CN105368855B

CN105368855B - 植物细胞程序性死亡的调控因子花生类caspase-3基因及编码序列

Info

Publication number: CN105368855B
Application number: CN201510606264.6A
Authority: CN
Inventors: 詹洁; 何龙飞; 姚绍嫦; 黄文静; 潘春柳
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2015-09-22
Filing date: 2015-09-22
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2035-09-22
Also published as: CN105368855A

Abstract

本发明公开了一种植物细胞程序性死亡的调控因子花生类caspase‑3基因及编码序列。在铝诱导花生根尖发生PCD过程中，研究各类类caspase的活性变化，证实花生中存在花生类caspase，并确定其中与铝诱导PCD发生关系最密切的为花生类caspase‑3（caspase‑3‑like）。从花生根尖提取RNA，克隆到花生Ahcas‑3，其ORF为编码序列1068bp，编码355aa的cDNA序列。

Description

植物细胞程序性死亡的调控因子花生类caspase-3基因及编码序列

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种植物细胞程序性死亡的调控因子花生类caspase‐3基因及编码序列。

背景技术

铝是酸性土壤上作物生长的主要限制因子。连续施用含氨和氨化物的肥料、工业污染、酸雨和豆科植物的固氮作用，加剧了铝毒害。目前，世界耕地的40‐70％为酸性土壤，在我国约21％面积的土地属酸性土壤，分布遍及南方15个省区，总面积达2030万公顷。在环境污染日益严重，酸性土壤面积不断扩大的今天，铝毒害已成为世界性难题，加强植物耐铝机制研究有着重要的现实意义。

植物细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)是一种受基因控制、主动有序的细胞死亡过程，它普遍存在于植物发育及环境互作中，不仅是植物正常生长发育必需的，也是植物一种重要防卫反应，在适应逆境中有重要作用。有研究表明，逆境可以诱导植物PCD，如渗透胁迫、盐、热激、低温、缺氧、金属离子等。虽然植物PCD产生的信号因子还不清楚，但越来越多的证据表明，ROS、NO、Ca²⁺、乙烯等都是环境胁迫诱导植物PCD的重要信号分子。

我们通过显微、超微、荧光、DNA梯、TUNEL检测等技术手段也证实铝能够诱导花生根尖细胞PCD，且发现PCD发生与花生耐铝能力负相关(Zhan J,He H.2013.Aluminum‐induced programmed cell death promoted by AhSAG,a senescence‐associated genein Arachis hypoganea L.Plant Sci 210:108‐117)。用荧光技术研究植物铝毒害，结果表明铝通过与线粒体呼吸链复合体I和III的Fe‐S蛋白作用产生活性氧，导致线粒体肿胀和膜渗透性转换孔开放，随后释放的细胞色素c激活caspase‐3‐like蛋白酶诱导PCD的发生。可见，铝诱导PCD是客观存在的，但研究多停留在寻找充足的PCD证据层面，对铝诱导PCD的分子机制和调控等缺乏深入研究。

半胱氨酸蛋白酶(caspase)是动物细胞凋亡启动和执行阶段的关键调节因子。在细胞质中,通过Bax/Bcl‐2表达控制细胞色素c(cytochrome c,Cyt c)、线粒体膜间隙蛋白—核酸内切酶G(Endo G)、细胞凋亡诱导因子(AIF)、Smac/Diablo和Omi/HtrA2的释放,提高线粒体膜通透性，由caspase酶类通过水解天冬氨酸残基C末端肽键，激活下游caspase蛋白酶，促使具有caspase活性的凋亡小体形成，分解细胞内相关底物蛋白，导致细胞结构和代谢发生变化，最后引起细胞凋亡(Reape T J，McCabe P F.2008.Apoptotic‐likeprogrammed cell death in plants.New Phytol 180：13‐26)。

Caspase是动物细胞凋亡调控的关键因子,不少学者将动物细胞凋亡的相关机制引入植物研究中。然而在已公布的植物基因组序列中，没有发现编码caspase的基因(Bonneau L，Ge Y.2008.What happened to plant caspases？J Exp Bot 59(3)：491‐499)，但在植物HR和其他胁迫诱导PCD过程中已检测到与caspase类似的酶活性，说明植物PCD中存在具有类似caspase酶活性的其他蛋白酶。因此，植物caspase活性被称为类caspase活性(caspase‐like activities)。目前通常利用哺乳动物caspase家族成员所涉及的裂解位点为参考，人工合成的四肽作为底物，检测植物类caspase活性。根据底物的特点，发现在植物中主要存在YVADase(VPEs)、DEVDase(metacaspase)、IETDase(caspase)、LEHDase、LEVDase、TATDase、VEIDase、VKMDase(caspase)等类caspase活性，植物种类主要有烟草(Nicotiana benthamiana)(Kim M,Lim J H.2006.Mitochondria‐associatedhexokinases play a role in the control of programmed cell death in Nicotianabenthamiana.Plant Cell 18：2341‐2355)、罂粟(Papaver)(Bosch M,Franklin‐Tong VE.2007.Temporal and spatial activation of caspase‐like enzymes induced byself‐incompatibility in Papaver pollen.Proc Natl Acad Sci USA 104：18327‐18332)、大麦(Hordeum brevisubulatum)(Boren M,Hoglund A S.2006.Developmentregulation of VEIDase caspase‐like proteolytic activity in barley caryopsis.JExp Bot 57(14)：3747‐3753)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Kuroyanagi M,YamadaK.2005.Vacuolar processing enzyme is essential for mycotoxin‐induced celldeath in Arabidopsis thaliana.J Biol Chem 280：32914‐32920)、燕麦(Avena sativa)(Coffeen W C,Wolpert T J.2004.Purification and characterization of serineproteases that exhibit caspase‐like activity and are associated withprogrammed cell death in Avena sativa.Plant Cell 16：857‐873)、挪威云杉(Piceaabies)(Bozhkov P V,Filonova L H.2004.VEIDase is a principal caspase‐likeactivity involved in plant programmed cell death and essential for embryonicpattern formation.Cell Death Differ 11：175‐182)等，材料来源主要为叶肉组织、悬浮细胞、幼苗、叶子、花粉等。但在花生中类caspase至今尚无相关报告。

利用动物caspase活性抑制剂是分析植物是否存在与caspase功能相似的蛋白酶的常用方法。杆状病毒蛋白p35作为caspase抑制剂可以抑制多种因素诱导产生的植物PCD，如链革胞菌(Alternaria alternata f.sp.Lycopersici)毒素诱导的PCD、丁香假单胞菌致病变种(Pseudomonas syringae pv.Phaseolicola)和烟草花叶病毒(Tobacco mosaicvirus,TMV)侵染烟草细胞形成的HR。目前应用的抑制剂主要有BocD‐fmk、Ac‐DEVD‐CHO、Ac‐DEVD‐cmk、z‐DEVD‐fmk、Ac‐LEHD‐CHO、z‐VAD‐fmk、z‐VEID‐fmk、Ac‐YVAD‐CHO、Ac‐YVAD‐cmk、z‐YVAD‐fmk等，均能够抑制相关PCD的发生，如Ac‐DEVD‐CHO抑制罂粟自交不亲和诱导产生的PCD，紫外线诱导拟南芥叶肉细胞原生质体产生的PCD，罂粟花粉自交不亲和诱导产生的PCD；Ac‐DEVD‐cmk抑制白云杉种子的雌配子体细胞PCD；z‐VAD‐fmk抑制热击诱导番茄果实产生的PCD；Ac‐YVAD‐CHO抑制叶片组织再生引起的PCD中酶的活性；z‐YVAD‐fmk抑制热击诱导番茄果皮发生的PCD等。

值得注意的是，这些抑制剂并非对所有PCD都具有抑制作用，如Acetyl‐Asp‐Glu‐Val‐Asp‐aldehyde(Ac‐DEVD‐CHO)对TMV诱导的烟草HR没有抑制作用，而Acetyl‐Tyr‐Val‐Ala‐Asp‐aldehyde(Ac‐YVAD‐CHO)则可以抑制；Ac‐YVAD‐CHO不能抑制罂粟属花粉管细胞的细胞死亡，但是Ac‐DEVD‐CHO却具有这样的功能。

Caspase是细胞凋亡中起关键作用的一类半胱氨酸蛋白酶，在天冬氨酸位点与底物反应。caspase作为动物PCD的功能性成分，可改变或激活某些维持细胞完整性的蛋白，caspase蛋白家族一旦被激活后便不可逆的启动细胞程序性死亡的执行阶段。植物中虽然没有分离出caspase基因，但在正在死亡的植物细胞中用人工合成的caspase底物可以检测到caspase活性的升高。由于植物细胞程序性死亡形式存在多样性，以及与动物细胞凋亡存在明显差异，在近期的植物研究中，植物CLPs与动物caspase的关系越来越受到重视。但目前暂无类caspase参与铝诱导PCD的报告。

发明内容

本发明的目的：为了调控植物细胞对环境变化的适应力以及维持细胞内环境稳定和合成能力，寻找在逆境环境下花生发生细胞程序性死亡中活性最强的类caspase酶活，提供一种植物细胞程序性死亡的调控因子花生类caspase‐3基因及编码序列。

本发明是这样实现的：

一种植物细胞程序性死亡的调控因子花生类caspase‐3基因及编码序列，寻找在逆境环境下花生发生细胞程序性死亡中活性最强的类caspase酶为caspase‐3，并获得调控细胞程序性死亡的花生类caspase‐3基因Ahcas‐3及编码序列；从花生根尖提取RNA得到Ahcas‐3，其ORF的碱基序列为1068bp，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1为：

所述的从花生根尖提取RNA得到Ahcas‐3的cDNA序列编码355aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。SEQ ID NO.2为：

本发明试验中的花生耐铝品种99‐1507和铝敏感品种中花2号，是根据发明人在2008年3月在《中国油料作物学报》发表的《铝对花生根尖细胞形态结构的影响》中的试验方案获得。

本发明的有益效果：

本发明的在调控细胞程序性死亡中活性最强的类caspase‐3的基因Ahcas‐3，提供一种有助于调控植物细胞对环境变化的适应力以及维持细胞内环境稳定和合成能力的方法，为植物增产增收创造条件。

附图说明

图1：为99‐1507花生根尖在不同铝处理下各种类caspase的活性；a‐l分别代表显著性差异P<0.05。

图2：为中花2号根尖在不同铝处理下各种类caspase的活性；a‐l分别代表显著性差异P<0.05。

图3：为加入caspase‐3专属抑制剂后99‐1507和中花2号在不同处理下的类caspase‐3的活性；A‐C分别代表显著性差异P<0.01；a‐c分别代表显著性差异P<0.05。

图4：为加入caspase‐3专属抑制剂后99‐1507和中花2号在根长生长变化量。

图5：为加入caspase‐3专属抑制剂后99‐1507和中花2号在细胞死亡数的变化量。

图6：为加入caspase‐3专属抑制剂后99‐1507和中花2号在根尖铝含量的变化量。

图7：为加入caspase‐3专属抑制剂后99‐1507和中花2号在苏木精染色后的变化量。

图8：为caspase‐3专属抑制剂抑制99‐1507和中花2号的细胞程序性死亡的DAPI染色图；A‐D:99‐1507and E‐H:Zhonghua 2.A and E,0mM AlCl3；B and F,50mM DEVD；C andG,50mM DEVD+100mM AlCl₃；D and H,100mM AlCl₃。

图9：为caspase‐3专属抑制剂抑制99‐1507和中花2号的细胞程序性死亡的DNA图。

图10：为caspase‐3专属抑制剂抑制99‐1507和中花2号的细胞程序性死亡的TUNEL染色图；Caspase‐3专属抑制剂抑制99‐1507(A‐B,E‐H)和中花2号(C‐D,I‐L)的细胞程序性死亡的TUNEL染色图；A和C,负对照；B和D,正对照；E和I,0mM AlCl₃；F和J,50mM DEVD；G和K,50mM DEVD+100mM AlCl₃；H和L,100mM AlCl₃.白色箭头显示PCD细胞。

图11：为PCR扩增Ahcas‐3基因3’race电泳图谱。

图12：为PCR扩增Ahcas‐3基因5’race电泳图谱。

图13：为Ahcas‐3在NCBI上氨基酸序列同源性分析。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实施方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置3次重复实验，结果取平均值。

实施准备

1、所用花生品种：耐铝花生品种99‐1507和铝敏感品种中花2号。

2、将供试花生种子置于粗沙中26℃催芽4d，催好芽的花生去掉种皮，Hoagland营养液培养，每2d更换一次营养液。花生幼苗抽出第二片真叶后，在含有0.1mmol/L的CaCl₂(pH4.2‐4.3)的溶液中预处理24h。

3、选择100μmol/L铝处理0、4、8、12h，用荧光法检测2个花生样品中不同处理条件花生类caspase的活性表达情况。

4、用类caspase‐3的专属抑制剂DEVD在100mM铝处理8h条件下，检测2个花生样品的花生根长生长变化、根尖铝含量、根尖细胞死亡程度以及根尖苏木精染色的情况。

5、加入类caspase‐3的专属抑制剂DEVD，用DAPI染色、DNA Ladder和TUNEL在100mM铝处理8h条件下，检测2个品种花生根尖PCD的发生情况。

6、花生根尖RNA小量提取

花生根尖RNA小量提取用Trizol法，操作步骤如下：

(1)准备专用枪头和离心管，研钵、研钵棒和铁勺等器具，高温高压灭菌4h。

(2)在研钵中倒入液氮预冷，将－80℃保存备用的花生根尖约0.2g倒入研钵中，倒入足量液氮，同时用研钵棒轻轻挤压样品，待液氮还有少量剩余时，立刻迅速有力的研磨样品至白色细粉末状，重复3‐4次，液氮研磨时，不要让液氮挥发干净，以防止造成内源RNase对RNA的降解。

(3)研磨好样品转至预冷的离心管，立刻加入1mL预冷的Trizol试剂，上下剧烈振荡混匀，室温静置15min，直至明显分层为止。注意要选择合适的裂解液，并且量要多，裂解要充分。

(4)在12,000rpm离心5min后，吸取上清，移至新1.5mL离心管中，加入200μL氯仿，上下振荡，室温放置5min；再次用12,000rpm离心10min，小心吸取上层水相至新1.5mL离心管中。

(5)加入等体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，－20℃静置30min，12,000rpm，4℃离心15min，弃上清。

(6)用75％乙醇荡洗沉淀2～3次，温和振荡，悬浮沉淀，12,000rpm，离心5min，用枪头小心移去上清，晾干至透明状。

(7)用30μL DEPC‐H2O溶解沉淀，取2μL 1％进行琼脂糖电泳。检测合格的RNA样品可直接进行下步试验，或保存于－80℃中。

7、各步骤中所用到的引物，见表1。

表1：本研究所用的引物

实施例1：RACE法获得Ahcas‐3全长基因

1、cDNA的合成

根据不同的需要，进行反转录，得到不同的cDNA，见表2。

表2：Ahcas‐3 3’端和5’端cDNA的合成

2、3’端和5’端cDNA片段PCR扩增(50μL体系)

(1)3’Race(巢式PCR)

第一轮PCR：

反应体系采用冰上操作，具体操作条件见表3。

表3：3’Race第一轮PCR反应体系操作条件

反应系统	体积
		10×Buffer(含Mg<sup>2+</sup>)	5μL
dNTP(2.5mM)	4μL
		P1：Ahcas‐3 3′上游1(10pM)	2μL
P2：Ahcas‐3 3′下游(10pM)	2μL
		3’race反转录产物稀释5倍	1μL
Ex‐Taq	1μL
		ddH2O	35μL
total	50μL

反应条件：

具体反应操作条件见表4。

表4：3’Race第一轮PCR反应操作条件

周期

温度和时间

1	94℃，5min
		25	94℃，40s；56℃，30s；72℃，1min
1	72℃，10min

Nested PCR^2nd扩增：具体操作条件见表5。

表5：3’Race的Nested PCR^2nd扩增反应体系操作条件

反应系统	体积
		10×Buffer(含Mg<sup>2+</sup>)	5μL
dNTP(2.5mM)	4μL
		P1：Ahcas‐3 3′上游2(10pM)	2μL
P2：Ahcas‐3 3′下游(10pM)	2μL
		第一轮PCR反应液	1μL
Ex‐Taq	1μL
		ddH2O	35μL
total	50μL

反应条件：

具体反应操作条件见表6。

表6：3’Race的Nested PCR^2nd扩增反应操作条件

周期	温度和时间
		1	94℃，5min
25	94℃，40s；56℃，30s；72℃，1min
		1	72℃，10min

检测：取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，出现目的片断

(2)5’Race

使用RACE 5’/3’Kit(Cat.Nos.634859)对Total RNA进行反转录合成cDNA。

PCR扩增：使用TaKaRa Tks Gflex DNAPolymerase(Code No.R060A)进行PCR扩增。

ⅰ、第一轮PCR

反应体系：

采用冰上操作，具体操作条件见表7。

表7：5’Race第一轮PCR反应体系操作条件

反应体系	体积
		2×Gflex PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>,dNTP plus)	25μL
Tks Gflex DNA Polymerase(1.25units/ul)	1μL
		UPM(10×)Primer(试剂盒提供)	5μL
Ahcas‐3 5’上游1(10μM)	2μL
		反转录反应液	2.5μL
ddH<sub>2</sub>O	15.5μL
		total	50μL

反应条件：

具体反应操作条件见表8。

表8：5’Race第一轮PCR反应操作条件

周期	温度和时间
		1	94℃，1min
30	98℃，10s；55℃，15s；68℃，1min

ⅱ、Nested PCR^2nd扩增

反应体系：

采用冰上操作，具体操作条件见表9。

表9：5’Race的Nested PCR^2nd扩增反应体系操作条件

反应体系	体积
		2×Gflex PCR Buffer(Mg<sup>2+</sup>,dNTP plus)	25μL
Tks Gflex DNA Polymerase(1.25units/ul)	1μL
		UPS(10×)Primer(试剂盒提供)	1μL
Ahcas‐35’上游2(10μM)	1μL

第一轮PCR反应液	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	21μL
total	50μL

反应条件：

具体反应操作条件见表10。

表10：5’Race的Nested PCR^2nd扩增反应操作条件

周期	温度和时间
		1	94℃，1min
35	98℃，10s；55℃，15s；68℃，1min

检测：取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，出现目的片断。

(3)测序

使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(CodeNo.9762)切胶回收PCR产物，连接、转化、质粒小提、酶切验证、穿刺、测序，使用生物信息Vector NTI8.0软件、NCBI进行序列分析。

3、Ahcas‐3全长基因PCR扩增验证

将Ahcas‐3基因的3’和5’片断的测序结果进行分析，根据重叠区拼接全长cDNA。为了反映ORF的真实性，提高PCR产物保真度，从已知的非OFR区设计引物，用高保真酶再次扩增，所用模板应来自同一个转录本，保证序列的可靠性。

(1)RT‐PCR(50μL体系)

反应体系：

采用冰上操作，具体操作条件见表11。

表11：Ahcas‐3全长基因RT‐PCR反应体系操作条件

反应系统	体积
		10×Buffer(含Mg<sup>2+</sup>)	5μL
dNTP(2.5mM)	4μL
		P1：Ahcas‐3全长上(10μM)	2μL

P2：Ahcas‐3全长下(10μM)	2μL
		OligoT18反转录产物原液	1μL
Ex‐Taq	0.25μL
		ddH<sub>2</sub>O	35.75μL
total	50μL

反应条件：

具体反应操作条件见表12。

表12：Ahcas‐3全长基因RT‐PCR反应操作条件

周期	温度和时间
		1	94℃，5min
35	94℃，30s；53℃，30s；72℃，45s
		1	72℃，10min

检测：1％琼脂糖电泳，有目的片断出现。

(2)测序

将DNA片断的回收，连接、转化、质粒小提、酶切验证、穿刺、华大基因测序，使用生物信息Vector NTI 8.0软件、NCBI进行序列分析。测序获得的结果：

基因序列：

GCAAGTAGAAGAGCAAGATGCATGCAGTGTGGAAGGCCTGTGGTGGTGCCAATGCAAGCCTATAATGTTTACATTCTGTGTTCTGGCTGCCAAGGCTATCCACAAGTCCAACCCAACTACCCTTTACTCAACAGCACTCCTTCCTTCATCAATTTTGCTCCTGGATTTTCGAGGCCTTACCCGCTGCCGCCTTCTCCTGCTTCTGCATATGGTAACAAGAGAGCTGTGTTGTTTGGTATTAGCTATGCTAAGCAAAATAACAGGATCAAAGGCGCTGTGAATGATGCTCACTGCATGAAGTACTTTCTCATTGACAAGTTGGGTTTCCCTACTGATTCCATTCGCATGCTCACAGATGATCCAGAAGAGAGAAACCCTCTAAGAATTCCAACAATGCACAACATGAGAATGGCGATGAGGTGGTTGGTGGAAGGCTGCCGGGCAGGGGACTCATTGGTGTTCTACTACTCCGGACACGGATCGAGGGTAGTGGACCGTAACATGGATGAGGTTGATGGGTATGATGAAGCAATCTGCCCTGTTGATTATGAGCATGAGGGCAAGATAATTGATGATGAGATCAATGCAACAATCGTCCGCCCTCTGCCACGTGGCGCCAAGCTCCACGCCCTTGTTGATACATGCTTTAGCGGCACT GTTCTTGATTTACCTTTCATGTGCAGGATGAACCGAAAAGGTTATTATGGATGGGAAGATCACAGAAGCCGGAGAGGTGCATACAAAGGCACAAATGGAGGAGTAGCTGTTTGCATTTCTGCTTGTGACGATGATGGAAGTGCGGCAGATACATCCGCATTTAGCGGCATGGAAAGTAGTGGAGCGTTGACTTACAGTTTCATTCAAGCCATGCAAGATGAAGCTAAACTGACTTATGGCCGCTTGCTGAATGCTATGCGCTCCACCATCCGCGACGCTAAGGAAGGACAGTTTGGTCCTAACTACGAAGATTATGCCGCCATGGAATTTCGCCTGCAATATGCTCATGAGCCACAGATATTTTCATTTGAAAAGTTTGATATTTATTCAAAGCCTATTTTAATG

氨基酸序列：

MASRRARCMQCGRPVVVPMQAYNVYILCSGCQGYPQVQPNYPLLNSTPSFINFAPGFSRPYPLPPSPASAYGNKRAVLFGISYAKQNNRIKGAVNDAHCMKYFLIDKLGFPTDSIRMLTDDPEERNPLRIPTMHNMRMAMRWLVEGCRAGDSLVFYYSGHGSRVVDRNMDEVDGYDEAICPVDYEHEGKIIDDEINATIVRPLPRGAKLHALVDTCFSGTVLDLPFMCRMNRKGYYGWEDHRSRRGAYKGTNGGVAVCISACDDDGSAADTSAFSGMESSGALTYSFIQAMQDEAKLTYGRLLNAMRSTIRDAKEGQFGPNYEDYAAMEFRLQYAHEPQIFSFEKFDIYSKPILM。

Claims

1.一种植物细胞程序性死亡的调控因子花生类caspase-3基因，其特征在于，所述基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。