CN105372355A

CN105372355A - 一种检测调制乳中黄曲霉毒素的前处理方法及使用其的检测方法

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Publication number: CN105372355A
Application number: CN201410408205.3A
Authority: CN
Inventors: 李照; 张雪峰; 崔向云; 徐向峰; 常建军; 宋晓东
Original assignee: Inner Mongolia Mengniu Dairy Group Co Ltd
Current assignee: Inner Mongolia Mengniu Dairy Group Co Ltd
Priority date: 2014-08-19
Filing date: 2014-08-19
Publication date: 2016-03-02

Abstract

本发明提供了一种检测调制乳中黄曲霉毒素的前处理方法。包括：取待测的调制乳样品10克，加入20至30毫升提取液（由乙腈和甲醇按体积比（9-1）:1混合）得到混合液；将混合液振荡，再于4500至6000转/分钟下离心5至10分钟，取离心后的上清液；以及将上清液用黄曲霉毒素总量免疫亲和柱净化。本发明还提供了一种液相色谱质谱联用法检测调制乳中黄曲霉毒素的方法。本发明提供的方法降低了调制乳中的添加剂对检测结果的影响，回收率高。

Description

一种检测调制乳中黄曲霉毒素的前处理方法及使用其的检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测黄曲霉毒素的前处理方法及使用其的检测方法，尤其适用于调制乳中黄曲霉毒素的检测。

背景技术

黄曲霉毒素（AFT）为二氢呋喃香豆素的衍生物，主要是由黄曲霉（aspergillusflavus）寄生曲霉（a.parasiticus）产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率较高。

国标GB5413.37-2010《乳和乳制品中黄曲霉素M1的测定》规定了乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定方法。其中的免疫亲和层析净化，液相色谱-串联质谱法适用于乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定，并公开了对乳、发酵乳、乳粉和粉状婴幼儿配方食品、干酪和奶油测定的步骤。

调制乳是以不低于80%的生牛（羊）乳或复原乳为主要原料，添加其他原料或食品添加剂或营养强化剂，采用适当的杀菌或灭菌工艺制成。

使用现有的方法检测调制乳中的黄曲霉毒素，由于调制乳中食品添加剂的存在，检测过程中会发生提取效果不理想影响净化，或在提取过程中离心导致的待测物的损失，最终影响检测结果。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测调制乳中黄曲霉毒素的前处理方法，其提取及净化效果好，特别适用于调制乳中黄曲霉毒素的检测。

本发明提供了一种调制乳中黄曲霉毒素检测方法，降低了调制乳中的添加剂对检测结果的影响，回收率高。

本发明提供了一种检测调制乳中黄曲霉毒素的前处理方法，包括：取待测的调制乳样品10克，加入20至30毫升提取液，得到混合液，提取液由乙腈和甲醇按体积比（9-1）:1混合而成；将混合液振荡，再于4500至6000转/分钟下离心5至10分钟，取离心后的上清液；以及将上清液用黄曲霉毒素总量免疫亲和柱净化；其中，净化的步骤包括：a、将上清液在40至48℃下旋转蒸发到体积1至5毫升，再加水定容到45至50毫升并混匀，得到待净化水溶液；b、将待净化水溶液过黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，弃去流出液；c、用6至10毫升水淋洗黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，弃去流出液；d、用5至6毫升乙腈洗脱黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，收集洗脱液；以及e、将洗脱液于40至48℃下氮气吹干，再用乙腈水溶液或水溶解，得到待测液；乙腈水溶液中，乙腈的体积百分比含量不超过10%。

本发明还提供了一种液相色谱质谱联用法检测调制乳中黄曲霉毒素的方法，包括：

通过上述的前处理方法对待测的调制乳样品进行前处理；以及使用液相色谱质谱联用法检测经过前处理的调制乳中的黄曲霉毒素。

在一种液相色谱质谱联用法检测调制乳中黄曲霉毒素的方法的示意性实施方式中，所述液相色谱质谱联用法的质谱条件为：电离方式是电喷雾电离、正离子；毛细管电压为3.5kV；锥孔电压为40V；离子源温度为120℃；锥孔反吹气流量为50L/h；脱溶剂气温度为350℃；脱溶剂气流量为500L/h；电子倍增电压为650V；扫描方式为多离子反应监测；黄曲霉毒素M1离子选择参数：母离子312.9，子离子240.7和284.6，碰撞能量是38和22，驻留时间是0.05分钟；以及黄曲霉毒素B1离子选择参数：母离子329.1，子离子259和273，碰撞能量是25和25，驻留时间是0.1分钟；液相色谱质谱联用法的色谱条件为：流动相流动速度：0.3mL/min；色谱柱柱温：40℃；试液温度：20℃；进样体积(V)：10μ

L；流动相：A相，0.1%甲酸溶液；B相，乙腈溶液；梯度洗脱的梯度变化曲线为：

时间	流动相A%	流动相B%	梯度变化曲线
				0 min	68	32	——
4.2 min	55	45	6
				5.0 min	0	100	6
5.7 min	0	100	1
				6.0 min	68	32	6

由于调制乳中经常会含有卡拉胶、瓜尔胶、羧甲基纤维素钠、单硬脂酸甘油酯、六偏磷酸钠、微晶纤维素、结冷胶、麦芽糊精、黄原胶和米粉等添加剂，如果直接使用现有的检测黄曲霉毒素的方法，调制乳中的添加剂会影响前处理过程中的提取效果，从而影响后续免疫亲和柱的净化功能，导致操作稳定性较差，直接影响了最后的回收率和检测结果。

本发明提供的检测调制乳中黄曲霉毒素的前处理方法，提取过程中沉淀效果好、免疫亲和柱的净化功能较好。本发明提供的调制乳中黄曲霉毒素的检测方法，对核桃奶、谷物奶、燕麦奶、古力奶等产品进行检测，其检测结果稳定、回收率较高。

具体实施方式

为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现结合以下实施例说明本发明的具体实施方式。

前处理方法1：检测黄曲霉毒素的前处理方法。

1、取样品10克，加入20毫升提取液，得到混合液，提取液由乙腈和甲醇按体积比9:1混合而成；

2、将混合液振荡2分钟，再于4500转/分钟下离心5分钟，取离心后的上清液；

3、将上清液用黄曲霉毒素总量免疫亲和柱（OasisHLB固相萃取柱，3cc，60mg）净化，包括：

a、将上清液在40℃下旋转蒸发到体积1毫升，再加水定容到45毫升并混匀，得到待净化水溶液；

b、将待净化水溶液过黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，弃去流出液；

c、用6毫升水淋洗黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，弃去流出液；

d、用5毫升乙腈洗脱黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，收集洗脱液；以及

e、将洗脱液于40℃下氮气吹干，再用1mL水溶解，得到待测液。

前处理方法2：检测黄曲霉毒素的前处理方法。

1、取样品10克，加入25毫升提取液，得到混合液，所述提取液由乙腈和甲醇按体积比7:3混合而成；

2、将混合液振荡3分钟，再于5000转/分钟下离心8分钟，取离心后的上清液；

a、将上清液在45℃下旋转蒸发到体积3毫升，再加水定容到48毫升并混匀，得到待净化水溶液；

c、用8毫升水淋洗黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，弃去流出液；

e、将洗脱液于45℃下氮气吹干，再用1mL乙腈水溶液（乙腈的体积百分比为10%）溶解，得到待测液。

前处理方法3：检测黄曲霉毒素的前处理方法。

1、取样品10克，加入30毫升提取液，得到混合液，所述提取液由乙腈和甲醇按体积比1:1混合而成；

2、将混合液振荡5分钟，再于6000转/分钟下离心10分钟，取离心后的上清液；

3、将上清液用黄曲霉毒素总量免疫亲和柱净化（OasisHLB固相萃取柱，6cc，500mg）；其中，净化的步骤包括：

a、将上清液在48℃下旋转蒸发到体积5毫升，再加水定容到50毫升并混匀，得到待净化水溶液；

c、用10毫升水淋洗黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，弃去流出液；

d、用6毫升乙腈洗脱黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，收集洗脱液；以及

e、将洗脱液于48℃下氮气吹干，再用1mL乙腈水溶液（乙腈的体积百分比为10%）溶解，得到待测液。

使用前处理方法1、2和3对待测的调制乳样品进行前处理；使用液相色谱质谱联用法检测经过前处理的调制乳中的黄曲霉毒素，形成检测方法A、B和C。

其中的质谱条件为：电离方式是电喷雾电离、正离子；毛细管电压为3.5kV；锥孔电压为40V；离子源温度为120℃；锥孔反吹气流量为50L/h；脱溶剂气温度为350℃；脱溶剂气流量为500L/h；电子倍增电压为650V；扫描方式为多离子反应监测；黄曲霉毒素M1离子选择参数：母离子312.9，子离子240.7和284.6，碰撞能量是38和22，驻留时间是0.05分钟；以及黄曲霉毒素B1离子选择参数：母离子329.1，子离子259和273，碰撞能量是25和25，驻留时间是0.1分钟。色谱条件为：流动相流动速度：0.3mL/min；色谱柱柱温：40℃；试液温度：20℃；进样体积(V)：10μL；流动相：A相：0.1%甲酸溶液；B相：乙腈溶液；梯度洗脱的梯度变化曲线为：

时间（min）	流动相A%	流动相B%	梯度变化曲线
				0	68	32	——
4.2	55	45	6
				5.0	0	100	6
5.7	0	100	1
				6.0	68	32	6

取黑谷物牛奶样品X，其配方为生牛乳、黑米粉、黑豆粉、黑芝麻粉、白砂糖、饮用水、乳清蛋白粉、精炼植物油、单硬脂酸甘油酯、羧甲基纤维素钠、蔗糖脂肪酸酯、果胶和食用香料。

取核桃早餐奶样品Y，其配方为饮用水、生牛乳、白砂糖、核桃粉、单硬脂酸甘油酯、结冷胶、三聚磷酸盐、卡拉胶、瓜尔胶、聚葡萄糖、维生素A、维生素D、维生素E、维生素B1、维生素B2和食用香精。

取奶特朱古力样品Z，其配方为生牛乳、饮用水、白砂糖、可可粉、微晶纤维素、单硬脂酸甘油酯、六偏磷酸钠、聚葡萄糖、食用香精、膳食纤维和聚葡萄糖。

取早餐调制乳样品W，其配方为生牛乳、饮用水、白砂糖、果蔬粉、卡拉胶、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、三聚磷酸钠和食用香精。

取谷物奶样品V，其配方为鲜牛奶、白砂糖、聚葡萄糖、黑芝麻粉、黑米粉、青稞粉、小米粉、花生酱、黑豆粉、微晶纤维素、冷凝胶、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、三聚磷酸钠、海藻酸钠、磷酸氢二钠、六偏磷酸钠、三氯蔗糖和食用香精。

使用检测方法A、B、C和国标GB5413.37-2010中第一法分别对X、Y、Z、W和V进行检测，检测的相对标准偏差如下表：

样品	方法A	方法B	方法C	国标
					X	4.37%	4.21%	4.96%	15.3%
Y	3.40%	3.14%	1.01%	5.76%
					Z	3.75%	3.81%	4.27%	11.2%
W	5.21%	3.17%	4.23%	8.70%
					V	4.46%	4.54%	3.79%	11.5%

由上表可以看出，使用本发明的方法检测市售的黑谷物牛奶、核桃早餐奶、奶特朱古力、早餐调制乳和谷物奶比使用国标GB5413.37-2010中第一法偏差更小。

使用检测方法A、B、C和国标GB5413.37-2010中第一法分别对X、Y、Z、W和V进行检测，黄曲霉毒素M1的加标量为0.5ng/mL，黄曲霉毒素B1的加标量为1ng/mL的回收率如下表：

样品	方法A	方法B	方法C	国标
					X	86.4%	87.7%	84.5%	37.1%
Y	90.1%	87.9%	92.7%	63.3%
					Z	85.4%	87.6%	88.1%	54.6%
W	91.7%	87.3%	88.1%	64.7%
					V	86.4%	87.4%	82.5%	52.9%

由上表可以看出，使用本发明的方法检测市售的黑谷物牛奶、核桃早餐奶、奶特朱古力、早餐调制乳和谷物奶比使用国标GB5413.37-2010中第一法回收率更高。

在不含黄曲霉毒素的核桃调制乳中添加黄曲霉毒素配置黄曲霉毒素阳性样品，黄曲霉毒素M1添加量为2.5ng/mL、黄曲霉毒素B1添加量为7.5ng/mL。准确称取黄曲霉毒素的阳性样品10.0g，分别使用（a）25mL乙腈、（b）25mL乙腈和甲醇，乙腈和甲醇的体积比1:1、（c）亚铁氰化钾（溶液浓度0.30g/mL）和乙酸锌（溶液浓度0.15g/mL）各1mL和（d）亚铁氰化钾（溶液浓度0.30g/mL）、乙酸锌（溶液浓度0.15g/mL）和甲醇分别为1mL、1mL和10mL四种提取液配方对黄曲霉毒素阳性样品中黄曲霉毒素进行提取。高速振荡提取2min，在5000转/分钟下离心5分钟。将上清液转移至鸡心瓶中。在45℃水浴中旋转蒸发至5mL并转移至50mL离心管中，用水洗涤鸡心瓶三次一并转移至离心管中，用水定容到50mL得到净化水溶液。将净化水溶液过黄曲霉毒素总量免疫亲和柱。用10mL水淋洗，弃去流出液。用6mL乙腈洗脱，收集洗脱液，洗脱液在氮吹仪下吹干，用乙腈水（乙腈比水的体积比为1:9）定容到1mL。涡旋混匀，过0.22μm的有机滤膜，用LC-MS/MS测定。结果如下表：

从上表可以得出（a）和（b）对黄曲霉毒素M1和B1提取回收率均在80%以上，回收率较高。

使用上述提取液（a）、（b）和（d）做进一步的沉淀效果和回收率的验证，在不含黄曲霉毒素的朱古力调制乳中添加黄曲霉毒素配置黄曲霉毒素阳性样品，黄曲霉毒素M1添加量为1.0ng/mL、黄曲霉毒素B1添加量为3.0ng/mL，进一步按照上述操作方法，结果如下表：

从上述测定结果可以得出，对小浓度的阳性样品,使用提取液（a）和（b）对黄曲霉毒素M1检测，回收率均能符合国标GB/T27404-2008要求。使用提取液(a)检测，对黄曲霉毒素B1的回收率偏低。使用提取液（d）对黄曲霉毒素M1和B1检测，结果均不符合要求。

在本文中，“示意性”表示“充当实例、例子或说明”，不应将在本文中被描述为“示意性”的任何实施方式解释为一种更优选的或更具优点的技术方案。

应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方案或变更，如特征的组合、分割或重复，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测调制乳中黄曲霉毒素的前处理方法，其特征在于，包括：

取待测的调制乳样品10克，加入20至30毫升提取液，得到混合液，所述提取液由乙腈和甲醇按体积比（9-1）:1混合而成；

将所述混合液振荡后于4500至6000转/分钟下离心5至10分钟，取离心后的上清液；以及

将所述上清液用黄曲霉毒素总量免疫亲和柱净化；其中，所述净化的步骤包括：

a、将所述上清液在40至48℃下旋转蒸发到体积1至5毫升，再加水定容到45至50毫升并混匀，得到待净化水溶液；

b、将所述待净化水溶液过黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，弃去流出液；

c、用6至10毫升水淋洗所述黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，弃去流出液；

d、用5至6毫升乙腈洗脱所述黄曲霉毒素总量免疫亲和柱，收集洗脱液；以及

e、将所述洗脱液于40至48℃下氮气吹干，再用乙腈水溶液或水溶解，得到待测液；所述乙腈水溶液中，乙腈的体积百分比含量不超过10%。

2.一种液相色谱质谱联用法检测调制乳中黄曲霉毒素的方法，其特征在于，包括：

通过权利要求1所述的前处理方法对待测的调制乳样品进行前处理；以及

使用液相色谱质谱联用法检测经过前处理的调制乳中的黄曲霉毒素。

3.如权利要求2所述的检测调制乳中黄曲霉毒素的方法，其中，所述液相色谱质谱联用法的质谱条件为：

电离方式是电喷雾电离、正离子；毛细管电压为3.5kV；锥孔电压为40V；离子源温度为120℃；锥孔反吹气流量为50L/h；脱溶剂气温度为350℃；脱溶剂气流量为500L/h；电子倍增电压为650V；扫描方式为多离子反应监测；黄曲霉毒素M1离子选择参数：母离子312.9，子离子240.7和284.6，碰撞能量是38和22，驻留时间是0.05分钟；以及黄曲霉毒素B1离子选择参数：母离子329.1，子离子259和273，碰撞能量是25和25，驻留时间是0.1分钟；

所述液相色谱质谱联用法的色谱条件为：

流动相流动速度：0.3mL/min；色谱柱柱温：40℃；试液温度：20℃；进样体积：10μ

L；流动相：A相0.1%甲酸溶液；B相乙腈溶液；梯度洗脱的梯度变化曲线为：

时间流动相A% 流动相B% 梯度变化曲线 0 min 68 32 —— 4.2 min 55 45 6 5.0 min 0 100 6 5.7 min 0 100 1 6.0 min 68 32 6