CN105378109A - 使用尿嘧啶-dna-n-糖基化酶使错误最小化 - Google Patents

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Abstract

本文提供涉及核酸的酶修饰的技术，和特别但不限于涉及使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶以使由胞嘧啶残基的脱氨作用导致的DNA序列的错误最小化或消除所述错误的方法和组合物。

Description

使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶使错误最小化
本申请要求提交于2013年3月14日的美国临时专利申请系列号61/782,698的优先权，其通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本文提供涉及核酸的酶修饰的技术，和特别但不限于涉及使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶以使由胞嘧啶残基的脱氨作用导致的DNA序列的错误最小化或消除所述错误的方法、试剂盒和组合物。
背景
pH、温度、离子强度、压力等的变化经常用于分子生物学过程和测定法以引起样品组分例如核酸、蛋白、辅因子等变化。然而，特定样品组分(例如特定蛋白)的一些分子生物学操作对其它样品组分(例如核酸)产生不需要的影响。例如，在分子生物学中使用热活化的酶需要一段加热的时间(例如，在95℃ 10-20分钟)以活化酶。在该加热期间，存在于样品中的核酸(例如DNA)也受到加热。加热核酸诱导胞嘧啶的脱氨作用(参见例如Lindahl和Nyberg (1974)“Heat-induced deamination of cytosine residues in deoxyribonucleic acid（在脱氧核糖核酸中胞嘧啶残基的热诱导的脱氨作用）”, Biochemistry 13(16): 3405)，其导致将胞嘧啶碱基转化成尿嘧啶碱基。而胞嘧啶碱基与鸟嘌呤配对，尿嘧啶碱基与腺嘌呤配对。因此，在互补DNA链的合成期间尿嘧啶碱基编码腺嘌呤。在DNA链中的该起始的错误导致在随后自损坏的模板合成的DNA链中G至A的突变和/或C至T的突变。
尽管具有2百万个碱基的单链DNA分子在pH 7.4和37℃每2.8小时将经历涉及胞嘧啶的单脱氨作用事件，但95℃孵育DNA以大约2 × 10–7次脱氨作用事件/秒的速率诱导胞嘧啶的脱氨作用(参见例如Lindahl和Nyberg, 同上)。根据该速率，在95℃加热DNA 10分钟以大约1个/8333个胞嘧啶引起胞嘧啶转变为尿嘧啶。因此，该速率是意义重大的，因为分子生物学样品经常包含超过百万(或甚至超过十亿)个胞嘧啶残基。该转变对于单核苷酸多态性(SNP)检测测定是个问题，在所述测定中检测靶向的SNP为G至A或C至T转变。例如，在加热活化期间大约1个/8333个拷贝野生型序列将转变成突变体拷贝，因此产生SNP存在于样品中的假阳性结果。因此，需要在分子生物学过程中解决核酸的热脱氨作用的技术。
简述
因此，本文提供涉及核酸的酶修饰的技术，和特别但不限于涉及使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶(一种“UDG”酶，通常由称为UNG的基因编码)以使由胞嘧啶残基的脱氨作用(例如，由于加热DNA导致)导致的DNA序列的错误最小化或消除所述错误的方法和组合物。在DNA分子可用作DNA合成的模板之前，尿嘧啶-DNA糖基化酶通过从DNA分子消除尿嘧啶阻止将C至U和G至A的突变固定到复制的DNA中。通过将损坏的碱基弹出双螺旋和切割N-糖苷键，尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶切割连接尿嘧啶碱基与DNA骨架的N-糖苷键，从而除去损坏的含氮碱基和留下完整的糖-磷酸骨架。作为该过程的结果，在DNA链中产生脱碱基位点(亦称为脱嘌呤/脱嘧啶位点或AP位点)。
脱碱基位点引起聚合酶停止。在一些条件下，脱碱基位点引起DNA链的中断(例如，自发地和/或由于在脱碱基位点上切割核酸的酶的作用)。在任一情况下，聚合酶不继续越过脱碱基位点，因此不引入碱基到脱碱基位点相对的互补链中。因此，聚合酶不产生与损坏的DNA模板互补的突变体DNA链，所述损坏的DNA模板由损坏的寡核苷酸引物引发导致，或因为各种分子生物学方法中的其它损坏的核酸导致。因此，损坏的碱基不引起样品中的突变体序列的扩增。没有该活性的情况下，在DNA合成期间自损坏的C产生的U指导聚合酶掺入A而不是G到相对互补链中；后续轮合成掺入T到错误的A的对面。结果，起始的脱氨作用事件导致将C至T和G至A的突变固定到所有后续拷贝中。C碱基的脱氨作用因此在天然群体中导致突变。
此外，在合成扩增核酸的方法(例如在聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应、引物延伸反应和其它扩增反应，如下文更详细描述)中，C碱基经脱氨作用产生U碱基是明显成问题的。作为实例，在PCR期间DNA的扩增按指数发生。结果，表示样品中小比例的核酸的较少事件，例如单DNA链中的单C碱基的脱氨作用，被扩增和在PCR期间和在PCR的终产物中以显著量呈现。此外，后面的PCR循环的坪效应导致在最终的扩增产物中过度呈现起始较少种类的核酸。通过PCR-相关的热循环期间的已知诱导C碱基的脱氨作用的加热期，这些脱氨作用问题加重。
因此，本文提供的技术涉及从DNA中识别和除去U碱基的酶。在一些实施方案中，所述酶自热稳定的生物分离。热稳定的酶通过许多方法产生，和热稳定的酶的来源不限制所述技术。例如，在一些实施方案中热稳定的酶是自嗜热生物(例如，古细菌(Archaea)的嗜热成员例如闪烁古生球菌(Archaeglobus fulgidis))分离的酶。
所述技术包括组合物、方法和反应混合物，其包括(或包括使用)以下酶：从DNA中识别和除去U碱基的天然热稳定的酶，例如天然热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶；从DNA中识别和除去U碱基的重组体热稳定的酶，例如重组体热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶；从DNA中识别和除去U碱基的野生型热稳定的酶，例如野生型热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶；从DNA中识别和除去U碱基的突变体热稳定的酶，例如突变体热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶；和/或从DNA中识别和除去U碱基的工程改造的热稳定的酶，例如工程改造的热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶。
在一些实施方案中，所述酶自嗜温生物分离和是热稳定的酶。在一些实施方案中，热稳定的酶通过例如随机诱变、计算机建模、合理(定向)诱变、合理(定向)酶设计、体外进化(例如SELEX)等方法自较不热稳定的酶产生。在一些实施方案中，所述酶是冷稳定的酶(例如，自嗜冷或喜低温的生物分离)，其也是热稳定的。在一些实施方案中，所述酶是尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶(“UDG”或“UNG”)。
热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶是市购可得的。此外，几种热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶的核苷酸序列和/或氨基酸序列是已知的，和许多生物(包括许多嗜热生物)的基因组序列是已知的。因此，可购买热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶，或根据已知的核苷酸和/或蛋白序列和可得的基因组序列从生物分离热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶，例如通过PCR (例如，使用靶向保守区的引物，使用简并引物)、探针方法或通过完全体外合成。嗜热生物区别于嗜温生物之处在于特征例如它们的最适生长温度(例如，高于嗜温生物的最适生长温度)和基因组特征(例如，更高的GC含量)。
因此，在一些实施方案中，所述技术提供与热稳定的UDG相关的方法和组合物，所述UDG在加热期间保持其活性，例如，在PCR的加热步骤、测序反应的加热步骤、样品制备的加热步骤期间和/或在高温例如在60℃或更高、70℃或更高、80℃或更高、90℃或更高、或95℃或更高下孵育期间。例如，一些PCR方法使用热活化的聚合酶例如热活化的Taq聚合酶。经常，聚合酶保持无活性，直到在95℃或更高下加热。在该加热期间，发生C碱基脱氨作用。
所述技术广泛适用于使由胞嘧啶的脱氨作用(例如由于样品中核酸的任何加热导致)导致的核酸序列错误最小化或消除所述错误。在用于制备样品(例如分离和制备核酸和其它生物分子)的分子生物学技术中经常进行样品的加热。例如，自福尔马林固定的石蜡包埋样品(FFPE样品)中制备核酸经常伴随加热期，其产生胞嘧啶脱氨作用和在自FFPE样品分离的核酸序列中的相关错误。作为另一实例，加热经常用于制备用于测序的核酸(例如，在制备测序文库中)和在测序反应本身期间使用。因此，所述技术可适用于现有的测序技术和尚待开发的测序技术，例如与Sanger和Maxam测序相关的制备方法和方案、第二代(即下一代或Next-Gen)、第三代(即Next-Next-Gen)或第四代(即N3-Gen)测序技术，包括但不限于焦磷酸测序、通过连接测序、单分子测序、通过合成序列(SBS)、大规模平行克隆、大规模平行单分子SBS、大规模平行单分子实时、大规模平行单分子实时纳米孔技术、使用零模式波导的方法等。Morozova和Marra在Genomics, 92: 255 (2008)中提供一些这样的技术的综述，其通过引用以其整体结合到本文中。示例性的技术是包括扩增步骤的方法，例如由Roche作为454技术平台商业化的焦磷酸测序(例如GS 20和GS FLX)、由Illumina商业化的Solexa平台和由Applied Biosystems商业化的Supported Oligonucleotide Ligation and Detection (SOLiD)平台。亦称为单分子测序的其它方法的实例为由Helicos BioSciences商业化的HeliScope平台和分别由VisiGen, Oxford Nanopore Technologies Ltd.、Life Technologies/Ion Torrent和Pacific Biosciences商业化的显现中的平台(例如纳米孔测序、基于pH的核苷酸掺入事件检测、Xpandomer技术)。
所述技术还涉及与样品制备相关的方法，例如限制性消化、基因组扩增、片段化、末端修复、连接(例如，接头连接)、链分离、二级和/或三级结构的熔解、污染物去除、蛋白去除、细胞裂解、自组织和/或细胞和/或生物流体制备核酸、附着至固体支持物、引物退火等。
所述技术还在微阵列技术、探针检测技术(例如，印迹方法例如Southern印迹、Northern印迹、斑点印迹、槽印迹、杂交保护测定法等)中找到用途。
核酸扩增的方法经常结合样品的加热。核酸扩增技术的实例包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如PCR)要求在扩增前将RNA反转录成DNA (例如RT-PCR)，而其它扩增技术直接扩增RNA (例如TMA和NASBA)。
聚合酶链反应(美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159和4,965,188，各自通过引用以其整体结合到本文中)，通常称为PCR，使用多个循环的变性、引物对退火至相对链和引物延伸以指数增加靶核酸序列的拷贝数。在称为RT-PCR的变化中，逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补DNA (cDNA)，和然后通过PCR扩增cDNA以产生多拷贝的DNA。对于PCR的其它各种改变，参见例如美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159；Mullis等, Meth. Enzymol. 155: 335 (1987)；和Murakawa等, DNA 7: 287 (1988)，各自通过引用以其整体结合到本文中。
转录介导的扩增(美国专利号5,480,784和5,399,491，各自通过引用以其整体结合到本文中)，通常称为TMA，在基本恒定的温度、离子强度和pH的条件下自动催化性合成多拷贝的靶核酸序列，其中靶序列的多个RNA拷贝自动催化产生另外的拷贝。参见例如美国专利号5,399,491和5,824,518，各自通过引用以其整体结合到本文中。在描述于美国公布号20060046265 (通过引用以其整体结合到本文中)的变化中，TMA任选结合使用封闭部分、终止部分和其它修饰部分以改进TMA过程的灵敏度和准确度。
连接酶链反应(Weiss, R., Science 254: 1292 (1991)，通过引用以其整体结合到本文中)，通常称为LCR，使用与靶核酸的邻近区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在重复循环的热变性、杂交和连接中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物。
链置换扩增(Walker, G.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396 (1992); 美国专利号5,270,184和5,455,166，各自通过引用以其整体结合到本文中)，通常称为SDA，使用下列的循环：将引物序列对退火至靶序列的相对链、在dNTPαS的存在下引物延伸以产生双链体半硫代磷酸酯化的引物延伸产物、半修饰的限制性核酸内切酶识别位点的核酸内切酶介导切口和聚合酶介导的自切口的3'末端的引物延伸，以置换现有链和产生用于下一轮引物退火、切口和链置换的链，导致产物的几何扩增。嗜热SDA (tSDA)在更高的温度下在基本相同的方法中，使用嗜热核酸内切酶和聚合酶(欧洲专利号0 684 315)。
其它扩增方法包括例如：基于核酸序列的扩增(美国专利号5,130,238，通过引用以其整体结合到本文中)，通常称为NASBA；使用RNA复制酶以扩增探针分子本身的扩增方法(Lizardi等, BioTechnol. 6: 1197 (1988)，通过引用以其整体结合到本文中)，通常称为Qβ复制酶；基于转录的扩增方法(Kwoh等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989))；和自持续序列复制(Guatelli等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990)，各自通过引用以其整体结合到本文中)。对于已知扩增方法的其它论述，参见例如Persing, David H., Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications(诊断医学微生物学：原理和应用) (Persing等编辑)中的“In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques(体外核酸扩增技术)”，第51-87页(American Society for Microbiology, Washington, DC (1993))。
在一些实施方案中，扩增是等温扩增方法。在一些实施方案中，扩增方法是固相扩增、polony扩增、集落(colony)扩增、乳液PCR、珠RCA、表面RCA、表面SDA等，如本领域技术人员所认识到的。在一些实施方案中，使用导致溶液中游离DNA分子扩增或通过DNA分子的仅一个末端连接至合适基质的DNA分子扩增的扩增方法。在一些实施方案中，使用依赖于桥式PCR的方法，其中两个PCR引物连接至表面(参见例如WO 2000/018957、U.S. 7,972,820、7,790,418和Adessi等, Nucleic Acids Research (2000): 28(20): E87；各自通过引用结合到本文中)。在一些情况下，本发明的方法可产生“聚合酶集落(colony)技术”或“polony”，其是指保持相同扩增子的空间聚类的多路扩增。这些包括例如原位polony (Mitra和Church, Nucleic Acid Research 27, e34, 1999年12月15日)、原位滚环扩增(RCA) (Lizardi等, Nature Genetics 19, 225, 1998年7月)、桥式PCR (美国专利号5,641,658)、皮滴定(picotiter) PCR (Leamon等, Electrophoresis 24, 3769, 2003年11月)和乳液PCR (Dressman等, PNAS 100, 8817, 2003年7月22日)。
所述技术不限制于损坏(例如通过胞嘧啶的脱氨作用(例如热诱导或其它(例如pH诱导)的胞嘧啶的脱氨作用)或掺入尿嘧啶到DNA中)和随后暴露于从核酸中除去尿嘧啶的酶(例如UDG)的核酸的类型(例如，关于其大小、目的、来源(例如天然的或合成的)等)。例如，在一些程序中，探针、寡核苷酸、引物、接头、基因组、扩增子、质粒或其它核酸受到损坏，例如，其包含脱氨的胞嘧啶，例如因为加热导致。所述技术包括使因这些类型的损坏的核酸产生的错误最小化或消除所述错误。
因此，所述技术涉及热稳定的UDG，其在活化聚合酶的高温下孵育期间和之后(例如，在95℃下10分钟孵育以活化Taq聚合酶)保持活性。此外，所述技术涉及热稳定的UDG，其在PCR期间防止引物退火和链延伸的高温下具有活性。具体而言，在聚合酶将腺嘌呤置于尿嘧啶对位之前，UDG从DNA中除去U碱基。所述技术不限制于在相关的组合物、方法和用途中找到用途的UDG。因此，具有类似活性的任何热稳定的UDG或酶在所述技术中找到用途。因此，所述技术提供用于在涉及探知DNA序列的分子生物学测定法中增加灵敏度和减少假阳性率的方法。具体而言，所述技术提供用于在检测G至A和/或C至T的突变的分子生物学测定法中例如在基于PCR的SNP测定分析中增加灵敏度和减少假阳性率的方法，所述测定法。
所述技术的实施方案提供用于使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶以使由胞嘧啶残基的脱氨作用导致的DNA序列的错误最小化或消除所述错误的试剂盒。试剂盒实施方案包括一个或多个容器(例如，小瓶、安瓿、瓶、包等)，其包含热活化的聚合酶(例如，用于PCR例如实时PCR的聚合酶)和从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶，例如热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶。一些实施方案提供在脱碱基位点上切割核酸的酶(例如，核酸酶，例如热稳定的核酸酶)。在一些实施方案中，单一酶提供尿嘧啶去除活性和核酸酶活性两者；在一些实施方案中，一种酶提供尿嘧啶去除活性和第二种酶提供核酸酶活性。
在所述试剂盒的一些实施方案中，一种组合物包含两种酶(例如，热活化聚合酶和从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶)的混合物，所述试剂盒的一些实施方案包含两种组合物，一种包含热活化聚合酶和第二种包含从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶。在包含两种组合物的试剂盒中，两种组合物可在使用前混合在一起，例如以试剂盒提供的方案所述的限定比例。试剂盒的其它实施方案包含对照核酸，例如对于在检测核酸的突变(例如测定SNP存在情况的测定法)中找到用途的试剂盒的实施方案。对照核酸的实例是在SNP位置上包含野生型序列的核酸(例如阴性对照)和在SNP位置上包含突变体序列的一种或多种核酸(例如阳性对照)。试剂盒实施方案还可包含与作为测定主题的核酸不相关的核酸，例如用作内部参照对照以标准化产生的扩增子的量或UDG酶的活性的核酸。例如，一些对照核酸是包含一个或多个尿嘧啶碱基以提供UDG活性的阳性对照的合成DNA分子。
所述技术包括作为反应混合物的组合物。例如，所述技术的实施方案提供包含热活化的聚合酶和从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶例如热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶的反应混合物。在一些实施方案中，热活化的聚合酶是热稳定的聚合酶。在一些实施方案中，反应混合物包含有效聚合、热活化的、热稳定的聚合酶，例如在核酸例如DNA或RNA的合成中将核苷酸添加至核酸链的聚合酶。在一些实施方案中，反应混合物包含从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶，例如从DNA中有效去除U碱基的热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶。
涉及反应混合物的技术的实施方案提供包含0.1单位的量、1.0单位至2.0单位的量或超过2.0单位的量(例如2.5单位、3.0单位、4.0单位、5.0单位、10单位、20单位或更多)的从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶，例如热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶的反应混合物。相关的方法实施方案包括使用0.1单位的量、1.0单位至2.0单位的量或超过2.0单位的量(例如2.5单位、3.0单位、4.0单位、5.0单位、10单位、20单位或更多)的从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶例如热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶。
此外，涉及反应混合物(和涉及使用反应混合物的方法)的技术的实施方案提供包含从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶例如热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶的反应混合物，所述酶的量或浓度足以从DNA中除去U碱基和使突变(例如因胞嘧啶的脱氨作用例如热诱导的脱氨作用导致)最小化和/或防止突变的增加，例如在扩增反应中。此外，涉及反应混合物的技术的实施方案提供包含从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶，例如热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶的反应混合物，所述酶的量或浓度足以使由胞嘧啶残基的脱氨作用导致的DNA序列的错误最小化或消除所述错误。其它实施方案提供包含在热活化的聚合酶的热活化期期间和之后以下列速率从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶例如热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶的反应混合物，所述速率为相对于在热活化的聚合酶的热活化期之前从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶例如热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶除去U碱基的速率的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少相等或未变化。例如，实施方案提供包含从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶，例如热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶的反应混合物，所述酶在热活化的聚合酶的热活化期间和之后具有下列活性：其为相对于在热活化的聚合酶的热活化之前从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶例如热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶的活性的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少相等或未变化。
相关的实施方案包括加入从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶至先前未包含这样的酶的组合物中。其它实施方案涉及加入至少0.1单位的从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶至包含少于0.1单位的这样的酶的组合物，例如在本发明的技术提供的添加以提供本发明技术的反应混合物或组合物之前包含少于0.1单位的组合物中。
一些相关的方法实施方案包括比较包含从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶例如热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶的反应(例如扩增反应)的产物与不包含从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶例如热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶的反应的产物。例如，进行这些比较或类似的比较以证实从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶有活性，和/或按扩增反应所预期地进行，例如，与不包含从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶的反应混合物的产物相比，包含从DNA中识别和除去U碱基的热稳定的酶的反应混合物的产物包含更少由胞嘧啶的脱氨作用产生的突变。
因此，本文提供涉及用于检测包含靶序列的靶核酸的方法的技术，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1单位的尿嘧啶-DNA糖基化酶和样品的一部分至反应混合物；将尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，尿嘧啶-DNA糖基化酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和检测包含靶序列的扩增子。在一些实施方案中，尿嘧啶-DNA糖基化酶是热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶。此外，提供这样的实施方案，其中反应混合物包含聚合酶和所述方法还包括将反应混合物暴露于使聚合酶活化的温度。所述技术涉及有效加入尿嘧啶-DNA糖基化酶至反应混合物，例如以消除在核酸检测测定中例如在检测SNP的PCR扩增中检测的序列错误(例如，因为热诱导的胞嘧啶脱氨作用导致)或使所述序列错误最小化。因此，提供这样的方法实施方案，其中尿嘧啶-DNA糖基化酶的量或浓度足以以下列速率在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后从DNA中除去尿嘧啶，所述速率为在热活化的聚合酶的热活化期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去碱基的速率的至少30%。因此，在一些实施方案中，损坏的核酸未扩增和/或未检出；在一些实施方案中，损坏的核酸扩增少于靶核酸；在一些实施方案中，损坏的核酸在比靶核酸更后的循环中检出。
所述技术不限制于所用的检测方法。例如，在一些实施方案中，所述检测包括使用标记的探针。在一些实施方案中，所述检测包括测序；在一些实施方案中，所述检测包括使用质谱法；在一些实施方案中，所述检测包括测定碱基组成。在一些实施方案中，所述检测包括测定限制性图谱。在一些实施方案中，所述检测包括使用瓣状核酸内切酶(flap endonuclease)和一种或多种等位基因特异性探针(例如，在Invader测定法中；参见例如Olivier (2005) “The Invader assay for SNP genotyping” Mutat. Res. 573: 103-10)。在一些实施方案中，所述检测包括分离技术，例如色谱法、凝胶电泳等。
在一些实施方案中，所述技术涉及热损坏的DNA，例如因热活化的聚合酶的热孵育而产生的热损坏的DNA。因此，在所述技术的一些实施方案中，聚合酶是热活化的聚合酶。在一些实施方案中，损坏的核酸存在和包含尿嘧啶碱基；在一些实施方案中，损坏的核酸存在和包含脱氨的胞嘧啶。
在一些实施方案中，靶序列是单核苷酸多态性，例如在一些实施方案中，靶序列包含胞嘧啶或鸟嘌呤。
在一些实施方案中，所述技术涉及用于检测包含靶序列(例如SNP和/或包含鸟嘌呤和/或胞嘧啶)的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶(例如尿嘧啶-DNA糖基化酶，例如热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶，例如其量或浓度足以以下列速率在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后从DNA中除去尿嘧啶，所述速率为在热活化的聚合酶的热活化期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去碱基的速率的至少30%)和样品的一部分至反应混合物；使尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，尿嘧啶-DNA糖基化酶从损坏的核酸(例如包含尿嘧啶碱基，例如脱氨的胞嘧啶)切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和使扩增子与对靶序列特异性的核酸探针(例如标记的探针)接触，其中如果探针与靶序列杂交，则检出靶核酸；和/或损坏的核酸未扩增和/或未检出；和/或损坏的核酸扩增少于靶核酸。
在一些实施方案中，所述技术涉及用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的尿嘧啶-DNA糖基化酶(例如热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶)和样品的一部分至包含聚合酶(例如热活化的聚合酶)的反应混合物；将尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，尿嘧啶-DNA糖基化酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；将反应混合物暴露于使聚合酶活化的温度；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和使扩增子与对靶序列特异性的核酸探针接触，其中如果探针与靶序列杂交，则检出靶核酸。
在一些实施方案中，所述技术涉及用于检测包含靶序列(例如SNP和/或包含鸟嘌呤和/或胞嘧啶)的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶和在脱碱基位点上切割DNA的酶(例如尿嘧啶-DNA糖基化酶，例如热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶，例如其量或浓度足以以下列速率在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后从DNA中除去尿嘧啶，所述速率为在热活化的聚合酶的热活化期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去碱基的速率的至少30%)和样品的一部分至反应混合物；将尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，尿嘧啶-DNA糖基化酶从损坏的核酸(例如包含尿嘧啶碱基，例如脱氨的胞嘧啶)切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和使扩增子与对靶序列特异性的核酸探针(例如标记的探针)接触，其中如果探针与靶序列杂交，则检出靶核酸；和/或损坏的核酸未扩增和/或未检出；和/或损坏的核酸扩增少于靶核酸。
在一些实施方案中，所述技术涉及用于检测包含靶序列(例如SNP和/或包含鸟嘌呤和/或胞嘧啶)的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶(例如尿嘧啶-DNA糖基化酶，例如热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶，例如其量或浓度足以以下列速率在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后从DNA中除去尿嘧啶，所述速率为在热活化的聚合酶的热活化期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去碱基的速率的至少30%)、在脱碱基位点上切割DNA的酶(例如核酸内切酶)和样品的一部分至反应混合物；将尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，尿嘧啶-DNA糖基化酶从损坏的核酸(例如包含尿嘧啶碱基，例如脱氨的胞嘧啶)切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和将扩增子与对靶序列特异性的核酸探针(例如标记的探针)接触，其中如果探针与靶序列杂交，则检出靶核酸；和/或损坏的核酸未扩增和/或未检出；和/或损坏的核酸扩增少于靶核酸。
所述技术涉及使如通过测序反应所检测的扩增子的序列错误最小化。因此，一些实施方案提供用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和将扩增子测序以测定扩增子的核酸序列，其中当扩增子的核酸序列包含靶序列时，检出靶核酸。
所述技术涉及使如通过质谱法技术所检测的扩增子的序列错误最小化。因此，一些实施方案提供用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括：提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和通过质谱法探询扩增子，以测定扩增子的化学组成，其中当扩增子的化学组成与靶序列的化学组成匹配时，检出靶核酸。
所述技术涉及使如通过限制性分析(例如，使用限制性酶以产生限制性图谱，例如在RFLP分析中)所检测的扩增子的序列错误最小化。因此，一些实施方案提供用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和使扩增子与限制性核酸内切酶接触以产生限制性图谱，其中当扩增子的限制性图谱与靶序列的限制性图谱匹配时，检出靶核酸。
所述技术涉及使如通过Invader测定法所检测的扩增子的序列错误最小化。因此，一些实施方案提供用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和将扩增子与瓣状核酸内切酶接触，其中当瓣状核酸内切酶切割产物检出时，检出靶核酸。
所述技术涉及使如通过引物延伸测定法所检测的扩增子的序列错误最小化。因此，一些实施方案提供用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和将扩增子与用于引物延伸测定法的引物、核苷酸和聚合酶接触，其中当聚合酶添加核苷酸至引物时，检出靶核酸。
所述技术涉及使如通过连接检测反应所检测的扩增子的序列错误最小化。因此，一些实施方案提供用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和使扩增子与第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和连接酶接触，其中当连接酶连接第一和第二寡核苷酸时，检出靶核酸。
所述技术涉及使如通过扩增子的物理性质(例如，测定解链温度和/或解链特征，例如通过高分辨率解链曲线分析、通过单链构象多态性(SSCP)分析、通过高分辨率和/或高效液相色谱法(HPLC) (例如，变性HPLC)、通过电泳(例如凝胶电泳，例如温度梯度凝胶电泳)等所检测的扩增子的序列错误最小化。因此，一些实施方案提供用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和测定扩增子的物理性质，其中当扩增子的物理性质与靶序列的物理性质匹配时，检出靶核酸。
在一些实施方案中，所述技术提供消除、减少和/或最小化核酸(例如通过PCR产生的扩增子)的序列错误。扩增子的序列错误可以数种方法定量。例如，扩增子的序列(例如扩增子的靶序列)可与已知的靶核酸序列比对或以其它方式比较(例如，通过与数据库比较或通过其它生物信息学技术)，以测定在扩增子序列和已知序列之间的错配数。以该方式测定根据所述技术(例如，在从核酸除去尿嘧啶的酶的存在下)产生的扩增子和通过常规方法(例如，没有从核酸除去尿嘧啶的酶)产生的扩增子的错配，得到通过所述技术消除、减少和/或最小化核酸序列错误的定量和/或定性的测量。
因此，在一些实施方案中，提供用于使包含靶序列的扩增子的序列错误最小化的扩增方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品，所述靶核酸包含靶序列；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；和热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子，其中相对于在缺少至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶的情况下产生的扩增子，所述扩增子包含更少的由胞嘧啶的脱氨作用产生的序列错误。
一些实施方案提供用于使包含靶序列的扩增子的序列错误最小化的扩增方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品，所述靶核酸包含靶序列；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；和热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子，其中通过与样品中的靶核酸的靶序列比对或比较测定的扩增子的靶序列中的错配的第一数量小于通过与样品中的靶核酸的靶序列比对或比较测定的在缺少从DNA中除去尿嘧啶的酶的情况下产生的扩增子的靶序列中的错配的第二数量。
其它实施方案提供在扩增前处理核酸以除去在扩增前存在于核酸样品中的任何尿嘧啶碱基(例如，作为其它方法和/或处理样品的结果)。因此，本文提供用于使包含靶序列的扩增子的序列错误最小化的扩增方法的实施方案，所述方法包括提供包含靶核酸的样品，所述靶核酸包含靶序列；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件，然后热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子，其中相对于在缺乏至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶的情况下产生的扩增子，所述扩增子包含更少的由胞嘧啶的脱氨作用产生的序列错误。
一些实施方案提供用于使包含靶序列的扩增子的序列错误最小化的扩增方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品，所述靶核酸包含靶序列；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件，然后热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子，其中通过与样品中的靶核酸的靶序列比对或比较测定的扩增子的靶序列中的错配的第一数量小于通过与样品中的靶核酸的靶序列比对或比较测定的在缺少从DNA中除去尿嘧啶的酶的情况下产生的扩增子的靶序列中的错配的第二数量。
一些实施方案提供用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶和还在脱碱基位点上切割DNA的酶和样品的一部分至反应混合物；将酶暴露于其中酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基和切割损坏的核酸(如果存在的话)的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和检测包含靶序列的扩增子。
一些实施方案提供用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶、在脱碱基位点上切割DNA的酶和样品的一部分至反应混合物；将酶暴露于其中从DNA中除去尿嘧啶的酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基和在脱碱基位点上切割DNA的酶切割损坏的核酸(如果存在的话)的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和检测包含靶序列的扩增子。
在其它实施方案中提供组合物，其包括包含靶序列的靶核酸、聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶和包含尿嘧啶碱基的损坏的核酸。在一些实施方案中，尿嘧啶-DNA糖基化酶是热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶。在一些实施方案中，组合物还包含对靶序列特异性的探针。一些具体的实施方案提供聚合酶是热活化的聚合酶。在某些实施方案中，扩增子由扩增反应产生；因此在一些实施方案中，技术的组合物还包括包含靶序列的扩增子。实施方案涉及检测SNP；因此，在一些实施方案中靶序列包含单核苷酸多态性。在一些实施方案中，靶序列包含胞嘧啶或鸟嘌呤。
在一些实施方案中提供组合物，其包括包含靶序列(例如包含SNP，例如包含胞嘧啶和/或鸟嘌呤)的靶核酸、聚合酶(例如热活化的聚合酶)、尿嘧啶-DNA糖基化酶(例如热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶) (例如至少0.1-1.0单位的尿嘧啶-DNA糖基化酶)、包含尿嘧啶碱基的损坏的核酸、对靶序列特异性的探针(例如标记的探针)和包含靶序列(例如包含SNP，例如包含胞嘧啶和/或鸟嘌呤)的扩增子。
在一些实施方案中提供组合物，其包括包含靶序列(例如包含SNP，例如包含胞嘧啶和/或鸟嘌呤)的靶核酸、聚合酶(例如热活化的聚合酶)、尿嘧啶-DNA糖基化酶(例如热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶) (例如尿嘧啶-DNA糖基化酶的量或浓度足以以下列速率在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后从DNA中除去尿嘧啶，所述速率为在热活化的聚合酶的热活化期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去碱基的速率的至少30%)、包含尿嘧啶碱基的损坏的核酸、对靶序列特异性的探针(例如标记的探针)和包含靶序列(例如包含SNP，例如包含胞嘧啶和/或鸟嘌呤)的扩增子。
在一些实施方案中提供组合物，其包括包含靶序列(例如包含SNP，例如包含胞嘧啶和/或鸟嘌呤)的靶核酸、聚合酶(例如热活化的聚合酶)、尿嘧啶-DNA糖基化酶(例如热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶) (例如尿嘧啶-DNA糖基化酶的量或浓度足以在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后从损坏的核酸中除去尿嘧啶)、包含尿嘧啶碱基的损坏的核酸、对靶序列特异性的探针(例如标记的探针)和包含靶序列(例如包含SNP，例如包含胞嘧啶和/或鸟嘌呤)的扩增子。
所述技术提供组合物的实施方案，所述组合物包含至少0.1-1.0单位的尿嘧啶-DNA糖基化酶。所述技术提供组合物的实施方案，所述组合物包含在加热期(例如在热活化的聚合酶的热活化期间)期间和/或之后足以以下列速率从DNA中除去尿嘧啶的量或浓度的尿嘧啶-DNA糖基化酶，所述速率为在加热期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去碱基的速率的至少30%。所述技术提供组合物的实施方案，所述组合物包含足以在加热期(例如在热活化的聚合酶的热活化期间)期间和/或之后从DNA中除去一定量的尿嘧啶的量或浓度的尿嘧啶-DNA糖基化酶，所述尿嘧啶的量为在加热期前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去尿嘧啶碱基的量的至少30%。因此，所述技术提供组合物的实施方案，所述组合物包含足以在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后从损坏的核酸中除去尿嘧啶的量或浓度的尿嘧啶-DNA糖基化酶。
所述技术包括试剂盒实施方案。例如，本文提供用于检测核酸的试剂盒的实施方案，其中所述试剂盒包括包含热活化的聚合酶的第一容器和包含热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶的第二容器。在一些实施方案中，试剂盒包括包含热活化的聚合酶和热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶的容器。一些实施方案提供还包含对照核酸的试剂盒，例如，如本文所述。一些实施方案提供用于检测核酸的试剂盒，所述试剂盒包括包含热活化的聚合酶的第一容器、包含热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶的第二容器；和所述试剂盒还包含对照核酸。一些实施方案提供用于检测核酸的试剂盒，所述试剂盒包括包含热活化的聚合酶和热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶的容器，和所述试剂盒还包含对照核酸。
所述技术的实施方案提供用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的尿嘧啶-DNA糖基化酶和样品的一部分至反应混合物；将尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，尿嘧啶-DNA糖基化酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和检测包含靶序列的扩增子。
所述技术的实施方案提供用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶和样品的一部分至反应混合物；将热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和检测包含靶序列的扩增子。
所述技术的实施方案提供用于检测包含靶序列(例如SNP，例如包含胞嘧啶或鸟嘌呤)的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的尿嘧啶-DNA糖基化酶和样品的一部分至反应混合物(例如包含聚合酶；例如热活化的聚合酶；例如热活化的热稳定的聚合酶)；将尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，尿嘧啶-DNA糖基化酶从损坏的核酸(例如，热损坏的DNA，例如包含由例如热诱导的脱氨作用(例如在PCR期间例如在热活化的聚合酶的热孵育期间发生)产生的脱氨的胞嘧啶的DNA)切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和检测包含靶序列的扩增子(例如，使用标记的探针检测扩增子；将扩增子测序；获得扩增子的质谱数据；通过电泳检测扩增子；和/或检测扩增子的碱基组成)。
所述技术的实施方案提供用于检测包含靶序列(例如SNP，例如包含胞嘧啶或鸟嘌呤)的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入至少0.1-1.0单位的尿嘧啶-DNA糖基化酶和样品的一部分至反应混合物(例如包含聚合酶；例如热活化的聚合酶；例如热活化的热稳定的聚合酶)；将反应混合物暴露于活化热活化的聚合酶的温度；将尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，尿嘧啶-DNA糖基化酶从损坏的核酸(例如，热损坏的DNA，例如包含自例如热诱导的脱氨作用(例如，在PCR期间例如在热活化的聚合酶的热孵育期间发生)产生的脱氨的胞嘧啶的DNA)切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和检测包含靶序列的扩增子(例如，使用标记的探针检测扩增子；将扩增子测序；自扩增子获得质谱数据；和/或检测扩增子的碱基组成)。
所述技术的实施方案提供用于检测包含靶序列(例如SNP，例如包含胞嘧啶或鸟嘌呤)的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入足以以下列速率在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后从DNA中除去尿嘧啶的量或浓度的尿嘧啶-DNA糖基化酶和样品的一部分至反应混合物(例如包含聚合酶；例如热活化的聚合酶；例如热活化的热稳定的聚合酶)，所述速率为在热活化的聚合酶的热活化期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去碱基的速率的至少30%；将反应混合物暴露于活化热活化的聚合酶的温度；将尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，尿嘧啶-DNA糖基化酶从损坏的核酸(例如，热损坏的DNA，例如包含自例如热诱导的脱氨作用(例如在PCR期间例如在热活化的聚合酶的热孵育期间发生)产生的脱氨的胞嘧啶的DNA)切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和检测包含靶序列的扩增子(例如，使用标记的探针检测扩增子；将扩增子测序；自扩增子获得质谱数据；和/或检测扩增子的碱基组成)。
所述技术的实施方案提供用于检测包含靶序列(例如SNP，例如包含胞嘧啶或鸟嘌呤)的靶核酸的方法，所述方法包括提供包含靶核酸的样品；加入足以以下列速率在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后从DNA中除去尿嘧啶的量或浓度的尿嘧啶-DNA糖基化酶和样品的一部分至反应混合物(例如包含聚合酶；例如热活化的聚合酶；例如热活化的热稳定的聚合酶)，所述速率为在热活化的聚合酶的热活化期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去碱基的速率的至少30%；将反应混合物暴露于活化热活化的聚合酶的温度；将尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，尿嘧啶-DNA糖基化酶从损坏的核酸(例如，热损坏的DNA，例如包含自例如热诱导的脱氨作用(例如在PCR期间例如在热活化的聚合酶的热孵育期间发生)产生的脱氨的胞嘧啶的DNA)切除尿嘧啶碱基的条件；热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和检测包含靶序列的扩增子(例如，使用标记的探针检测扩增子；将扩增子测序；自扩增子获得质谱数据；和/或检测扩增子的碱基组成)，其中损坏的核酸未扩增和/或未检出；和/或损坏的核酸扩增少于靶核酸。
所述技术的实施方案提供组合物，其包括包含靶序列的靶核酸、聚合酶、热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶和包含尿嘧啶碱基的损坏的核酸。所述技术的实施方案提供组合物，其包括包含靶序列的靶核酸、聚合酶、热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶、对靶序列特异性的探针和包含尿嘧啶碱基的损坏的核酸。所述技术的实施方案提供组合物，其包括包含靶序列的靶核酸、聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶、对靶序列特异性的探针和包含尿嘧啶碱基的损坏的核酸。
所述技术的实施方案提供组合物，其包括包含靶序列的靶核酸、聚合酶(例如热活化的聚合酶)、热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶和包含靶序列的扩增子。
一些实施方案提供组合物，其包含在脱碱基位点切割核酸的酶，例如核酸酶，例如热稳定的核酸酶。
所述技术的实施方案提供组合物，其包括包含靶序列(例如包含SNP，例如包含胞嘧啶或鸟嘌呤)的靶核酸、聚合酶(例如热活化的和/或热稳定的聚合酶)、至少0.1-1.0单位(例如至少0.1单位、至少1.0单位、至少2.0单位、至少2.5单位、至少3.0单位、至少4.0单位、至少5.0单位、至少10单位、至少20单位或更多)的热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶和包含尿嘧啶碱基的损坏的核酸。
所述技术的实施方案提供组合物，其包括包含靶序列(例如包含SNP，例如包含胞嘧啶或鸟嘌呤)的靶核酸、聚合酶(例如热活化的和/或热稳定的聚合酶)、至少足以以下列速率在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后从DNA中除去尿嘧啶的量或浓度的尿嘧啶-DNA糖基化酶和包含尿嘧啶碱基的损坏的核酸，所述速率为在热活化的聚合酶的热活化期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去碱基的热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶的速率的至少30%)。
所述技术的实施方案提供组合物，其包括包含靶序列(例如包含SNP，例如包含胞嘧啶或鸟嘌呤)的靶核酸、聚合酶(例如热活化的和/或热稳定的聚合酶)、至少足以在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后从损坏的核酸中除去尿嘧啶的量或浓度的尿嘧啶-DNA糖基化酶和包含尿嘧啶碱基的损坏的核酸。
提供试剂盒实施方案，其包括包含热活化的聚合酶的第一容器、包含热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶的第二容器和对照核酸(例如阳性对照和/或阴性对照)。提供试剂盒实施方案，其包括包含热活化的聚合酶和热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶的容器；和对照核酸(例如阳性对照和/或阴性对照)。
根据本文包含的教导，其它实施方案对相关领域技术人员将是显而易见的。例如，尽管关于用于将由于热诱导的DNA修饰(例如C碱基的脱氨作用以形成U碱基)的错误最小化的热稳定的酶(例如UDG)描述了所述技术，但所述技术也涉及在其中发生类似的DNA修饰的各种条件中稳定的其它酶。例如，所述技术预期使用在其中发生类似的脱氨作用(例如C碱基的脱氨作用)的高或低pH下稳定的酶。例如，一些聚合酶通过pH变化而不是热活化来活化(尽管在一些实施方案中，pH变化受温度变化影响)，和所述技术包括pH-稳定的酶以从核酸中除去尿嘧啶(例如，因pH变化而产生的尿嘧啶，例如因pH-诱导的胞嘧啶的脱氨作用而产生)。所述技术类似预期在各种环境中是稳定的酶，以抵消压力、离子强度、有机溶剂和其它化学品等对DNA碱基的影响。
一些实施方案提供通过产生序列-特异性信号，记录序列-特异性信号和分析所述信号来评价遗传变异(例如，通过检测一个或多个SNP)。具体而言，一些实施方案包括处理原始数据(例如，定量或定性的原始数据)以鉴定SNP、SNP频率和/或SNP的组织特异性表达模式和/或表达水平。参见例如Wang等(2007) “SNP and mutation analysis” Adv. Exp. Med. Biol. 593: 105–16，通过引用以其整体结合到本文中。
所述技术还在从其它核酸除去尿嘧啶中找到用途，例如在天然存在的核酸中，例如在抗体多样化或类型转换期间引入至核酸的尿嘧啶。
附图简述
参照以下附图，本发明的技术的这些和其它特征、方面和优势将变得更好理解：
图1A是在5 ng的含有100%野生型KRAS序列的人基因组DNA的42个重复(箭头)和5 ng的含有1% G12D突变体KRAS序列的人基因组DNA的6个重复(箭)中在缺少UDG的情况下进行的G12D突变体KRAS检测的实时PCR图。X轴表示PCR循环数和y轴表示相对荧光单位。图1B是在1A中进行的实验的MaxRatio分析(参见例如Shain和Clements (2008), “A new method for robust quantitative and qualitative analysis of real-time PCR” Nucl. Acids Res. 36: e91，通过引用结合到本文中)。X轴表示循环数(与Ct类似)和y轴表示MaxRatio。每个重复单独作图。图1C是在5 ng的含有100%野生型KRAS序列的人基因组DNA的42个重复(箭头)和5 ng的含有1% G12D突变体KRAS序列的人基因组DNA的6个重复(箭)中在UDG存在的情况下进行的G12D突变体KRAS检测的实时PCR图。X轴表示PCR循环数和y轴表示相对荧光单位。图1D是在1C中进行的实验的MaxRatio分析。X轴表示循环数(类似于Ct)和y轴表示MaxRatio。每个重复单独作图。
图2A是在5 ng的含有100%野生型KRAS序列的人基因组DNA的42个重复(箭头)和5 ng的含有1% G13D突变体KRAS序列的人基因组DNA的6个重复(箭)中在缺乏UDG的情况下进行的G13D突变体KRAS检测的实时PCR图。X轴表示PCR循环数和y轴表示相对荧光单位。图2B是在2A中进行的实验的MaxRatio分析。X轴表示循环数(类似于Ct)和y轴表示MaxRatio。每个重复单独作图。图2C是在5 ng的含有100%野生型KRAS序列的人基因组DNA的42个重复(箭头)和5 ng的含有1% G13D突变体KRAS序列的人基因组DNA的6个重复(箭)中在UDG存在的情况下进行的G13D突变体KRAS检测的实时PCR图。X轴表示PCR循环数和y轴表示相对荧光单位。图2D是在2C中进行的实验的MaxRatio分析。X轴表示循环数(类似于Ct)和y轴表示MaxRatio。每个重复单独作图。
图3A是在范围为50 ng-400 ng的含100%野生型KRAS序列的人基因组DNA的12个重复(箭头)和范围为50 ng-400 ng的含1% G12D突变体KRAS序列的人基因组DNA的12个重复(箭)中在缺乏UDG的情况下进行的G12D突变体KRAS检测的实时PCR图。X轴表示PCR循环数和y轴表示相对荧光单位。图3B是在3A中进行的实验的MaxRatio分析。X轴表示循环数(类似于Ct)和y轴表示MaxRatio。每个重复单独作图。图3C是在范围为50 ng-400 ng的含有100%野生型KRAS序列的人基因组DNA的12个重复(箭头)和范围为50 ng-400 ng的含1% G12D突变体KRAS序列的人基因组DNA的12个重复(箭)中在存在UDG的情况下进行的G12D突变体KRAS检测的实时PCR图。X轴表示PCR循环数和y轴表示相对荧光单位。图3D是在3C中进行的实验的MaxRatio分析。X轴表示循环数(类似于Ct)和y轴表示MaxRatio。每个重复单独作图。
应理解，附图不一定依比例绘制，图中的对象在彼此的关系上也不一定依比例绘制。附图是意图清楚理解本文所公开的装置、系统和方法的各种实施方案的描述。只要可能的话，相同的参照数字在整个附图中用于指相同或类似的部分。此外，应理解，附图不意图以任何方式限制本发明教导的范围。
详述
本文提供涉及核酸的酶修饰的技术，和特别但不限于涉及使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶以使由于胞嘧啶残基的脱氨作用导致的DNA序列的错误最小化或消除所述错误的方法和组合物。
本文所用的各部分标题仅为组织的目的和不应解释为以任何方式限制所述的主题。
在该各种实施方案的详述中，为解释说明的目的，阐述了许多具体细节以提供对所公开的实施方案的全面理解。然而，本领域技术人员将理解，这些各种实施方案可用或不用这些具体细节来实施。在其它实例中，结构和装置以框图的形式显示。此外，本领域技术人员可容易理解，其中提出和进行方法的具体顺序是说明性的，和预期顺序可改变并仍保持在本文公开的各种实施方案的精神和范围内。
本申请中引用的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文和互联网页，通过引用以其整体明确结合用于任何目的。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本文描述的各种实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。当所结合的参考文献中的术语的定义显得不同于本发明教导所提供的定义时，应以本发明的教导提供的定义为准。
定义
为便于理解本发明的技术，下文定义的许多术语和短语。其它定义在详述全文中阐述。
在说明书和权利要求书全文中，以下术语采取本文明确相关的含义，除非上下文清楚地另外指明。本文使用的短语“在一个实施方案中”不必然是指相同的实施方案，尽管它可以如此。此外，本文使用的短语“在另一个实施方案中”不必然是指不同的实施方案，尽管它可以如此。因此，如下文所述，在未脱离本发明的范围或精神的情况下，本发明的各种实施方案可容易地组合。
此外，如本文所用，术语“或”是包括性的“或”操作符，和等同于术语“和/或”，除非上下文另外清楚指明。术语“基于”不是排他性的，和允许基于未描述的其它因素，除非上下文另外清楚指明。此外，在说明书全文中，“一个”、“一种”和“该”的含义包括复数所指物。“在…中”的含义包括“在…中”和“在…上”。
如本文所用，术语“核酸分子”是指包含任何核酸的分子，包括但不限于DNA或RNA。该术语包括包含DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列，所述类似物包括但不限于4-乙酰基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基l-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基-氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假-尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D甘露糖基辫苷(beta-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
如本文所用，“损坏的核酸”包括例如包含脱氨的碱基(例如脱氨的胞嘧啶)的DNA或包含尿嘧啶碱基的DNA。
如本文所用，术语“核碱基”与在本领域中使用的其它术语同义，包括“核苷酸”、“脱氧核苷酸”、“核苷酸残基”、“脱氧核苷酸残基”、“核苷酸三磷酸(NTP)”或脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如本文所用，核碱基包括天然和修饰的残基，如本文所述。
众所周知，DNA (脱氧核糖核酸)是由4种类型的核苷酸A (腺嘌呤)、T (胸腺嘧啶)、C (胞嘧啶)和G (鸟嘌呤)组成的核苷酸链；RNA (核糖核酸)包含4种类型的核苷酸A、U (尿嘧啶)、G和C。还已知，所有这些5种类型的核苷酸以称为互补碱基配对的组合特异性彼此结合。即，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)配对(然而，在RNA的情况下腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对)，胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)配对，使得这些碱基对中的每个形成双链。在一些实例中，一个或多个核苷酸通过如下符号提及：R (G或A)、Y (T/U或C)、M (A或C)、K (G或T/U)、S (G或C)、W (A或T/U)、B (G或C或T/U)、D (A或G或T/U)、H (A或C或T/U)、V (A或G或C)或N (A或G或C或T/U)、空位(-)。
术语“蛋白”和“多肽”是指包含通过肽键连接的氨基酸的化合物，并且可互换使用。本文如下使用常规的一字母和三字母氨基酸代码——丙氨酸：Ala，A；精氨酸：Arg，R；天冬酰胺：Asn，N；天冬氨酸：Asp，D；半胱氨酸：Cys，C；谷氨酸：Glu，E；谷氨酰胺：Gln，Q；甘氨酸：Gly，G；组氨酸：His，H；异亮氨酸：Ile，I；亮氨酸：Leu，L；赖氨酸：Lys，K；甲硫氨酸：Met，M；苯丙氨酸：Phe，F；脯氨酸：Pro，P；丝氨酸：Ser，S；苏氨酸：Thr，T；色氨酸：Trp，W；酪氨酸：Tyr，Y；缬氨酸：Val，V。如本文所用，代码Xaa和X是指任何氨基酸。
“寡核苷酸”是指包括至少两个核酸单体单位(例如核苷酸)、通常超过三个单体单位和更通常超过十个单体单位的核酸。寡核苷酸的准确大小通常依赖于各种因素，包括寡核苷酸的最终的功能或用途。为进一步说明，寡核苷酸通常少于200个残基长(例如15-100个)，然而如本文所用，该术语还意图包括更长的多核苷酸链。寡核苷酸经常通过它们的长度提及。例如24个残基的寡核苷酸称为“24聚体”。通常，核苷单体通过磷酸二酯键或其类似物连接，所述类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)、氨基磷酸酯等，包括关联的抗衡离子，例如H+、NH4 +、Na+等，如果这样的抗衡离子存在的话。此外，寡核苷酸通常是单链的。寡核苷酸任选通过任何合适的方法制备，包括但不限于分离已有或天然序列，DNA复制或扩增，逆转录，克隆和限制性消化合适的序列，或通过方法例如Narang等(1979) Meth Enzymol. 68:90-99的磷酸三酯方法；Brown等(1979) Meth Enzymol. 68:109-151的磷酸二酯方法；Beaucage等(1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺方法；Matteucci等(1981) J Am Chem Soc 103:3185-3191的三酯方法；自动化合成方法；或1984年7月3日授权给Caruthers等的题目为“PROCESS FOR PREPARING POLYNUCLEOTIDES”的美国专利号4,458,066的固相支持物方法，或本领域技术人员已知的其它方法直接化学合成。所有这些参考文献通过引用予以结合。
生物聚合物(例如核酸)的“序列”是指生物聚合物中的单体单位(例如核苷酸等)的顺序和身份。核酸的序列(例如碱基序列)通常以5'至3'方向阅读。
术语“基因”是指包含产生RNA或多肽或其前体(例如前胰岛素)所必需的编码序列的核酸(例如DNA或RNA)序列。功能性多肽可通过全长编码序列编码，或通过编码序列的任何部分编码，只要保留多肽的所需活性或功能特性(例如酶活性、配体结合、信号转导等)。术语“部分”当时涉及基因使用时，是指该基因的片段。片段大小范围可为几个核苷酸至减去一个核苷酸的整个基因序列。因此，“包含基因的至少一部分的核苷酸”可包含基因的片段或整个基因。
术语“基因”还包括结构基因的编码区，和包括位于5′和3′末端两端的邻近编码区的序列，在任一末端的距离为约1 kb，使得基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5′并存在于mRNA中的序列被称为5′非翻译序列。位于编码区的3′或下游并存在于mRNA中的序列被称为3′非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆包含间断有称为“内含子”或“间插区”或“介入间插序列”的非编码序列的编码区。内含子是转录成核RNA (hnRNA)的基因区段；内含子可包含调控元件例如增强子。内含子从核或原始转录物除去或“剪接出”；因此内含子不存在于信使RNA (mRNA)转录物。翻译期间mRNA起规定新生多肽的氨基酸的序列或顺序的功能。
除了包含内含子，基因的基因组形式可还包括位于序列的5′和3′末端两端的序列，其存在于RNA转录物中。这些序列被称为“侧翼”序列或区(这些侧翼序列位于存在于mRNA转录物中的非翻译序列的5′或3′)。5′侧翼区可包含调控序列例如启动子和增强子，其控制或影响基因的转录。3′侧翼区可包含指导转录的终止、转录后切割和多腺苷酸化的序列。
术语“目的核苷酸序列”或“目的核酸序列”或“靶标”或“靶核酸”是指任何核苷酸序列(例如RNA或DNA)，其操作可被本领域普通技术人员认为出于任何原因(例如治疗疾病、赋予改进的质量等)是合乎需要的。这样的核苷酸序列包括但不限于结构基因的编码序列(例如报告基因、选择标记基因、癌基因、药物抗性基因、生长因子等)和不编码mRNA或蛋白产物的非编码调控序列(例如，启动子序列、多腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列等)。
如本文所用，术语“引物”是指以下寡核苷酸(无论是作为纯化的限制性消化物天然存在的还是合成产生的)，当置于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下(例如在核苷酸和诱导剂例如生物催化剂(例如DNA聚合酶等)的存在下和在合适的温度和pH下)时，其能够用作合成的起始点。对于扩增的最大效率，引物通常是单链的，但可备选为双链的。如果是双链的，则引物通常首先经处理以分开其链，然后用于制备延伸产物。在一些实施方案中，引物是寡聚脱氧核糖核苷酸。引物足够长，以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的准确长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。
如本文所用，术语“扩增子”是指使用本文所述的扩增方法产生的核酸。扩增子通常是双链的DNA；然而扩增子可以是RNA和/或DNA:RNA杂交物。在一些实施方案中，扩增子包含与靶RNA、DNA或cDNA互补的DNA。在一些实施方案中，引物对经配置以从靶核酸产生扩增子。在某些实施方案中，在使用引物扩增靶区域后，得到的具有引物序列的扩增子用于产生检测、鉴定或以其它方式分析来自试验样品的核酸的信号。
在核酸的情况下，术语“扩增”是指产生多拷贝的多核苷酸或多核苷酸的一部分，通常自少量的多核苷酸(例如单个多核苷酸分子)开始，其中所述扩增产物或扩增子通常是可检出的。多核苷酸的扩增包括各种化学和酶过程。在聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)期间自一个或几个拷贝的靶或模板DNA分子产生多个DNA拷贝是扩增的形式。扩增不限于严格复制起始分子。例如，使用逆转录(RT)-PCR自样品中有限量的RNA产生多个cDNA分子是扩增的形式。此外，在转录过程期间自单个DNA分子产生多个RNA分子也是扩增的形式。
如本文所用，术语“互补的”或“互补性”用于提及通过碱基配对规则相关的多核苷酸(例如核苷酸的序列)。例如，序列5'-A-G-T-3'与序列3'-T-C-A-5'互补。互补性可以是“部分的”，其中核酸的碱基中的仅一些根据碱基配对规则而匹配。或者，在核酸之间可存在“全部”或“完全”互补性。在核酸链之间的互补性的程度对在核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及依赖于其的检测方法中具有特别的重要性。
术语“野生型”当涉及基因提及时，是指具有分离自天然存在的来源的基因的特性的基因。术语“野生型”当涉及基因产物(例如多肽)提及时，是指具有分离自天然存在的来源的基因产物的特性的基因产物。应用于物体的术语“天然存在的”是指物体可在自然界中找到。例如，存在于可分离自天然来源和未在实验室中经人工有意修饰的生物(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。野生型基因通常是在群体中最经常观察到的基因，因此其任意称为基因的“正常”或“野生型”形式。相反的是，术语“修饰的”或“突变体”当涉及基因或基因产物提及时，分别是指当与野生型基因或基因产物比较时显示序列和/或功能性质的修饰(例如，改变的特性)的基因或基因产物。要注意，可分离天然存在的突变体；这些通过以下事实鉴定：当与野生型基因或基因产物比较时，它们具有改变的特性。
术语“等位基因”是指基因的不同变异；这些变异包括但不限于变体和突变体、多态性基因座和单核苷酸多态性(SNP)基因座、移码和剪接突变。等位基因可天然存在于群体中，或其可在群体的任何特定个体的寿命期间产生。
因此，术语“变体”和“突变体”当用于提及核苷酸序列时，是指与另一核酸序列(通常相关的核酸序列)差别一个或多个核苷酸的核酸序列。“变异”是两个不同的核苷酸序列之间的差异；通常一个序列是参比序列。
术语“变体”和“突变体”当用于提及多肽时，是指与另一多肽(通常相关的多肽)差别一个或多个氨基酸的氨基酸序列(“置换”一个氨基酸为另一个)。
用于描述核酸或蛋白的变体的命名法规定了突变的类型和碱基或氨基酸变化。对于核苷酸置换(例如76A>T)，数字是从5′末端开始核苷酸的位置，第一个字母表示野生型核苷酸，和第二个字母表示替换野生型的核苷酸。在给定的实例中，在第76位的腺嘌呤被替换为胸腺嘧啶。如果有必要区分在基因组DNA、线粒体DNA、互补DNA (cDNA)和RNA中的突变，则使用简单约定。例如，如果核苷酸序列的第100个碱基从G突变为C，如果突变发生在基因组DNA则其将写为g.100G>C；如果突变发生在线粒体DNA则其将写为m.100G>C；如果突变发生在cDNA则其将写为c.100G>C；或如果突变发生在RNA则其将写为r.100g>c。
对于氨基酸置换(例如D111E)，第一个字母是野生型氨基酸的一字母代码，数字是从N-端的氨基酸的位置，和第二个字母是突变中存在的氨基酸的一字母代码。无意突变用X表示为第二个氨基酸(例如D111X)。对于氨基酸缺失(例如ΔF508、F508del)，希腊字母Δ (delta)或字母“del”表示缺失。该字母是指野生型中存在的氨基酸，和数字是其中野生型中存在它的氨基酸从N端的位置。内含子突变指定为内含子编号或cDNA位置，和提供自GT剪接供体位点的G开始的正数或自AG剪接受体位点的G开始的负数。g.3′ +7G>C表示在基因组DNA水平上在nt +7处的G至C置换。当全长基因组序列是已知的时，突变最好通过基因组参比序列的核苷酸编号表示。参见den Dunnen & Antonarakis, “Mutation nomenclature extensions and suggestions to describe complex mutations: a discussion”. Human Mutation 15: 7–12 (2000); Ogino S,等, “Standard Mutation Nomenclature in Molecular Diagnostics: Practical and Educational Challenges”, J. Mol. Diagn. 9(1): 1–6 (2007年2月)。
如本文所用，氨基酸的一字母代码是指标准IUB命名法，其描述于“IUPAC-IUB Nomenclature of Amino Acids and Peptides”，公布于Biochem. J., 1984, 219, 345-373; Eur. J. Biochem., 1984, 138, 9-37; 1985, 152, 1; Internat. J. Pept. Prot. Res., 1984, 24, 84页之后; J. Biol. Chem., 1985, 260, 14-42; Pure Appl. Chem., 1984, 56, 595-624; Amino Acid s and Peptides, 1985, 16, 387-410;和Biochemical Nomenclature and Related Documents, 第2版, Portland Press, 1992, 第39-67页。
如本文所用，“脱碱基位点”是指自发地或由于DNA损坏所致既没有嘌呤碱基也没有嘧啶碱基的DNA的位置。脱碱基位点亦称为脱嘌呤/脱嘧啶或AP位点。脱碱基位点可通过自发脱嘌呤形成，但也作为碱基切除修复中的中间体存在。在该过程中，DNA糖基化酶(例如UDG)识别损坏的碱基和切割N-糖苷键以释放碱基，留下AP位点。
术语“检测测定法”是指用于检测在特定基因的给定等位基因中的野生型或变体核酸序列(例如突变或多态性)的存在或不存在、或用于检测特定蛋白的存在或不存在或特定蛋白的活性或作用、或用于检测特定蛋白的变体的存在或不存在的测定法。
术语“检测”是指测定样品中一个或多个靶标(例如扩增子、SNP等)的存在的行为。
术语“样品”以其最广含义使用。在一个含义中，它可指动物细胞或组织。在另一含义中，它意指包括获自任何来源的样本或培养物，以及生物学和环境样品。生物学样品可获自植物或动物(包括人)和包括流体、固体、组织和气体。环境样品包括环境物质例如表面物质、土壤、水和工业样品。这些实例不应解释为限制可适用于本发明的样品类型。
如本文所用，“UDG”是尿嘧啶-DNA糖基化酶，亦称为尿嘧啶-DNA N-糖基化酶。尿嘧啶-DNA N-糖基化酶通过切割在尿嘧啶碱基和糖骨架之间的N-糖苷键从DNA切除尿嘧啶。该切割产生脱碱基位点，其阻断DNA聚合酶的复制，或阻止形成杂交位点。双链DNA和单链DNA是尿嘧啶-DNA N-糖基化酶的底物。在一些生物中，编码尿嘧啶-DNA N-糖基化酶的基因被称为“UNG”基因。
如本文所用，用于提及酶(例如尿嘧啶-DNA N-糖基化酶)的术语“热-稳定的”或“热稳定的”，表示酶在升高的温度下具有功能或活性(例如，可在DNA中切割尿嘧啶碱基和糖骨架之间的N-糖苷键)，所述升高的温度例如高于45℃，优选高于50℃，更优选高于55℃，更优选高于60℃，甚至更优选高于65℃，最优选高于70℃，最优选高于75℃，最优选高于80℃，最优选高于85℃，最优选高于90℃和甚至最优选高于95℃。在一些实施方案中，尿嘧啶-DNA N-糖基化酶在上述温度之一下显示最佳活性，例如，酶的最佳温度是上述温度之一。尿嘧啶-DNA N-糖基化酶的温度稳定性可通过配制包含尿嘧啶-DNA N-糖基化酶的组合物(例如通过与稳定化学品混合)或通过酶的固定或通过化学修饰例如交联在一定程度上增加，以保持酶处于其活性三维形状。
如本文所用，“热-稳定的”或“热稳定的”酶在升高的温度下和/或在最佳活性的温度下，在至少15分钟，优选至少2小时，更优选至少16小时，更优选至少24小时，更优选至少7天，更优选至少10天，甚至更优选至少14天，最优选至少30天，甚至最优选至少50天后保持活性。一般而言，使用测量尿嘧啶从双链的含尿嘧啶的DNA中的释放的测定法测量活性水平，例如通过测量或监测[3H]-尿嘧啶从DNA中的释放。例如，热稳定的尿嘧啶-DNA N-糖基化酶的活性“单位”的定义是每分钟催化从双链的含尿嘧啶的DNA中释放60 pmol的尿嘧啶的热稳定的尿嘧啶-DNA N-糖基化酶的量，例如在含0.2 µg DNA的50 µl反应物(例如以104–105 cpm/µg)中在30分钟内在65℃下。活性可与在温度升高之前的酶活性比较，从而获得热处理后酶的残余活性或酶保持的活性。优选地，在给定时间后在升高的温度下残余活性为至少30%，更优选至少40%，更优选至少50%，更优选至少60%，甚至更优选至少70%，最优选至少80%，甚至最优选残余活性为至少90%，绝对最优选在给定时间后在升高的温度下残余活性的水平为至少相等或未变化。因此，提供“1 U”或“1单位”的酶是指提供下列量的酶(与伴随酶的任何其它组分例如缓冲液、甘油等组合)，所述量的酶：例如在含0.2 µg DNA的50 µl反应物(例如以104–105 cpm/µg)中在30分钟内在65℃下，每分钟从双链的含尿嘧啶的DNA中催化释放60 pmol的尿嘧啶；或例如如果将其添加至含0.2 µg DNA的50 µl反应物(例如以104–105 cpm/µg)和在65℃孵育30分钟，每分钟从双链的含尿嘧啶的DNA中催化释放60 pmol的尿嘧啶的酶，无论是否添加酶至含0.2 µg DNA的50 µl反应物(例如以104–105 cpm/µg)和在65℃孵育30分钟。
如本文所用，术语“活性的”或“活性”当涉及UDG时意指UDG以某种生理学相关和可检出水平切割在DNA中尿嘧啶碱基和糖骨架之间的N-糖苷键。
所述技术的实施方案
所述技术的实施方案涉及用于处理包含核酸的样品的方法，其中样品被加热至例如40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、95℃、97℃或更高，例如达2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟或更长。具体而言，所述技术涉及加入尿嘧啶-DNA N-糖基化酶至这样的样品以最小化或消除由在加热期间胞嘧啶的热脱氨作用引起的序列错误的随后检测。
其中包含核酸的样品加热至这些温度的一个常见实例是使用“热启动PCR”以最小化引物与模板的非特异性相互作用和在环境温度下嗜热聚合酶具有的显著活性(例如AmpliTaq Gold™ DNA聚合酶；参见例如美国专利号5,773,258; 6,183,998)。这些方法使用热稳定的聚合酶，通常为Taq DNA聚合酶，其在接近环境温度(室温)的温度下无活性，但在更高的温度下具有活性。具体而言，热稳定的聚合酶经化学交联以灭活酶。交联剂的性质和在这些方法中形成的化学键是可逆的，交联的热稳定的聚合酶通过在反应前在95℃加热聚合酶预定的时间量而再活化。其它热启动PCR酶通过在低温下结合和抑制聚合酶但在较高温度下自活性酶释放的抗体或核酸适体灭活。在一些方面，本文提供的技术涉及热活化的聚合酶在PCR中的用途和热稳定的UDG在样品中的用途，所述用途用于使在高温孵育期间由胞嘧啶的脱氨作用导致的序列错误的产生和检测最小化。
因此，在一些实施方案中，所述技术包括使用UDG，其在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、95℃或97℃或更高下，在暴露于所述温度达2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟或60分钟或更长期间或之后具有活性。在一些实施方案中，UDG是分离自嗜热生物例如古细菌或细菌的嗜热成员的酶。在一些实施方案中，UDG是包含氨基酸置换的嗜温UDG的变异体，所述氨基酸置换赋予相对于野生型UDG更高的热稳定性。在一些实施方案中，UDG通过随机突变、合理建模和设计或体外进化产生。所述技术预期使用热稳定的UDG，而不管其来源如何。
在一些实施方案中，在添加聚合酶和聚合酶的高温孵育(例如使其活化)之前，UDG存在于包含核酸的样品中。包含UDG和核酸的样品在UDG有活性的温度(例如65℃)下孵育以从核酸中除去U碱基，所述U碱基在高温活化聚合酶之前可能存在。在一些实施方案中，在高温孵育以活化聚合酶期间，UDG存在于包含核酸和聚合酶的样品中。
所述技术涉及在扩增DNA之前从DNA中除去U碱基。该切割产生脱碱基位点，其从DNA聚合酶的复制中阻断。结果，聚合酶不复制损坏的DNA链，和在PCR扩增期间在扩增子群体中C至U突变未得到扩增。尽管本文公开内容提及某些说明性的实施方案，但应理解这些实施方案以实例的方式而不以限制的方式呈现。提供实验性的实施例以描述所述技术的示例性的实施方案.
所述技术的一些实施方案包含组合物、方法、用途、试剂盒和系统，其涉及在核酸中在脱碱基位点处产生缺口的酶或酶活性，所述脱碱基位点为例如通过从DNA中除去尿嘧啶的酶产生的脱碱基位点。在一些实施方案中，在核酸中在脱碱基位点处引起缺口的酶是热稳定的酶。在一些实施方案中，酶是在脱碱基位点上切割DNA的核酸内切酶，例如来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的热稳定的脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶，例如Tth Endo IV，例如由New England Biolabs提供。这样的酶在脱碱基位点处在损伤的第一个磷酸二酯键5′水解DNA，在5′端上留下3′羟基和脱氧核糖5′-磷酸。一些酶还具有3′-二酯酶活性。此外，在一些实施方案中，N-糖基化酶和切割活性两者由单一酶提供。例如，在一些实施方案中，酶是大肠杆菌核酸内切酶III (Nth)的同源物。在一些实施方案中，酶是热稳定的。该酶同时具有N-糖基化酶和裂解酶(切割)活性。N-糖基化酶活性从DNA中释放损坏的嘧啶(例如脱氨的胞嘧啶)，产生脱碱基位点；然后，裂解酶活性切割得到的脱碱基位点以在核酸链中产生缺口。所述酶也识别和切割并非由于其N-糖基化酶活性产生的脱碱基位点(例如，通过从DNA中除去尿嘧啶的酶例如UDG产生的脱碱基位点)。在一些实施方案中，所述酶分离自嗜热生物例如海栖热袍菌(Thermotoga maritima) ，例如由New England Biolabs提供的Tma核酸内切酶III。
实施例
KRAS中的突变的鉴定
在本文提供的所述技术的实施方案的开发期间，进行实验以测试热稳定的UDG酶，以减少在通过PCR检测KRAS突变体中的错误的发生率。KRAS中的突变与人类癌症有关，因此KRAS是许多癌症诊断的靶标。具体而言，一些癌症与在KRAS的12或13位上引入氨基酸置换的突变有关，所述位置是在野生型KRAS基因序列中由密码子GGT和GGC编码的甘氨酸残基。自KRAS基因的突变产生的普遍置换包括在KRAS基因中在35位的野生型G突变为A (c.35G>A)，其导致在KRAS蛋白中12位的野生型甘氨酸置换成天冬氨酸(p.G12D)；在KRAS基因中38位的野生型G突变成A (c.38G>A)，其导致在KRAS蛋白中13位的野生型甘氨酸置换成天冬氨酸(p.G13D)；在KRAS基因中34位的野生型G突变成A (c.34G>A)，其导致在KRAS蛋白中12位的野生型甘氨酸置换成丝氨酸(p.G12S)；和在KRAS基因中37位的野生型G突变成A (c.37G>A)，其导致在KRAS蛋白中13位的野生型甘氨酸置换成丝氨酸(p.G13S)。其它突变和置换是已知的；实验集中在检测G12D、G13D、G12S和G13S。
因此，这些突变由于在编码链中G至A突变或由于在非编码链中C至T突变而发生。尽管C至T突变天然发生和可能存在于样品中，但它们也通过在KRAS编码序列中34、35、37或38位的G对面的C残基的热脱氨作用自野生型样品产生。因此，热脱氨作用产生突变体KRAS序列存在于野生型样品中的假阳性结果。这样的结果可导致假癌症诊断。
因此，进行实验以检验以下假设：在仅含有野生型靶标的样品中，C至U的热诱导的脱氨作用产生单一拷贝的G至A的KRAS突变体基因序列。在野生型样品中自这些单一拷贝产生的突变体扩增子通过G13D等位基因特异性探针检测，因此在野生型样品中产生与G13D突变体样品产生的信号相当的信号。四个主要观察结果支持该假设：
1)野生型样品中假阳性的发生率与输入拷贝数成比例。例如，一系列的24个样品(各自包含6000个拷贝的野生型序列)，对于KRAS突变产生大约10/24个样品检验假阳性，而对于突变体KRAS序列，使用在各样品中包含600个拷贝的野生型序列的样品的相同的实验产生大约1/24个孔检验假阳性。该假阳性发生的比率与在95℃胞嘧啶脱氨作用的公布的比率(Lindahl和Nyberg，同上)一致；
2)在实时PCR中检出假阳性的Ct与对于从单一拷贝的扩增所预期的一致；
3)对于突变体KRAS检验假阳性的样品DNA测序鉴定突变体序列；和
4)与包含DNA靶标的样品分开(使得靶标不在95℃下孵育)的Taq聚合酶的活化极大地降低假阳性的发生率。
根据这些数据，进行实验以在改进测定特异性/灵敏度方面检验热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶(UDG)。
实验使用PCR以扩增包含来自包含野生型KRAS序列或突变体KRAS序列的输入模板DNA的G12和G13密码子的KRAS基因的区域。然后，对突变体序列具有特异性的标记的探针用于检测在扩增样品中突变体序列的存在情况。
实验使用实时PCR和MaxRatio分析，如描述于Shain和Clements (2008), “A new method for robust quantitative and qualitative analysis of real-time PCR” Nucl. Acids Res. 36: e91，通过引用结合到本文中。在图1-3的子图A和C中所示的实时PCR线图中，x-轴表示PCR循环数和y-轴表示相对荧光单位。在图1-3的子图B和D所示的MaxRatio分析线图中，x-轴表示循环数(类似于Ct)和y-轴表示MaxRatio。每个实验的每个重复单独在图中绘出。用100%野生型KRAS序列的实验用箭头表示，和用1%突变体KRAS序列的实验用箭表示。
在第一个实验中，对于G12D突变体序列的存在情况，5 ng的含有100%野生型KRAS序列的人基因组DNA的42个重复和5 ng的含有1% G12D突变体KRAS序列的人基因组DNA的6个重复通过实时PCR使用G12D特异性探针测定。在不存在UDG的情况下(图1A；1B)和在存在2单位的UDG的情况下(图1C；1D)进行实验。
在第二个实验中，对于G13D突变体序列的存在情况，5 ng的含有100%野生型KRAS序列的人基因组DNA的42个重复和5 ng的含有1% G13D突变体KRAS序列的人基因组DNA的6个重复通过实时PCR使用G13D特异性探针测定。在不存在UDG的情况下(图2A；2B)和在存在2单位的UDG的情况下(图2C；2D)进行实验。
在第三个实验中，对于G12D突变体序列的存在情况，范围为50 ng至400 ng的含有100%野生型KRAS序列的人基因组DNA的12个重复和范围为50 ng至400 ng的含有1% G12D突变体KRAS序列的人基因组DNA的12个重复通过实时PCR使用G12D特异性探针测定。在不存在UDG的情况下(图3A；3B)和在存在2单位的UDG的情况下(图3C；3D)进行实验。
实验使用热稳定的UDG，例如来自New England Biolabs的Afu尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)，其是分离自Archaeglobus fulgidis的大肠杆菌尿嘧啶-DNA糖基化酶的热稳定的同源物。加入50%甘油的量至没有UDG的样品，其等同于加入至向其中加入含UDG酶的甘油的样品中的甘油的量。热循环条件是：1个循环的93.5℃ 10分钟；1个循环的73.5℃ 10分钟；3个循环的92.0℃ 15秒，73.5℃ 30秒和61.0℃ 60秒；接着45个循环的92℃ 15秒和61℃ 90秒。
实验证实，热稳定的UDG (例如2单位的热稳定的UDG)降低假阳性的发生率和延缓的确发生的假阳性事件的Ct。为进一步检验UDG活性，在各种条件下评价UDG以评估在存在热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶的情况下检测KRAS野生型和突变体序列的特异性和/或灵敏度是否改进。
在本文提供的所述技术的实施方案的开发期间采集的数据证实，假阳性的发生率通过在测定样品中包括UDG而得到极大地降低。这些数据证实，在样品中包括热稳定的UDG提高测定结果。这些数据证实，消除或最小化了假阳性；在相当更高的Ct值下检出假阳性，从而提供提高的测定特异性。
上文说明书中提及的所有出版物和专利通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的。在不背离所述技术的范围和精神的情况下，所述技术的组合物、方法和用途的各种修饰和改变对本领域技术人员将是显而易见的。尽管已结合具体的示例性的实施方案描述了所述技术，但应理解，所要求保护的本发明不应过度限制于这样的具体实施方案。事实上，药理学、生物化学、医药科学或相关领域的技术人员显而易见的所述实施本发明的方式的各种修饰，意图落入随附权利要求的范围内。

Claims (60)

1. 组合物，包括包含靶序列的靶核酸、聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶和包含尿嘧啶碱基的损坏的核酸。
2. 权利要求1的组合物，其中所述尿嘧啶-DNA糖基化酶是热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶。
3. 权利要求1的组合物，其还包含对靶序列特异性的探针。
4. 权利要求1的组合物，其中所述聚合酶是热活化的聚合酶。
5. 权利要求1的组合物，其还包括包含靶序列的扩增子。
6. 权利要求1的组合物，其中所述靶序列包含单核苷酸多态性。
7. 权利要求1的组合物，其中所述靶序列包含胞嘧啶或鸟嘌呤。
8. 权利要求1的组合物，其包含至少0.1-1.0单位的尿嘧啶-DNA糖基化酶。
9. 权利要求1的组合物，其包含在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后足以以下列速率从DNA中除去尿嘧啶的量或浓度的尿嘧啶-DNA糖基化酶，所述速率为在热活化的聚合酶的热活化期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去碱基的速率的至少30%。
10. 权利要求1的组合物，其包含在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后足以从损坏的核酸中除去尿嘧啶的量或浓度的尿嘧啶-DNA糖基化酶。
11. 组合物，其包括包含靶序列的靶核酸、聚合酶、从DNA中除去尿嘧啶和在脱碱基位点上切割DNA的酶和包含尿嘧啶碱基的损坏的核酸。
12. 组合物，其包括包含靶序列的靶核酸、聚合酶、从DNA中除去尿嘧啶的酶、在脱碱基位点上切割DNA的酶和包含尿嘧啶碱基的损坏的核酸。
13. 用于检测核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)包含热活化的聚合酶的第一容器；和
b)包含热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶的第二容器。
14. 用于检测核酸的试剂盒，所述试剂盒包括包含热活化的聚合酶和热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶的容器。
15. 权利要求13或14中任一项的试剂盒，其还包括对照核酸。
16. 用于检测核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)包含热活化的聚合酶的第一容器；和
b)包含从DNA中除去尿嘧啶的酶的第二容器。
17. 用于检测核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)包含热活化的聚合酶的第一容器；和
b)包含从DNA中除去尿嘧啶和在脱碱基位点上切割DNA的酶的第二容器。
18. 用于检测核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)包含热活化的聚合酶的第一容器；
b)包含从DNA中除去尿嘧啶的酶的第二容器；
c)包含在脱碱基位点上切割DNA的酶的第三容器。
19. 用于检测核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)包含热活化的聚合酶的第一容器；和
b)包含从DNA中除去尿嘧啶的酶和在脱碱基位点上切割DNA的酶的第二容器。
20. 用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的样品；
b)加入至少0.1-1.0单位的尿嘧啶-DNA糖基化酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，尿嘧啶-DNA糖基化酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和
e)检测包含靶序列的扩增子。
21. 权利要求20的方法，其中所述尿嘧啶-DNA糖基化酶是热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶。
22. 权利要求20的方法，其中所述反应混合物包含聚合酶，和所述方法还包括将反应混合物暴露于使聚合酶活化的温度。
23. 权利要求20的方法，包含在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后足以以下列速率从DNA中除去尿嘧啶的量或浓度的尿嘧啶-DNA糖基化酶，所述速率为在热活化的聚合酶的热活化期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去碱基的速率的至少30%。
24. 权利要求20的方法，其中所述损坏的核酸未扩增和/或未检出。
25. 权利要求20的方法，其中所述损坏的核酸扩增少于靶核酸。
26. 权利要求20的方法，其中所述检测包括使用标记的探针。
27. 权利要求20的方法，其中所述聚合酶是热活化的聚合酶。
28. 权利要求20的方法，其中所述损坏的核酸存在和包含尿嘧啶碱基。
29. 权利要求20的方法，其中所述损坏的核酸存在和包含脱氨的胞嘧啶。
30. 权利要求20的方法，其中所述靶序列是单核苷酸多态性。
31. 权利要求20的方法，其中所述靶序列包含胞嘧啶或鸟嘌呤。
32. 用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包含：
a)提供包含靶核酸的样品；
b)加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和
e)检测包含靶序列的扩增子。
33. 权利要求32的方法，其中所述酶还在脱碱基位点上切割DNA。
34. 权利要求32的方法，其还提供在脱碱基位点上切割DNA的酶。
35. 用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的样品；
b)加入至少0.1-1.0单位的尿嘧啶-DNA糖基化酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将尿嘧啶-DNA糖基化酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，尿嘧啶-DNA糖基化酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和
e)使扩增子与对靶序列特异性的核酸探针接触，
其中如果探针与靶序列杂交，则检出靶核酸。
36. 权利要求35的方法，其中所述尿嘧啶-DNA糖基化酶是热稳定的尿嘧啶-DNA糖基化酶。
37. 权利要求35的方法，其中所述反应混合物包含聚合酶，和所述方法还包括将反应混合物暴露于使聚合酶活化的温度。
38. 权利要求35的方法，包括在热活化的聚合酶的热活化期期间和/或之后足以以下列速率从DNA中除去尿嘧啶的量或浓度的尿嘧啶-DNA糖基化酶，所述速率为在热活化的聚合酶的热活化期之前尿嘧啶-DNA糖基化酶除去碱基的速率的至少30%。
39. 权利要求35的方法，其中所述损坏的核酸未扩增和/或未检出。
40. 权利要求35的方法，其中所述损坏的核酸扩增少于靶核酸。
41. 权利要求35的方法，其中所述检测包括使用标记的探针。
42. 权利要求35的方法，其中所述聚合酶是热活化的聚合酶。
43. 权利要求35的方法，其中所述损坏的核酸存在和包含尿嘧啶碱基。
44. 权利要求35的方法，其中所述损坏的核酸存在和包含脱氨的胞嘧啶。
45. 权利要求35的方法，其中所述靶序列是单核苷酸多态性。
46. 权利要求35的方法，其中所述靶序列包含胞嘧啶或鸟嘌呤。
47. 用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的样品；
b)加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和
e)使扩增子与对靶序列特异性的核酸探针接触，
其中如果探针与靶序列杂交，则检出靶核酸。
48. 权利要求47的方法，其中所述酶还在脱碱基位点上切割DNA。
49. 权利要求47的方法，还提供在脱碱基位点上切割DNA的酶。
50. 用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的样品；
b)加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和
e)将扩增子测序，以检测扩增子的核酸序列，
其中当扩增子的核酸序列包含靶序列时，检出靶核酸。
51. 用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的样品；
b)加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和
e)通过质谱法探询扩增子，以检测扩增子的化学组成，
其中当扩增子的化学组成与靶序列的化学组成匹配时，检出靶核酸。
52. 用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的样品；
b)加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和
e)使扩增子与限制性核酸内切酶接触，以产生限制性图谱，
其中当扩增子的限制性图谱与靶序列的限制性图谱匹配时，检出靶核酸。
53. 用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的样品；
b)加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和
e)使扩增子与瓣状核酸内切酶接触，
其中当瓣状核酸内切酶切割产物检出时，检出靶核酸。
54. 用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的样品；
b)加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和
e)使扩增子与引物延伸测定法的引物、核苷酸和聚合酶接触，
其中当聚合酶将核苷酸添加至引物上时，检出靶核酸。
55. 用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的样品；
b)加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和
e)使扩增子与第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和连接酶接触，
其中当连接酶连接第一和第二寡核苷酸时，检出靶核酸。
56. 用于检测包含靶序列的靶核酸的方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的样品；
b)加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子；和
e)检测扩增子的物理性质，
其中当扩增子的物理性质与靶序列的物理性质匹配时，检出靶核酸。
57. 用于使包含靶序列的扩增子的序列错误最小化的扩增方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的样品，所述靶核酸包含靶序列；
b)加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；和
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子，
其中相对于在缺少至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶的情况下产生的扩增子，所述扩增子包含更少的自胞嘧啶的脱氨作用产生的序列错误。
58. 用于使包含靶序列的扩增子的序列错误最小化的扩增方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的样品，所述靶核酸包含靶序列；
b)加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；和
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子，
其中通过与样品中的靶核酸的靶序列比对或比较测定的扩增子的靶序列中的错配的第一数量小于通过与样品中的靶核酸的靶序列比对或比较测定的在缺少从DNA中除去尿嘧啶的酶的情况下产生的扩增子的靶序列中的错配的第二数量。
59. 用于使包含靶序列的扩增子的序列错误最小化的扩增方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的样品，所述靶核酸包含靶序列；
b)加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；然后
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子，
其中相对于在缺少至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶的情况下产生的扩增子，所述扩增子包含更少的自胞嘧啶的脱氨作用产生的序列错误。
60. 用于使包含靶序列的扩增子的序列错误最小化的扩增方法，所述方法包括：
a)提供包含靶核酸的样品，所述靶核酸包含靶序列；
b)加入至少0.1-1.0单位的从DNA中除去尿嘧啶的酶和样品的一部分至反应混合物；
c)将酶暴露于其中如果损坏的核酸存在的话，酶从损坏的核酸切除尿嘧啶碱基的条件；然后
d)热循环反应混合物，以产生包含靶序列的扩增子，
其中通过与样品中的靶核酸的靶序列比对或比较测定的扩增子的靶序列中的错配的第一数量小于通过与样品中的靶核酸的靶序列比对或比较测定的在缺少从DNA中除去尿嘧啶的酶的情况下产生的扩增子的靶序列中的错配的第二数量。
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