CN105385695A - 丹参酮生物合成抑制因子基因SmJAZ3及其编码蛋白与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一条丹参茉莉酸信号途径中的抑制因子JAZ(Jasmonate？ZIM？domain)基因—SmJAZ3及其相应的蛋白序列；本发明所提供的SmJAZ3基因具有SEQ？ID？No.1所示的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ？ID？No.2所示的氨基酸序列。本发明通过构建过表达与反义抑制载体，遗传转化丹参毛状根，对丹参中丹参酮含量产生显著影响。本发明提供的SmJAZ3与丹参酮合成密切相关，有助于丹参药材的品质改良，为解决丹参酮药源紧缺问题提供了一个新的作用靶点与研究思路。

Description

丹参酮生物合成抑制因子基因SmJAZ3及其编码蛋白与用途

技术领域

本发明涉及基因工程技术，特别涉及一种丹参酮生物合成抑制因子基因SmJAZ3及其编码蛋白与用途。

背景技术

丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)又名赤参、紫丹参、红根等，其为唇形科(Labiatae)鼠尾草属常用中药，以根和根茎入药，在活血化瘀，通心包络，治疝气痛的功效。丹参酮的药理成分主要有两类，一类是脂溶性的二萜类化合物，一类是水溶性的酚酸类化合物。丹参酮类化合物含量较高的有丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮，具有抗肿瘤，抗菌消炎，抗氧化，抗动脉粥样硬化等多种药理活性，因此具有巨大的市场需求。酚酸类主要成分包括原儿茶醛、迷迭香酸、丹参素、咖啡酸、丹酚酸等，均具有抗心肌缺血缺氧作用。

发根，也称为毛状根，其具有多种优点：单细胞起源、稳定遗传、生长快速，无需添加外源激素等而被广泛应用。茉莉酸是茉莉花中的一种芳香物质，是香料中的常见成分。具有共同的环戊烷酮结构的新型天然植物激素，由十八烷途径合成，在植物体内具有广泛的生理功能，是一种重要的植物信号分子。茉莉酸及其生物活性衍生物被称为茉莉酸类物质(Jas)。目前研究已证明，JA在植物体内发挥作用的方式是JA-Ile。可调控植物发育的多个过程，在没有外界压力存在时，植物体内没有足够JA存在，JAZ蛋白募集下游的抑制因子NINJA或者TPL，组蛋白去乙酰化酶HDAC，与MYC2结合，使MYC2处于失活状态，下游功能基因的表达受到抑制；当受到环境胁迫时，植物体内合成足够的JA，在JAR1的作用下可形成JA-Ile。JA-Ile促进了SCFCOI1与JAZ的结合，导致了26S蛋白水解酶对JAZ的降解，使得有活性的MYC2被释放出来，从而启动了茉莉酸响应基因的转录。

作为一种传统的并且具有广泛药用价值的中药，丹参已经成为了国内外学者的研究热点，但是目前对丹参的研究主要基于对其丹参酮(MEP或MVA途径)或丹酚酸关键酶基因的研究，对丹参信号传导的研究较少。本发明主要通过克隆得到丹参JA信号途径的一个JAZ3蛋白，通过基因工程手段，构建过表达及反义抑制载体，遗传转化丹参获得毛状根，发现丹参JAZ3基因的表达明显影响丹参酮的代谢合成，特别是通过抑制丹参JAZ3基因的表达可显著促进丹参酮的积累合成，获得丹参酮高产的丹参毛状根，可为商业化获取丹参酮提供新型药源原料，目前尚未发现与本主题所提及的抑制JAZ3基因表达策略来提高丹参酮含量的相关报道。因此，本发明在解决丹参酮药源不足问题上具有积极意义。

发明内容

本发明的目的，就是为了克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种丹参酮生物合成抑制因子基因SmJAZ3及其编码蛋白与用途。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种丹参酮生物合成抑制因子基因SmJAZ3，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

所述基因SmJAZ3编码的蛋白质的氨基酸残基序列如SEQIDNo.2所示。

一种质粒，含有基因SmJAZ3的全序列。

一种植物过表达载体，含有基因SmJAZ3的正向全序列。

一种植物反义抑制载体，所述植物反义抑制载体含有基因SmJAZ3的反向全序列。

一种宿主细胞，含有基因SmJAZ3的核苷酸序列，或含有基因SmJAZ3的全序列，或含有基因SmJAZ3的正向全序列，或含有基因SmJAZ3的反向全序列。

本发明通过构建过表达与反义抑制载体，遗传转化丹参毛状根，对丹参中丹参酮含量产生显著影响。本发明提供的SmJAZ3与丹参酮合成密切相关，有助于丹参药材的品质改良，为解决丹参酮药源紧缺问题提供了一个新的作用靶点与研究思路。

附图说明

图1为通过Mega6.0建立的系统发育进化树；

图2为发根农杆菌C58C1介导遗传转化获得的丹参毛状根；

图3为pCAMBIA2300⁺-SmJAZ3转基因发根阳性克隆鉴定结果；

图4为pCAMBIA2300⁺-Anti-SmJAZ3转基因发根阳性克隆鉴定结果；

图5、图6、图7、图8为毛状根RNA的qRT-PCR分析结果；

图9为各个样品的丹参酮含量；

图10为丹参SmJAZ3的ZIM结构域；

图11为丹参SmJAZ3的Jas结构域。

具体实施方式

实施例1丹参SmJAZ3基因的克隆

1、组织分离(isolation)

取丹参植株幼嫩组织保存于-80℃冰箱

2、RNA的分离(RNAisolation)

取部分组织用研钵研碎，加入裂解液匀浆后移至1.5mLEP管中，抽提总RNA。普通琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量，然后在NanoDrop上测定RNA含量。

3、克隆基因全长(CloningofFull-lengthcDNA)

利用甲基茉莉酸(methyljasmonicacid)诱导摇瓶中培养两个月的丹参毛状根，抽提RNA，将其反转录成cDNA，利用高通量测序进行转录组分析。

3.1、转录组测序

通过对丹参发根材料进行通过转录组测序，采用本地Blast策略筛选得到一条与拟南芥JAZ3高度同源的序列，该条序列5'端完整，但3'端不完整。

3.2、5'端序列克隆

根据测序的序列设计上下游引物F1、R1，通过PCR得到5'端完整序列，胶回收，回收产物连接到18T载体，利用通用引物M13进行测序，得到SmJAZ3基因5'端的物理序列。

3.3、3'端序列克隆

根据5'端完整的基因序列，设计正向特异引物F2，经过PCR(F1+AUAP),扩增得到3'端序列。回收，将其连接18T载体，利用通用引物M13进行测序，得到SmJAZ3基因3'端的物理序列。

3.4、将测序结果比对并进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增(SmJAZ3KF1+SmJAZ3KR1)得到SmJAZ3编码区。BLAST的结果证明从丹参中新得到的基因确为一个SmJAZ3。

实施例2(丹参SmJAZ3基因的序列信息与同源性分析)

本发明的SmJAZ3基因全长cDNA的长度为1011bp，详细序列见SEQIDNO.1。根据全长cDNA推导出丹参SmJAZ3基因的氨基酸序列，共336个氨基酸残基，详细序列见SEQIDNO.2。

丹参SmJAZ3与烟草(Nicotianatabacum)jasmonateZIM-domainprotein7b的氨基酸序列的同源比较如表1所示。将该基因通过ClustalW、Boxshade等软件与拟南芥JAZ基因进行多重序列比对，这条基因具有AtJAZs保守的ZIM结构，Jas结构域(SLX2FX2KRX2RX5PY)。结果如图10、图11所示。通过Mega6.0建立系统发育进化树，本地Blast，发现所获得的JAZ基因与拟南芥的JAZ3同源性最高，将其命名为SmJAZ3。结果如图1所示。

表1

Query1MERDFMGLS--VKQEVPDEIIDAASVRSLPMQWSFSNKGSALPQLLSFQGAQEDKQPKTG174

MERDFMGL+VKQEV+EIDA+RSMQWSFSNSPQLSF+GAQED+PKTGSbjct1

MERDFMGLTHHVKQEVTEEPIDPAPLRSSAMQWSFSNNISTHPQYLSFKGAQEDR-PKTG59Query175

FNSLASSGLVTLTT-DVFDSDHSQFPA-SQKSHVPEKQGGVRYTVTTYG----------D318

F+SLAS+GLVT+TT+DSH+QK++EKQGGYTT+Sbjct60

FDSLASTGLVTITTTEAVDSSHRSYSGVGQKNMMLEKQGGTHYMSTTFSPHHYDAHAMHR119Query319

THNIRRAITTSPA-------------SYAAPVAGFPVANPLQAKPSNSAAVGTTDFRNSC459+H+R

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SHGVRVLPVSNPANQISVSMTMPGHKSFVSPLGQNPVASPISAVPTNSAVVGTTDLRGAP179Query460

KISNTPAQLTIFYNGSVCVYDDISPEKAQAIMLLAGNAHSvapkatppavpvqaampRCS639K

PAQLTIFYGSVCVYD++SPEKAQAIMLLAGNAVPATPVQA+P+SSbjct180

KTPPGPAQLTIFYAGSVCVYDNVSPEKAQAIMLLAGNAPPVTPSATSALSPVQAPIPKSS239Query640

VPDRLTINQSYATTPRRSSPVPMTPISVSQSAN-----------KPSGARMSPPINAEPL786D+NQS+

TTPSP++TSQSAKGSPAESbjct240

SVDSFVVNQSHNTTPTLPSPISITSHCGSQSAGVSSNTNGVTIIKSIGVLPSPSNKAELS299Query787

KTVIPLGS--ASFLSSDTVPQFRKKSLARFLEKRKERVISASPYGECQ924K+GSA+F+SVPQRK

SLARFLEKRKERVISASPYC+Sbjct300KFSSSIGSVPATFVQS-AVPQARKASLARFLEKRKERVISASPYDSCK346

实施例3构建过表达与反义抑制载体，遗传转化丹参毛状根

1、构建SmJAZ3过表达及反义抑制载体

将SmJAZ3正向及反向全长克隆到pCAMBIA2300⁺上，得到过表达载体pCAMBIA2300⁺-SmJAZ3及反义抑制载体pCAMBIA2300⁺-Anti-SmJAZ3。

2、发根农杆菌C58C1介导pCAMBIA2300⁺,pCAMBIA2300⁺-SmJAZ3及pCAMBIA2300⁺-Anti-SmJAZ3质粒遗传转化丹参获得丹参毛状根。

(1)外植体的预培养

剪取无菌丹参苗叶片及叶柄，接种到预培养培养基(1/2MS)上，25℃暗培养2d。

(2)农杆菌与外植体的共培养

将上述经预培养的丹参叶片外植体，放入含活化好的上述发根农杆菌工程菌的1/2MS悬液中浸泡10分钟(轻轻摇晃使外植体与菌液充分接触)后，取出浸染后的丹参外植体用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基1/2MS中，暗培养2d。

(3)毛状根的继代培养

将上述的共培养2d的丹参外植体转接到除菌固体培养基(1/2MS+Ceb300mg/L)中，25℃16h/8h光照培养2周左右，可从外植体伤口处长出毛状根。剪下(大约1-3cm)的毛状根，每隔2周将毛状根转移到含有不同梯度的(Cef500mg/L,Cef300mg/L,Cef100mg/L)的1/2MS培养基中继代筛选，每2周继代培养一次。经过数次继代后即可完全脱菌。再将良好的丹参毛状根转入无抗生素的1/2MS培养基上继续暗培养。发根农杆菌C58C1介导遗传转化获得丹参毛状根如图2所示。图中：A、无菌苗；B、无菌叶片预培养与共培养；C、初步获得毛状根；D、得到毛状根单克隆；E、液体扩大培养。

实施例4丹参毛状根阳性克隆鉴定

CTAB法提取pCAMBIA2300⁺、pCAMBIA2300⁺-SmJAZ3及pCAMBIA2300⁺-Anti-SmJAZ3在体转化的每个克隆的基因组DNA，PCR鉴定获得毛状根阳性克隆。

1、PCR鉴定pCAMBIA2300+-SmJAZ3转基因发根

pCAMBIA2300⁺-SmJAZ3转基因发根阳性克隆鉴定(35SF23、JAZ3R590)阳性率55.3％(21/38)，结果如图3所示。

2、PCR鉴定pCAMBIA2300+-Anti-SmJAZ3转基因发根

pCAMBIA2300⁺-Anti-SmJAZ3转基因发根阳性克隆鉴定(JAZ3R590、NOSR)阳性率44.4％(16/36)，结果如图4所示。

实施例5下游基因表达分析

提取毛状根RNA，反转录后进行定量PCR。选择丹参酮合成途径的关键酶基因DXS2,GGPPS,CPS,KSL,CYP76AH1进行qRT-PCR分析。结果如图5、图6、图7、图8所示。

qRT-PCR的结果表明，转基因阳性克隆中SmJAZ3基因的表达量各有差异，说明SmJAZ3基因整合到丹参基因组内的水平各不相同。通过检测丹参酮合成关键酶基因发现，SmDXS2,SmGGPPS,SmKSL与对照相比，基因表达量有不同程度的下降。SmDXS2作为MEP途径的第一个限速酶，其在丹参酮合成中起到关键作用。SmGGPPS,SmKSL作为下游代谢途径的关键靶点，他们对丹参酮合成也有至关重要的影响。结果表明，可能由于SmJAZ3基因的过表达，导致SmJAZ3下游转录因子表达量下降，而这个转录因子的直接作用基因可能是SmDXS2,SmGGPPS,SmKSL，从而对丹参酮的合成产生抑制作用。

实施例6利用HPLC测定转基因丹参毛状根中丹参酮含量

1、色谱条件

色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈：水(65:35)，检测波长270nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μl。

2、转基因毛状根丹参酮的提取

将实施例3中收获并烘干的转基因丹参毛状根放入研钵中充分研磨，取100mg毛状根干粉加入甲醇：二氯甲烷(3:1，v/v)16ml，超声提取60min，室温放置过夜，次日拿出离心(12000rpm,10min)，吸取上清萃取液真空干燥，残余物重新用2ml的色谱甲醇溶解，样品用0.22μm的滤膜过滤后各取20μl，注入高效液相色谱仪测量二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮ⅡA的含量。

3、过表达SmJAZ3及Anti-SmJAZ3毛状根丹参酮含量的测定

利用HPLC对已提取的丹参酮进行含量测定，先利用标品作出各个成分的标准曲线，再根据每个样品中每个组分的峰面积带入标准方程，计算各个样品的丹参酮含量。结果如图9所示。图9中，HT表示二氢丹参酮；CT代表隐丹参酮；T1表示丹参酮I；T2A代表丹参酮IIA；TT：总丹参酮；C58C1表示空菌毛状根；2300⁺表示空载转化得到的毛状根。C58C1、2300⁺对照组的丹参酮含量均约为1.37mg/gDW。过表达SmJAZ3基因的株系中，丹参酮的含量最低可达到0.077mg/gDW。anti-SmJAZ3-3株系中丹参酮含量可达到4.78mg/gDW，比对照高2.48倍。该结果表明，SmJAZ3是丹参酮合成过程中的一个抑制因子。

作为一种传统中药，丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)在临床治疗心、脑血管疾病、调节经期不调、血液循环疾病及抗癌方面均有显著作用。丹参主要成分丹参酮和丹酚酸均具有较强的药理活性，其中丹参酮类物质具有抗肿瘤，抗菌消炎，抗氧化，抗动脉粥样硬化等多种药理活性，因此具有巨大的市场需求。目前对丹参的研究主要基于丹参的两条合成途径即MEP和MVA途径中的关键酶基因的研究。本发明首次克隆得到丹参的JAZ3基因(JasmonateZIMdomain)，通过结构分析，其含有JAZ基因两个保守的结构域——ZIM结构域及Jas结构域。通过植物表达载体pCAMBIA2300构建该两个基因的过表达及反义抑制载体，利用农杆菌C58C1介导遗传转化丹参无菌苗获得丹参发根。共获得阳性克隆pCAMBIA2300⁺-SmJAZ321个、pCAMBIA2300⁺-Anti-SmJAZ316个。HPLC结果表明在pCAMBIA2300⁺-SmJAZ3转基因发根中的丹参酮含量均下调，其中pCAMBIA2300⁺-SmJAZ3-3含量为0.077mg/gDW，与对照相比(1.37mg/gDW)明显降低。Anti-SmJAZ3毛状根株系中丹参酮含量普遍上调，其中anti-SmJAZ3-3株系中可达到4.78mg/gDW。

本发明首次克隆得到SmJAZ3基因，并验证发现SmJAZ3是丹参酮合成的抑制因子，可通过降低该抑制因子的表达水平，提高丹参酮合成前体的含量，从而大幅度的提高丹参中丹参酮的含量。为解决市场上丹参酮药源紧缺问题提供一种新的方法和研究策略。

Claims (6)

1.一种丹参酮生物合成抑制因子基因SmJAZ3，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

2.根据权利要求1所述的丹参酮生物合成抑制因子基因SmJAZ3，其特征在于，所述基因SmJAZ3编码的蛋白质的氨基酸残基序列如SEQIDNo.2所示。

3.一种质粒，其特征在于，所述质粒含有基因SmJAZ3的全序列。

4.一种植物过表达载体，其特征在于，所述植物表达载体含有基因SmJAZ3的正向全序列。

5.一种植物反义抑制载体，其特征在于，所述植物反义抑制载体含有基因SmJAZ3的反向全序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有基因SmJAZ3的核苷酸序列，或含有基因SmJAZ3的全序列，或含有基因SmJAZ3的正向全序列，或含有基因SmJAZ3的反向全序列。