CN105377238A - 治疗关节炎的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了治疗关节炎的方法，其包括给药包含以下各物的组合的持续释放组合物：(a)包含一种磷脂或多种磷脂的混合物及胆固醇的脂质体；及(b)治疗剂，诸如水溶性类固醇。所述持续释放组合物可经关节内给药。

Description

治疗关节炎的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年7月5日提交的美国申请第61/668,446号及2013年3月15日提交的美国申请第61/791,650号的权益，这些申请的全部公开内容均援引加入本文中。

背景技术

骨关节炎(OA)为最常见类型的关节炎且为造成失能的主要原因。其为非炎性退行性关节病，特征为关节软骨渐进性损失、软骨下骨硬化、骨赘形成、滑膜变化及滑液体积增加(伴随粘度降低和由此所致的润滑特性改变)。

类风湿性关节炎(RA)为病因不明的慢性全身性炎性疾病。遗传、环境、激素、免疫及感染因素均可起到重要作用。此病状的标志特征为影响手及足的持久对称的多关节炎，不过任何由滑膜内衬的关节均可被累及。这归因于炎症细胞在滑膜衬里中的累积及增殖(称为滑膜炎)。器官(诸如皮肤、心脏、肺及眼)的关节外累及可能是显著的。

关节内(IA)药物注射为有吸引力的用于治疗关节炎(包括OA及RA)的治疗方法。认为市场上的各种类固醇及透明质酸制剂是有效的，但它们需要频繁的IA注射且仅提供短期的症状缓解。其他需要大孔针进行IA注射的晶体悬浮液制剂不适于治疗小的关节且可产生晶体诱发的滑膜炎。可用的全身性治疗亦具有缺点，最显著地为副作用。

考虑到以上概述的不足，需要用于治疗关节炎的方法，其IA注射不太频繁和/或较长期地缓解疼痛。本文公开的方法满足此需要以及其他重要需要。

发明内容

本文所用的术语“本发明(invention、theinvention、thisinvention及thepresentinvention)”意欲泛指本专利申请及随附权利要求的所有主题。含有该术语的陈述应被理解为不限制本文所述的主题或不限制随附专利权利要求的含义或范围。本发明内容为本发明的各个方面的高阶概述，且引入一些将在以下详细说明部分进一步描述的概念。本发明内容既不欲确认所要求保护的主题的关键或基本特征，亦不欲独立用于确定所要求保护的主题的范围。所述主题应通过参考整个说明书的适当部分、任何或所有附图及每一项权利要求来理解。

本发明涉及治疗关节炎的方法，其包括向需要这种治疗的个体关节内注射持续释放组合物，藉此减轻所述个体中的关节炎症状。本发明对于治疗类风湿性关节炎特别有用。

本发明的持续释放组合物包含脂质体，所述脂质体包含：(a)一种磷脂或多种磷脂的混合物，及胆固醇；及(b)治疗剂或其药学上可接受的盐，其中所述脂质体处于水性悬浮液中。所述持续释放组合物可通过将脂质混合物(lipidcake)与治疗剂混合来制备。

附图说明

图1为显示4组大鼠在各组各自经受生理盐水、游离地塞米松磷酸钠(DSP)或持续释放组合物的单次IA注射后的体重变化的线图。

图2为显示4组大鼠在各组各自经受生理盐水、游离DSP或持续释放组合物的单次IA注射后的临床目测关节炎评分变化的线图。

图3为显示4组大鼠在各组各自经受生理盐水、游离DSP或持续释放组合物的单次IA注射后的右踝体积变化的线图。

图4为显示4组大鼠在各组各自经受生理盐水、游离DSP或持续释放组合物的单次IA注射后的左踝体积变化的线图。

图5为显示3组大鼠在游离DSP或持续释放组合物的四次每日一次(daily)IA注射后的体重变化的线图。

图6为显示3组大鼠在各组各自经受游离DSP或持续释放组合物的四次每日一次IA注射后的临床目测关节炎评分变化的线图。

图7为显示3组大鼠在各组各自经受游离DSP或持续释放组合物的四次每日一次IA注射后的右踝体积变化的线图。

图8为显示3组大鼠在各组各自经受游离DSP或持续释放组合物的四次每日一次IA注射后的左踝体积变化的线图。

图9为显示3组大鼠在游离吲哚美辛或吲哚美辛持续释放组合物的五次每日一次IA注射后的体重变化(图a)及临床关节炎评分变化(图b)的线图。第一个箭头(第19日)指示第一次吲哚美辛每日一次IA给药，且第二个箭头(第23日)指示最后一次吲哚美辛每日一次IA给药。

图10为显示3组大鼠在游离依那西普或依那西普持续释放组合物的两次IA注射后的体重变化(图a)及临床关节炎评分变化(图b)的线图。第一个箭头(第23日)指示第一次依那西普IA给药，且第二个箭头(第26日)指示第二次依那西普IA给药。

图11为显示3组大鼠在游离甲氨蝶呤或甲氨蝶呤持续释放组合物的两次IA注射后的体重变化(图a)及临床关节炎评分变化(图b)的线图。第一个箭头(第23日)指示第一次甲氨蝶呤IA给药，且第二个箭头(第26日)指示第二次甲氨蝶呤IA给药。

发明的详细说明

如本文所公开，发现向个体IA给药有效量的本文描述的持续释放组合物可有利地减轻所述个体的关节炎的体征和/或症状。亦发现本文公开的关节炎治疗可需要较不频繁的IA注射(与先前已知的治疗相比)。亦发现本文公开的关节炎治疗比先前已知的治疗更长期地缓解疼痛。这些发现在本文描述的用于治疗关节炎的方法、组合物及药物中以及在用于治疗关节炎的组合物的用途中有所体现。

定义

如上文以及在整个公开内容中所使用，除非另外有所指明，以下术语应被理解为具有以下含义。

除非上下文另外清楚地指明，如本文所用，单数形式“一(a/an)”及“所述”包括复数的引述。

如本文所用，术语“脂质体(liposome/liposomes)”及相关术语包括多囊泡脂质体(MVL)、多层囊泡(MLV)或者小或大的单层囊泡(ULV)。脂质体为纳米尺寸的且包含形成粒子的组分及载运药剂的组分。所述形成粒子的组分形成封闭的脂质屏障，其基本上不含诸如三酸甘油酯的中性脂质。在某些实施方案中，所述形成粒子的组分中存在少于约0.1％的中性脂质。在其他实施方案中，所述形成粒子的组分中无中性脂质。所述载运药剂的组分包含大量水性介质，其基本上不含诸如三酸甘油酯的中性脂质、非水相(油相)、水-油乳液或含有非水相的其他混合物。

如本文所用，术语“有效量”系指持续释放组合物足以减轻关节炎的症状和/或体征(诸如疼痛及关节强直)的剂量。

如本文所用，术语“治疗(treating或treatment)”或“被治疗的(treated)”包括预防性(例如防治性)、缓解性及治愈性的方法、用途或结果。术语“治疗(treatment或treatments)”亦可指组合物，诸如药物组合物，或者药物。

在本申请中，治疗意指减轻或延缓关节炎的一或多种影响或症状的方法。治疗亦可指减轻基础病因而非仅仅症状的方法。治疗可为任何减轻且可以为，但不限于：关节炎、关节炎的体征或症状的完全消除。治疗可包括如通过已知技术所检测的关节炎的完全好转。存在用来检测关节炎及其症状的本领域中公认的方法。它们包括，但不限于：例如放射检查、关节吸引术、血液测试(例如检测类风湿因子或抗CCP测试)或MRI。举例而言，若个体的关节炎的一或多种症状与治疗之前的所述个体或对照个体相比减轻约10％，则认为所公开的方法为一种治疗。因此，所述减轻可为约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或其间的任何减轻量。

如本文所用，预防(prevent、preventing或prevention)意指阻止、延缓、防止、避免、预先阻止、终止或阻碍关节炎发作、发生、严重性或复发的方法。举例而言，若易患关节炎的个体与易患关节炎且未接受本文公开的治疗的对照个体相比，关节炎的发作、发生、严重性或复发或关节炎的一或多种症状(例如疼痛、僵硬、发热、关节炎症或关节触痛)减轻或延缓，则认为所公开的方法为一种预防。若易患关节炎的个体在接受本文公开的治疗后与所述个体在接受治疗之前的进展相比，关节炎的发作、发生、严重性或复发或关节炎的一或多种症状减轻或延缓，则亦认为所公开的方法为一种预防。因此，关节炎的发作、发生、严重性或复发的减轻或延缓可为约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或其间的任何减轻量。

术语“个体”可指患有关节炎的脊椎动物或被认为需要关节炎治疗的脊椎动物。个体包括温血动物，诸如哺乳动物，诸如灵长类动物，且更优选为人类。非人类灵长类动物亦为个体。术语个体包括家养动物(诸如猫、狗等)、家畜(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)及实验动物(例如小鼠、兔、大鼠、沙鼠、天竺鼠等)。因此，本文涵盖兽医学用途及医药制剂。术语“关节炎”系指涉及一或多个关节的炎症的关节病症或病状。如本文所用，术语“关节炎”涵盖多种类型及亚型的各种已知或未知病源及病因的关节炎，包括，但不限于：类风湿性关节炎、骨关节炎、感染性关节炎、银屑病关节炎、痛风性关节炎及狼疮相关的关节炎。

脂质混合物

用于本文描述的关节炎治疗的脂质混合物含有块状、薄膜或粉末形式的固体脂质混合物(lipidmixture)。

在某些实施方案中，磷脂及胆固醇，或者多种磷脂的混合物及胆固醇在进一步加工成脂质混合物之前预先形成脂质体。

在某些实施方案中，磷脂及胆固醇，或者多种磷脂的混合物及胆固醇在进一步加工成脂质混合物之前不预先形成脂质体。

脂质混合物可由多种能够形成或掺入单层或双层结构中的脂质制备而得。本文提供的脂质混合物包含一或多种磷脂及胆固醇，其基本上不含诸如三酸甘油酯的中性脂质。磷脂的实例包括，但不限于：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、卵磷脂酰甘油(EPG)、卵磷脂酰乙醇胺(EPE)、卵磷脂酰丝氨酸(EPS)、卵磷脂酸(EPA)、卵磷脂酰肌醇(EPI)、大豆磷脂酰胆碱(SPC)、大豆磷脂酰甘油(SPG)、大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)、大豆磷脂酰丝氨酸(SPS)、大豆磷脂酸(SPA)、大豆磷脂酰肌醇(SPI)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)、十六烷基磷酸胆碱(HEPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、棕榈酰基硬脂酰基磷脂酰甘油(PSPG)、单油酰基磷脂酰乙醇胺(MOPE)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(POPC)、聚乙二醇二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二棕榈酰基磷脂酸(DPPA)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酸(DOPA)、二肉豆蔻酰基磷脂酸(DMPA)、二硬脂酰基磷脂酸(DSPA)、二棕榈酰基磷脂酰肌醇(DPPI)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰肌醇(DOPI)、二肉豆蔻酰基磷脂酰肌醇(DMPI)、二硬脂酰基磷脂酰肌醇(DSPI)。脂质可为一或多种上述脂质的混合物，或者为一或多种上述脂质与一或多种上文未列出的其他脂质的混合物。

在一个例示性实施方案中，脂质混合物包含诸如DOPC或DOPG的两种磷脂的混合物。在另一个实施方案中，脂质混合物包含选自DOPC、POPC、SPC、EPC、PEG-DSPE及DOPG的磷脂与胆固醇的混合物。在另一个实施方案中，脂质混合物包含第一磷脂与第二磷脂的混合物，所述第一磷脂为DOPC、POPC、SPC或EPC，且所述第二磷脂为PEG-DSPE或DOPG。脂质混合物的各种例示性组合物在美国申请第12/538,435号中有所公开，该申请的教导全文援引加入本文中。

在一个例示性实施方案中，脂质混合物包含摩尔比为约(29.5％至90％):(3％至37.5％):(10％至33％)的DOPC、DOPG及胆固醇。在另一个实施方案中，DOPC:DOPG:胆固醇的比率为以摩尔百分比计约(56.25-72.5):(7.5-18.75):(20-25)。举例而言但非限制性地，DOPC:DOPG:胆固醇的比率可为约67.5:7.5:25。在另一个实施方案中，脂质混合物(lipidcakemixture)包含相对于脂质混合物约12摩尔％至小于约30摩尔％的胆固醇。在另一个实施方案中，脂质混合物包含相对于脂质混合物约15摩尔％至约29摩尔％的胆固醇。在又一个实施方案中，脂质混合物包含相对于脂质混合物约17.5摩尔％至约28摩尔％的胆固醇。

在另一个实施方案中，形成粒子的组分不含脂肪酸或阳离子脂质(亦即在生理pH下带净正电荷的脂质)。

在另一个实施方案中，形成粒子的组分包含其中高度水合的柔性中性聚合物的长链附接于磷脂分子的亲水性聚合物。不受任何理论束缚，据信所述亲水性聚合物使脂质体稳定且导致更长的体内循环时间。亲水性聚合物的实例包括，但不限于：分子量为约2,000至约5,000道尔顿的聚乙二醇(PEG)、甲氧基PEG(mPEG)、神经节苷脂GM₁、聚唾液酸(polysialicacid)、聚乳酸(亦称为聚丙交酯(polylactide))、聚乙醇酸(亦称为聚乙醇酸交酯)、聚乳酸聚乙醇酸(apolylacticpolyglycolicacid)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲噁唑啉(polymethoxazoline)、聚乙基噁唑啉、聚羟乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚天冬酰胺、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙烯基甲基醚、聚丙烯酸羟乙酯、衍生化纤维素(derivatizedcelluloses)(诸如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素)及合成聚合物。

形成粒子的组分可进一步包含抗体或肽的脂质缀合物，所述抗体或肽作为靶向部分起作用而使脂质体能够特异性地结合至具有靶分子的靶细胞。靶分子的实例包括，但不限于：表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGF)、癌胚抗原(CEA)及erbB-2/neu(HER2)。

用于本文描述的关节炎治疗中的脂质体可通过用于制备囊泡的常规技术产生。这些技术包括：醚注射法(Deamer等人,Acad.Sci.(1978)308:250)、表面活性剂法(Brunner等人,Biochim.Biophys.Acta(1976)455:322)、冻融法(Pick等人,Arch.Biochim.Biophys.(1981)212:186)、反相蒸发法(Szoka等人,Biochim.Biophys.Acta.(1980)601:55971)、超声波处理法(Huang等人,Biochemistry(1969)8:344)、乙醇注射法(Kremer等人,Biochemistry(1977)16:3932)、挤出法(Hope等人,Biochim.Biophys.Acta(1985)812:5565)、法式压碎机法(Frenchpressmethod)(Barenholz等人,FEBSLett.(1979)99:210)及Szoka,F.,Jr.等人,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)中所详述的方法。上文阐述的所有参考文献均描述用于形成脂质体囊泡的方法及常规技术，且这些方法的描述援引加入本文中。

在例示性实施方案中，治疗剂封装在脂质体的载运药剂的组分中，其中所述载运药剂的组分包含大量水性介质，基本上不含中性脂质(诸如三酸甘油酯)、非水相(油相)、水-油乳液或含有非水相的其他混合物。包含大量水性介质的载运药剂的组分提供治疗剂在关节中的较久的治疗功效及延长的释放特征(releaseprofile)。相比之下，封装在包含大量非水介质(例如大豆油介质)的载运药剂的组分中的治疗剂具有更快的释放特征及较短的治疗功效(Bias等人,Sustained-ReleaseDexamethasonePalmitate-PharmacokineticsandEfficacyinPatientswithActivatedInflammatoryOsteoarthritisoftheKnee.ClinDrugInvest2001；21(6):429-436)。

在某些实施方案中，脂质混合物包含一或多种未预先形成脂质体的脂质。所述脂质混合物可通过将所述脂质溶解于适合的有机溶剂(包括，但不限于：乙醇、甲醇、叔丁醇、乙醚及氯仿)中且通过加热、真空蒸发、氮气蒸发、冷冻干燥或其他溶剂移除的常规方法而干燥来制备。

杀菌后，将脂质溶液与治疗剂混合并冻干以形成粉末或块状物。一般地，添加至少一种冷冻保护剂及至少一种缓冲剂以有效地冻干类固醇-脂质混合物。

冷冻保护剂包括，但不限于：甘露糖醇、甘油、右旋糖、蔗糖和/或海藻糖。一种例示性冷冻保护剂为甘露糖醇。

缓冲剂包括，但不限于：二水合磷酸二氢钠及无水磷酸氢二钠。

下文描述脂质混合物制备的一些实例以例示脂质混合物的制备方法，因为它们与本发明有关。

治疗剂

治疗剂可为类固醇溶液、非甾体消炎药(NSAID)(诸如吲哚美辛)、改善病情的抗风湿药(DMARD)或上述中两种或更多种的组合，以及上述中一或多种与本文中未特定列出的其他成分或化合物的组合。DMARD包括小分子药剂，诸如甲氨蝶呤、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、环磷酰胺、硫唑嘌呤、环孢菌素A、d-青霉胺、抗疟药(例如羟氯喹)。DMARD亦包括生物物质，诸如肿瘤坏死因子a(TNF-a)拮抗剂(例如依那西普，商品名称Enbrel，可商购自WyethPharmaceuticals,Inc.,Collegeville,USA；阿达木单抗，商品名称HUMIRA，可商购自AbbottLaboratories,AbbottPark,Illinois,USA)、白介素-1受体拮抗剂、白介素-6受体拮抗剂、抗CD20单克隆抗体、CTLA-4-Ig、RGD肽等等。

在例示性实施方案中，治疗剂为基本上水溶性类固醇溶液，诸如DSP。在另一个例示性实施方案中，治疗剂为基本上水溶性NSAID，诸如吲哚美辛的药学上可接受的盐。在又一个例示性实施方案中，治疗剂为基本上水溶性DMARD，诸如甲氨蝶呤的药学上可接受的盐或TNF-a拮抗剂。在又一个例示性实施方案中，治疗剂不共价结合于磷脂或脂肪酸，诸如棕榈酸酯。

一或多种治疗剂可与药学上可接受的赋形剂及适于药物制剂(其包括用于人类及动物用途的制剂以及用于研究、实验及相关用途的制剂)的其他成分组合。在一些实施方案中，使用柠檬酸盐缓冲液，优选为柠檬酸钠。在其他实施方案中，使用螯合剂，优选为EDTA。

水溶性类固醇包括任何天然存在的类固醇激素、合成类固醇及其衍生物。水溶性类固醇包括，但不限于：可的松、氢化可的松、泼尼松龙、甲泼尼龙、泼尼松、地塞米松磷酸钠(DSP)、氢化可的松-17-戊酸酯、氟可的松、氟氢可的松、帕拉米松及依普利酮。在一个实例中，但非限制性地，水溶性类固醇为DSP。举例而言，约2mg/mL至约100mg/mL的DSP溶液可用于复原脂质混合物。

水溶性类固醇的药学上可接受的盐包括由无毒的无机或有机碱形成的无毒盐。举例而言，无毒盐可用诸如碱金属或碱土金属(例如钾、钠、锂、钙或镁)氢氧化物的无机碱或用诸如胺等的有机碱形成。

水溶性类固醇的药学上可接受的盐亦包括由无毒的无机或有机酸形成的无毒盐。有机及无机酸的实例为盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、丁二酸、柠檬酸、乳酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、棕榈酸、胆酸、双羟萘酸、粘酸、D-谷氨酸、戊二酸、乙醇酸、邻苯二甲酸、酒石酸、月桂酸、硬脂酸、水杨酸、山梨酸、苯甲酸等等。

持续释放组合物

在本文描述的关节炎治疗中采用的持续释放组合物基本上不含晶体悬浮液。在一个例示性实施方案中，持续释放组合物中存在少于0.1％的晶体悬浮液。在另一个实施方案中，持续释放组合物中不存在晶体悬浮液。本文所述的持续释放组合物包含脂质体，其中所述脂质体包含一种磷脂或多种磷脂的混合物、胆固醇及一或多种治疗剂，并且其中所述脂质体处于水性悬浮液中。持续释放组合物可通过用包含一或多种治疗剂的水溶液复原包含一或多种磷脂及胆固醇的冻干脂质混合物以形成水性悬浮液来制备。持续释放组合物亦可通过用水溶液复原一或多种治疗剂与包含一或多种磷脂及胆固醇的脂质混合物的冻干组合以形成水性悬浮液来制备。在一些例示性实施方案中，脂质混合物基本上由一或多种磷脂及胆固醇作为脂质组分组成。用于复原的合适的水溶液或水性介质包括，但不限于：缓冲液、蒸馏水、盐水、糖溶液(例如蔗糖溶液)等等。在其他例示性实施方案中，脂质混合物基本上由磷脂酰胆碱脂质、磷脂酰甘油脂质及胆固醇组成。在其他例示性实施方案中，脂质混合物(除磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油及胆固醇脂质之外)可含有防腐剂、冷冻保护剂或其组合。本文进一步提供的是包含脂质体的持续释放组合物，其中所述脂质体包含一种磷脂或多种磷脂的混合物、胆固醇及TNF-α拮抗剂(例如依那西普或阿达木单抗)，且其中所述脂质体处于水性悬浮液中。本文亦涵盖冻干形式的此组合物。

在一些实施方案中，所述持续释放组合物进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂、媒介物、载体、用于活性成分的介质、防腐剂、冷冻保护剂或其组合。

在一实施方案中，本发明的持续释放组合物通过制备脂质混合物并用治疗剂复原之以形成水性悬浮液来制备。

在另一个实施方案中，本发明的持续释放组合物通过在制备脂质混合物期间将治疗剂添加在脂质混合物中，接着将所述脂质混合物和所述治疗剂的组合与一或多种冷冻保护剂一起冻干以形成粉末来制备。

在一例示性实施方案中，持续释放组合物包含效能相当于约2mg剂量至约8mg剂量地塞米松的水溶性类固醇。举例而言，持续释放组合物中4mgDSP的效能相当于3mg地塞米松的效能。持续释放组合物中10mgDSP的效能相当于7.6mg地塞米松的效能。类似地，40mg醋酸甲泼尼龙的效能相当于7.5mg地塞米松的效能。

本文描述的持续释放组合物可用于治疗罹患关节炎(诸如类风湿性关节炎)的个体。

在一个实施方案中，持续释放组合物中约50％至约95％的治疗剂呈非缔合形式(亦即约5％至约50％的治疗剂呈缔合形式)。在另一个实施方案中，持续释放组合物中约60％-90％的治疗剂呈非缔合形式。术语“呈非缔合形式的治疗剂”系指经由凝胶过滤可与持续释放组合物的磷脂/胆固醇部分分离的治疗分子。

在另一个实施方案中，组合的磷脂及胆固醇与治疗剂的重量比为约(5-80):约1。在另一个实施方案中，组合的磷脂及胆固醇与治疗剂的重量比为(5-40):1。举例而言，组合的磷脂及胆固醇与治疗剂的重量比为约(5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80):约1。

治疗关节炎的方法

本发明涉及治疗个体的关节炎的方法，所述方法包括向有此需要的个体给药有效量的如本文所描述的持续释放组合物，藉此减轻所述个体的关节炎的症状和/或体征。

配制持续释放组合物以适于IA、肌内或皮下给药。关节内注射包括以下步骤：1)确认待治疗关节的适当注射部位并作记号；2)使用无菌技术将注射部位杀菌并任选地提供局部麻醉药；3)在注射部位将针插入关节间隙中。针插入可任选地在超声波引导下进行。吸出少量滑液以证实针尖在关节间隙内。4)将药物注入关节间隙中。

本发明的持续释放组合物的剂量可由本领域技术人员根据实施方案确定。单位剂型或多个剂型均被涵盖，它们各自在某些临床配置下提供优点。根据本发明，所给药的持续释放组合物的实际量可根据待治疗的个体的年龄、体重、状况、关节类型而改变且取决于医学专业人员的判断。

用于IA注射的DSP的剂量取决于患者状况及关节大小。在一例示性实施方案中，DPS的剂量为每次IA注射约0.2mg至约6mg。在另一个例示性实施方案中，对于大的关节(诸如膝关节)，DPS的剂量为每次IA注射约2mg至约4mg。在又一个例示性实施方案中，对于小的关节(诸如指(趾)间关节)，DPS的剂量为每次IA注射约0.8mg至约1mg。

在一例示性实施方案中，每次IA注射吲哚美辛的剂量为约5mg至约30mg。在另一个例示性实施方案中，每次IA注射吲哚美辛的剂量为约10mg至约25mg。在又一个例示性实施方案中，每次IA注射吲哚美辛的剂量为约15mg至约20mg。

在一例示性实施方案中，每次IA注射甲氨蝶呤的剂量为约1mg至约15mg。在另一个例示性实施方案中，每次IA注射甲氨蝶呤的剂量为约5mg至约12.5mg。在又一个例示性实施方案中，每次IA注射甲氨蝶呤的剂量为约7.5mg至约10mg。

IA注射的频率在每日一次、每三至五日一次、每周一次(weekly)或每两至三周一次内变动。

以下实施例将用于进一步例示本发明，然而同时不对本发明构成任何限制。相反地，应清楚地了解，在阅读本文的描述后，本领域技术人员可想到，对于各种实施方案，在不悖离本发明的精神的情况下可采用其修改及等效物。除非另有说明，在以下实施例中描述的研究期间，遵循常规程序。出于例示性目的，下文描述一些程序。

本文引用的出版物及它们所引用的材料均全文具体援引加入。已描述了多个实施方案。但是会理解，可以做出各种改变。因此，其他实施方案在随附的权利要求书的范围内。

实施例

实施例1：脂质混合物的制备

通过溶剂注射法制备脂质混合物。包括DOPC、DOPG及胆固醇的脂质以67.5:7.5:25的摩尔比组合并在烧瓶中在约40℃下溶解于99.9％的乙醇中。使用桌上型超声波浴进行脂质溶解。

通过蠕动泵以100mL/min将溶解的脂质溶液添加至1.0mM磷酸钠溶液中，并混合两种溶液。接着使脂质混合物通过孔径为0.2μm的聚碳酸酯膜6-10次。形成脂质体(或大的多层囊泡(MLV))且平均囊泡直径为约120-140nm(由MalvernZetaSizerNanoZS-90(MalvernInstrumentsLtd,Worcestershire,UK)测量)。

通过具有MilliporePellicon2MiniUltrafiltrationModuleBiomax-100C(0.1m²)(MilliporeCorporation,Billerica,MA,USA)的切向流动过滤系统透析及浓缩脂质体混合物，并接着使用0.2μm无菌过滤器杀菌。

通过磷分析法定量经过滤的脂质体混合物的脂质浓度，并用冷冻保护剂2％甘露糖醇调配脂质体混合物，接着再次使用0.2μm无菌过滤器杀菌。接着将经杀菌的脂质体混合物无菌填充至小瓶中进行冷冻干燥。

实施例2：DSP持续释放组合物的制备

通过将实施例1中描述的脂质体混合物与包含DSP(13.2mg/ml)及柠檬酸钠(4mg/ml)的DSP溶液混合，接着冷冻干燥来制备持续释放组合物。

将经冻干的DSP-脂质体块状物用300μl生理盐水复原，其中DSP的浓度为6.6mg/ml。将经冻干的DSP-脂质体块状物进一步用生理盐水稀释以形成如表1中所示的持续释放组合物，其中在持续释放组合物1中DSP的浓度为1mg/ml且在持续释放组合物2中为1.4mg/ml。

表1.持续释放组合物的组成

持续释放组合物1(mg/ml)

实施例3.用于治疗关节炎的持续释放组合物的单次注射

使用路易斯大鼠(Lewisrat)对持续释放组合物对关节炎的作用进行体内评估。研究中使用16只8周龄雌性大鼠。大鼠的平均体重为约180克至约200克。

为诱发关节炎，在第0日用200μg在弗氏不完全佐剂(可商购自SigmaChemicalCo.,USA)中乳化的牛II型胶原(4mg/ml，储备于10mM乙酸中，可商购自ElastinProducts,Owensville,USA)对各大鼠进行免疫接种，并接着在第7日再次进行。第16日为观察到关节炎症状的第一日并被定义为诱发性关节炎的发作。

实验研究中的所有大鼠在此研究期间始终自由地取用饮用水及食物。

将大鼠随机分成以下4个研究组：

第1组：4只大鼠各自每爪接受100μl生理盐水(图1-8中标记为“生理盐水对照”)。

第2组：4只大鼠各自每爪接受100μl游离DSP，其中DSP的浓度为1mg/ml(图1-8中标记为“游离DSP_1mg/ml”)。

第3组：4只大鼠各自每爪接受100μl持续释放组合物1，其中DSP的浓度为1mg/ml(图1-4中标记为“TLC399_1mg/ml”且图5-8中标记为“TLC399_I1mg/ml”)。

第4组：4只大鼠各自每爪接受100μl持续释放组合物2，其中DSP的浓度为1.4mg/ml(图1-4中标记为“TLC399_1.4mg/mg”且图5-8中标记为“TLC399_II1.4mg/ml”)。

将对照或DSP制剂给药至大鼠两个后爪，仅在第19日IA注射一次。给药至各爪的DSP剂量概述于表2中。

表2.持续释放组合物的特征

在14日研究期内，针对以下结果，一周检查大鼠3次：

·体重减轻，其为用于评估关节炎严重程度的参数之一。

·临床目测关节炎评分，其为与关节炎严重程度相关联的目测评分。使用每爪的关节指数将其分级为0至4(0＝足垫上无水肿或红斑；1＝足垫上轻微水肿及红斑；2＝足垫上轻度水肿及红斑；3＝整个足垫及踝上中度水肿及红斑；4＝踝、足及趾上重度水肿及关节强直)。各大鼠的临床目测关节炎评分为两个后爪的关节指数之和，最高分为8。

·后爪体积及肿胀。通过UGOPlethysmometer7149测量系统测量后爪体积。最终体积数据用平均体重标准化(ml/kg)，且水肿定义为测量日相对于第0日的爪体积增加。

结果：

图1显示4组大鼠中的体重变化。在全部4组大鼠中第16日均观察到体重减轻，这与关节炎发作的时间相同。体重减轻自第16日持续至第19日。

第19日IA注射后，与生理盐水及游离DSP组相比，在持续释放组合物1组及持续释放组合物2组中观察到更显著的体重减轻。体重减轻可能由类固醇的已知副作用—食欲缺乏引起。因为DSP以较慢速率自持续释放组合物释放，所以类固醇的副作用(食欲缺乏)持续较久。因此，在接受持续释放组合物的组中观察到更明显的体重减轻。

图2显示4组大鼠中临床目测关节炎评分的变化。在IA注射之前，生理盐水组的平均评分为3.75，游离DSP组及持续释放组合物2组为4.0，且持续释放组合物1组为4.25。

IA注射后24小时，除了生理盐水组外之，所有组的评分均降至1以下。

对于游离DSP组，评分在IA注射48小时后缓慢增加。关节炎症状变得更严重且评分在第26日达到4.5。

持续释放组合物1组及持续释放组合物2组中的大鼠在随后4日未显示关节炎症状，其中第23日及第24日评分为0。在第26日，持续释放组合物1组中的三只大鼠出现轻度关节炎症状，平均评分为1.5，而持续释放组合物2组中无大鼠具有任何复发症状，评分保持为0。在第26日，游离DSP组中的大鼠具有严重的关节炎症状且评分为4.5。在第30日，持续释放组合物1组中的大鼠出现严重关节炎，评分超过4，而持续释放组合物2组中的大鼠具有轻度关节炎，评分为1.5。

参看图3及图4，第19日IA注射后，在第20日，所有4组中爪肿胀体积均下降。生理盐水组中爪肿胀体积的暂时下降可能归因于关节中炎症因子被生理盐水稀释。

对于游离DSP组，IA注射的作用持续3日。在第23日，两个爪均再次肿胀，厚度约7.5ml/kg。

对于持续释放组合物1组，随后4日爪肿胀显著减轻。两个爪均在第25日再次变得肿胀，估算厚度约7.5ml/kg。

对于持续释放组合物2组，随后10日爪肿胀显著减轻。两个爪均在约第34日再次变得肿胀，且右踝厚度超过8ml/kg而左踝为7.5ml/kg。

上述研究支持如下结论：与游离DSP相比，持续释放组合物的单次IA注射对于治疗实验动物的关节炎更有效。

实施例4.用于治疗关节炎的持续释放组合物的多次注射

此研究的设计基本上类似于实施例3中描述的研究的设计，只是(a)无生理盐水对照组；及(b)研究药物通过一日一次IA注射给药，持续4日(第26日至第29日)。

结果：

图5显示3组大鼠(游离DSP组、持续释放组合物1组及持续释放组合物2组)中的体重变化。在全部3组大鼠中第24日均观察到体重减轻，这与关节炎发作的时间相同。

自第26日至第29日的IA注射后，在3个组中观察到更显著的体重减轻。如实施例3中所讨论，体重减轻可能由类固醇的已知副作用—食欲缺乏引起。

图6显示3组大鼠中临床目测关节炎评分的变化。在IA注射之前，平均评分为约4.5至4.7。

对于游离DSP组，评分在第30日降至3，为此研究中的最低记录评分。关节炎体征不久复发且在第33日变得严重。

对于持续释放组合物1组及持续释放组合物2组，在第29日结束治疗后关节炎评分继续下降且保持为零(0)，直至第37日。在持续释放组合物1组中，大鼠在第40日第一次显示复发体征，而在持续释放组合物2组中，大鼠在第42日第一次显示复发体征。

参看图7及图8，在4次的每日一次IA注射后，3组中两个爪的爪肿胀体积均下降。对于游离DSP组，IA注射的作用持续1-2日。在第31日，两个爪均再次肿胀，在第40日达到峰值。

对于持续释放组合物组，随后14日爪肿胀显著减轻。在持续释放组合物1组中，在第40日注意到第一次爪肿胀体征，而在持续释放组合物2组中，在第42日注意到第一次爪肿胀体征。

上述研究支持如下结论：4次的每日一次IA持续释放DPS注射对于治疗实验动物的关节炎是有效的。

实施例5.吲哚美辛持续释放组合物

将吲哚美辛钠(HubeiHengLuYuanTechnologyCo.,Ltd,Hubei,China)用生理盐水溶解，至5mg/ml的最终浓度。将实施例1中描述的冻干脂质体混合物用0.3ml吲哚美辛溶液复原，产生复原体积为每小瓶0.3ml的吲哚美辛持续释放组合物，最终浓度为5mg/mlINN、71mg/mlDOPC、8mg/mlDOPG、13mg/ml胆固醇及50mg/ml甘露糖醇。

实施例6.用于吲哚美辛持续释放组合物实验研究中的胶原诱发的关节炎动物模型

使用18只雌性路易斯大鼠(BioLASCOTaiwanCo,Ltd.,Taiwan)进行吲哚美辛持续释放组合物对关节炎的作用的体内评估。研究设计及大鼠中关节炎的诱发基本上类似于实施例3中的研究。

在第19日出现的临床目测关节炎评分最高时开始关节炎治疗。将18只大鼠随机分成三组(每组6只大鼠)：(1)对照组(无任何治疗，图9中标记为“对照”)；(2)游离吲哚美辛组(每剂2mg/kg吲哚美辛，图9中标记为“吲哚美辛(2mg/kg)”)；及(3)吲哚美辛持续释放组合物组(每剂2mg/kg吲哚美辛；图9中标记为“吲哚美辛-BioSeizer(2mg/kg)”)。自第19日至第23日，对各组中的大鼠给予无治疗(对照组)、在关节炎关节周围每日一次皮下注射游离吲哚美辛或吲哚美辛持续释放组合物。所给药的组合物中吲哚美辛的剂量在表4中列出。

表4.游离吲哚美辛溶液及吲哚美辛持续释放组合物的剂量。

表4

项目	吲哚美辛钠浓度	游离吲哚美辛钠浓度
			游离吲哚美辛溶液	5mg/ml	5mg/ml
吲哚美辛持续释放组合物	4.65mg/ml	3.36mg/ml

此研究中的大鼠自研究开始增加体重，且在第12日达到峰值。随着关节炎体征出现，所有三个大鼠组中体重均下降。如图9b中所示，在第18日，关节炎评分达到其最大值，平均关节炎评分为7.2-7.4。

第19日至第23日，第2组及第3组中关节炎症状减轻。在第2组(游离吲哚美辛组)中，平均关节炎评分自7.4降至5，其中第20日运动机能提高且膝关节灵活性增加。第25日，在吲哚美辛治疗停止后2日，关节炎体征(诸如强直、肿胀及红斑状关节)复发且关节炎评分达到8。

在第3组(吲哚美辛持续释放组合物组)中，平均关节炎评分在第20日自7.6降低至5.8。关节炎评分保持低于7，直至第29日，在治疗停止后治疗功效延长。第3组的关节炎症状在第30日变得严重。

总之，在游离吲哚美辛(第2组)或吲哚美辛持续释放组合物(第3组)的5日治疗期间，两组中关节炎症状均显著地好转。在第2组中撤除游离吲哚美辛后两日关节炎体征恢复，而在第3组中，在治疗停止后关节炎体征好转持续6日。上文概述的研究结果支持如下结论：吲哚美辛持续释放组合物比游离吲哚美辛更长时间地维持吲哚美辛在关节中的功效。

实施例7.依那西普持续释放组合物

将实施例1中描述的冻干脂质体混合物用0.3mlEnbrel(50mg/ml依那西普，可商购自WyethPharmaceuticals,Inc.,Collegeville,USA)复原，产生复原体积为每小瓶0.3ml的依那西普持续释放组合物。依那西普持续释放组合物中脂质及依那西普的最终浓度为：42.8mg/ml依那西普、70.7mg/mlDOPC、8mg/mlDOPG、13mg/ml胆固醇及50mg/ml甘露糖醇。

实施例8.用于依那西普持续释放组合物实验研究中的胶原诱发的关节炎动物模型

使用18只雌性路易斯大鼠(BioLASCOTaiwanCo,Ltd.,Taiwan)进行依那西普持续释放组合物对关节炎的作用的体内评估。研究设计及大鼠中关节炎的诱发基本上类似于实施例3中的研究，只是在第0日、第7日及第17日给药牛II型胶原。

在第23日出现的临床目测关节炎评分最高时开始关节炎治疗。将18只大鼠随机分成三组(每组6只大鼠)：(1)对照组(无任何治疗，图10中标记为“对照”)；(2)游离依那西普组(每剂50mg/kg依那西普，图10中标记为“Enbrel(50mg/kg)”)；及(3)依那西普持续释放组合物组(每剂50mg/kg依那西普；图10中标记为“Enbrel-BioSeizer(50mg/kg)”)。在第23日及第26日，各组中的大鼠接受无治疗或在关节炎关节周围两次皮下注射游离依那西普或依那西普持续释放组合物。所给药的组合物中依那西普的剂量在表5中列出。

表5.游离依那西普溶液及依那西普持续释放组合物的剂量。

表5

项目	依那西普浓度	游离依那西普浓度
			游离依那西普溶液	50mg/ml	50mg/ml
依那西普持续释放组合物	42.8mg/ml	40.3mg/ml

如图10中所示，此研究中的大鼠在II型胶原免疫接种后不久即出现关节炎体征且在第23日达到峰值，其中平均关节炎评分为3.6至3.8。

在治疗期(第23日至第26日)期间，治疗组(第2组及第3组)中关节炎体征减轻。在第2组(游离依那西普组)中，第26日平均关节炎评分降至2.4，但在游离依那西普停止后3日关节炎复发。在第30日，关节炎评分达到4且大鼠由于关节肿胀及强直而变得不动。

在第3组(依那西普持续释放组合物组)中，平均关节炎评分在第26日降低至2.2且保持低于2.5，直至第32日。第3组的关节炎症状在第33日再次变得严重。

总之，在游离依那西普(第2组)或依那西普持续释放组合物(第3组)的4日治疗期间，两组中关节炎症状均显著地好转。在第2组中撤除游离依那西普后三日关节炎体征恢复，而在第3组中，在治疗停止后关节炎体征好转持续5日。上文概述的实验研究结果支持如下结论：依那西普持续释放组合物比游离依那西普更长时间地维持依那西普在关节中的功效。

实施例9.甲氨蝶呤持续释放组合物

将实施例1中描述的冻干脂质体混合物用0.3ml甲氨蝶呤钠(PharmachemieBV,Inc.)复原，产生复原体积为每小瓶0.3ml的甲氨蝶呤持续释放组合物。甲氨蝶呤持续释放组合物中脂质及甲氨蝶呤的最终浓度为：2.5mg/ml甲氨蝶呤、70.7mg/mlDOPC、8mg/mlDOPG、13mg/ml胆固醇及50mg/ml甘露糖醇。

实施例10.用于甲氨蝶呤持续释放组合物实验研究中的胶原诱发的关节炎动物模型

使用18只雌性路易斯大鼠(BioLASCOTaiwanCo,Ltd.,Taiwan)进行甲氨蝶呤持续释放组合物对关节炎的作用的体内评估。研究设计及大鼠中关节炎的诱发基本上类似于实施例3中的研究，只是在第0日、第7日及第17日给药牛II型胶原。

在第23日出现的临床目测关节炎评分最高时开始关节炎治疗。将18只大鼠随机分成三组(每组6只大鼠)：(1)对照组(无任何治疗，图11a中标记为“对照”)；(2)游离甲氨蝶呤组(每剂1mg/kg甲氨蝶呤，图11a中标记为“甲氨蝶呤(1mg/kg)”)；及(3)甲氨蝶呤持续释放组合物组(每剂1mg/kg甲氨蝶呤；图11a中标记为“甲氨蝶呤-BioSeizer(1mg/kg)”)。在第23日及第26日，对各组中的大鼠给予无治疗(对照组)或在关节炎关节周围两次皮下注射游离甲氨蝶呤或甲氨蝶呤持续释放组合物。所给药的组合物中甲氨蝶呤的剂量在表6中列出。

表6.游离甲氨蝶呤溶液及甲氨蝶呤持续释放组合物的剂量。

表6

项目	甲氨蝶呤钠浓度	游离甲氨蝶呤钠浓度
			游离甲氨蝶呤溶液	2.5mg/ml	2.5mg/ml
甲氨蝶呤持续释放组合物	2.3mg/ml	1.8mg/ml

如图11b中所示，此研究中的大鼠在II型胶原免疫接种后不久即出现关节炎体征且在第23日达到峰值，其中平均关节炎评分为3.4至3.8。

第23日至第26日，第2组及第3组中关节炎症状减轻。在第2组(游离甲氨蝶呤组)中，第26日平均关节炎评分自3.7降至1.4。在第30日，甲氨蝶呤治疗停止后4日，大鼠变得活动减退且关节炎评分达到3.5。

在第3组(甲氨蝶呤持续释放组合物组)中，第26日平均关节炎评分自3.4降低至1.6。关节炎评分保持在2左右，直至第35日，且随后增加。

总之，第2组及第3组中甲氨蝶呤治疗使关节炎症状好转。在第2组中撤除游离甲氨蝶呤后4日关节炎体征恢复，而在第3组中，在治疗停止后关节炎体征好转持续9日。上文概述的实验研究结果支持如下结论：甲氨蝶呤持续释放组合物比游离甲氨蝶呤更长时间地维持甲氨蝶呤在关节中的功效。

本文中描述的要素及特征的不同配置及组合为可能的。类似地，一些特征及子组合可用且可在不提到其他特征及子组合下被采用。举例而言，如果公开并讨论了一种方法且讨论了可对所述方法中包括的组合物进行的多种改变，则除非特定地相反指出，所述方法的每种及单个组合及配置以及可能的改变均被特定地涵盖。同样，它们的任何子集或组合亦被特定地涵盖和公开。已描述了本发明的各种实施方案来达到本发明的各种目的。应认识到，这些实施方案仅仅为说明本发明的原理。在不悖离本发明的精神及范围的情况下，其许多修改及更改对本领域技术人员而言将为显而易见的。

Claims (25)

1.治疗关节炎的方法，其包括：

将持续释放组合物经关节内注射至需要关节炎治疗的个体的关节中，所述组合物包含

包含一或多种磷脂、胆固醇的脂质体；及

一或多种治疗剂，其中所述脂质体处于水性悬浮液中。

2.权利要求1的方法，其中所述持续释放组合物通过用包含所述一或多种治疗剂的水溶液复原包含所述一或多种磷脂及所述胆固醇的冻干脂质混合物以形成所述水性悬浮液来制备。

3.权利要求1的方法，其中所述持续释放组合物通过用水溶液复原所述一或多种治疗剂与包含所述一或多种磷脂及所述胆固醇的脂质混合物的冻干组合以形成所述水性悬浮液来制备。

4.权利要求1的方法，其中所述一或多种磷脂选自DOPC、POPC、SPC、EPC、PEG-DSPE及DOPG。

5.权利要求4的方法，其中DOPC:DOPG:胆固醇的摩尔百分比为约67.5％:7.5％:25％。

6.权利要求1的方法，其中所述治疗剂包括水溶性类固醇溶液，所述水溶性类固醇溶液包含有效量的水溶性类固醇或其药学上可接受的盐。

7.权利要求6的方法，其中所述水溶性类固醇为地塞米松磷酸钠。

8.权利要求6的方法，其中所述水溶性类固醇溶液进一步包含缓冲剂。

9.权利要求6的方法，其中所述水溶性类固醇溶液进一步包含螯合剂。

10.权利要求6的方法，其中所述水溶性类固醇溶液具有相当于约2mg剂量至约8mg剂量的地塞米松的效能。

11.权利要求1的方法，其中所述治疗剂包括非甾体抗炎药。

12.权利要求11的方法，其中所述非甾体抗炎药为水溶性非甾体抗炎药。

13.权利要求12的方法，其中所述水溶性非甾体抗炎药为吲哚美辛或其药学上可接受的盐。

14.权利要求13的方法，其中所述吲哚美辛的药学上可接受的盐为吲哚美辛钠。

15.权利要求12的方法，其中水溶性非甾体抗炎药或其药学上可接受的盐的剂量为4.65mg/ml至5mg/ml。

16.权利要求1的方法，其中所述治疗剂包括改善病情的抗风湿药(DMARD)。

17.权利要求16的方法，其中所述DMARD包括TNF-a拮抗剂。

18.权利要求17的方法，其中所述TNF-a拮抗剂为依那西普。

19.权利要求18的方法，其中依那西普的剂量为42.8mg/ml至50mg/ml。

20.权利要求17的方法，其中所述TNF-a拮抗剂为Humira。

21.权利要求16的方法，其中所述DMARD包括甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐。

22.权利要求21的方法，其中所述甲氨蝶呤的药学上可接受的盐为甲氨蝶呤钠。

23.权利要求22的方法，其中甲氨蝶呤或其药学上可接受的盐的剂量为2.3至2.5mg/ml。

24.权利要求1的方法，其中所述治疗剂封装在所述脂质体的水性介质中。

25.权利要求1的方法，其中所述关节炎为类风湿性关节炎。