-5239) 0.84 ns
IL-17 47.98 (30.28-65.67) 86.12 (43.34-128.9) 0.066 ns
CXCL1/KC 6854 (3919-9788) 11630 (9374-13886) 0.0092 **
CXCL2/MIP-2 7430 (4118-10742) 20677 (13320-28035) 0.0016 **
CXCL5/LIX 1134 (448.5-1819) 3301 (2227-4376) 0.0012 **
CXCL10/IP-10 4403 (3418-5388) 4280 (3320-5239) 0.84 ns
CCL3/MIP-1α 3312 (2560-4065) 3361 (2522-4200) 0.92 ns
CCL5/RANTES 1015 (863.1-1167) 1026 (835.1-1218) 0.91 ns
G-CSF 1681 (808.7-2562) 6129 (2584-9675) 0.013 *
GM-CSF 149.3 (57.3-241.4) 260 (174.5-345.5) 0.062 ns
M-CSF 1258 (957.7-1558) 1040 (474.8-1604) 0.45 ns
VCAM-1 439 (371-506.9) 503.4 (484-522) 0.027 *
VEGF 74.49 (55.89-93.09) 115.6 (89.77-141.5) 0.0091 **
bFGF 1567 (1048-2086) 2349 (1705-2993) 0.047 *
淋巴细胞趋化因子 2351 (2003-2699) 2836 (2416-3257) 0.030 *
表2.单剂量的抗-C5aR或IgG2a.1后在爪组织中的炎症的蛋白生物标志物
使用多路分析，分析完整爪匀浆物上清液的众多炎性标志物的蛋白水平。对于详情，参见材料和方法。结果表示为平均值±SEM，和n=10/组。当p≤0.05时，各组间的差异认为是显著的，和显著水平指定为*:p≤0.05，**:p≤0.01和***:p≤0.001，使用Studentt检验。

Claims (15)

1.C5aR拮抗剂，其用于治疗或预防具有关节炎的一个或多个症状的受试者的骨损伤，其中所述C5aR拮抗剂是抗体。
2.权利要求1的C5aR拮抗剂，其中骨损伤包括骨质侵蚀和骨密度损失的一项或多项。
3.权利要求1或2的C5aR拮抗剂，其用于治疗或预防骨损伤和软骨降解。
4.权利要求2或3的C5aR拮抗剂，其中所述治疗用于减少骨损伤速度和/或软骨降解速度。
5.权利要求2-4中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述治疗用于抑制或停止骨质侵蚀的进展或用于增加骨密度。
6.前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述受试者患有骨质侵蚀或骨密度降低。
7.前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述受试者患有关节炎，例如骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎或脓毒性关节炎。
8.前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述受试者是哺乳动物，例如人。
9.前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述治疗用于获得快速反应。
10.前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述C5aR拮抗剂抑制或减少C5a与C5aR的结合。
11.前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述C5aR拮抗剂抑制或减少C5aR介导的C5a的生物学作用，例如
a.C5a诱导的嗜中性粒细胞活化，
b.C5a诱导的细胞迁移，和/或
c.C5a诱导的嗜中性粒细胞成熟。
12.前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述C5aR拮抗剂是结合C5aR的第2个环的抗体。
13.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂。
14.用于治疗或预防骨损伤的方法，包括给予有需要的个体治疗有效量的C5aR拮抗剂。
15.权利要求14的方法，其中所述方法如权利要求1-11中任一项所述。
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